Summary
Este protocolo describe un procedimiento quirúrgico para el establecimiento de una fractura diafisaria en el fémur de ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular, para estudios de cicatrización de fracturas.
Abstract
Los huesos tienen una importante capacidad regenerativa. Sin embargo, la cicatrización de la fractura es un proceso complejo y, dependiendo de la gravedad de las lesiones y de la edad y el estado de salud general del paciente, pueden producirse fallas, lo que lleva a un retraso en la unión o a la falta de unión. Debido al creciente número de fracturas resultantes de traumatismos de alta energía y envejecimiento, se necesita urgentemente el desarrollo de estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar la reparación ósea basadas en la combinación de células madre esqueléticas/mesenquimales/estromales y biomateriales biomiméticos. Con este fin, el uso de modelos animales fiables es fundamental para comprender mejor los mecanismos celulares y moleculares clave que determinan los resultados de curación. De todos los modelos, el ratón es el modelo de investigación preferido porque ofrece una amplia variedad de cepas transgénicas y reactivos para el análisis experimental. Sin embargo, el establecimiento de fracturas en ratones puede ser técnicamente difícil debido a su pequeño tamaño. Por lo tanto, este artículo tiene como objetivo demostrar los procedimientos para el establecimiento quirúrgico de una fractura de fémur diafisario en ratones, que se estabiliza con un alambre intramedular y se asemeja al proceso de reparación ósea más común, a través de la formación de callos cartilaginosos.
Introduction
El esqueleto es un órgano vital y funcionalmente versátil. Los huesos del esqueleto permiten la postura y el movimiento del cuerpo, protegen los órganos internos, producen hormonas que integran las respuestas fisiológicas y son el sitio de hematopoyesis y almacenamiento de minerales1. Si se fracturan, los huesos tienen una notable capacidad para regenerarse y restaurar completamente su forma y función previas a la lesión. El proceso de cicatrización comienza con la formación de un hematoma y una respuesta inflamatoria, que induce la activación y condensación de las células madre/progenitoras esqueléticas del periostio, el endosteo y la médula ósea y su posterior diferenciación para formar el callo cartilaginoso blando. El puente de los extremos fracturados se produce a través de un proceso que se asemeja a la formación de hueso endocondral, en el que el andamio cartilaginoso se expande y luego se mineraliza, formando el callo óseo duro. Finalmente, el callo duro es remodelado gradualmente por osteoclastos y osteoblastos para restaurar la estructura ósea original 2,3.
Aunque el proceso de curación de la fractura es bastante robusto, implica una suma intrincada de eventos y está significativamente influenciado por varios factores individuales, incluido el estado de salud general, la edad y el sexo del paciente, así como factores de lesión, como el modo de estabilización mecánica del hueso fracturado, la aparición de infección y la gravedad de la lesión de los tejidos blandoscircundantes. 5,6. Por lo tanto, los fracasos son comunes, lo que lleva al desarrollo de pseudoartrosis, lo que impacta en gran medida en la rehabilitación del paciente y en la calidad de vida 7,8. Debido al creciente número de fracturas como resultado de traumatismos de alta energía y envejecimiento, así como a los altos costos de los tratamientos, las fracturas pseudoartrosas se han convertido en una carga para los sistemas de salud de todo el mundo 9,10. Esta carga creciente pone de manifiesto la necesidad urgente de estrategias terapéuticas innovadoras para mejorar la reparación ósea11,12 basadas en la combinación de células madre esqueléticas/mesenquimales y biomateriales biomiméticos 13,14.
En la búsqueda de este objetivo, los modelos animales han sido ampliamente utilizados en estudios que tienen como objetivo comprender la biología fundamental de los mecanismos de cicatrización de fracturas y en estudios preclínicos de prueba de concepto con el objetivo de diseñar nuevas estrategias terapéuticas para promover la reparación ósea 15,16,17. Los modelos de animales pequeños, como el ratón, son excelentes para los estudios de cicatrización de fracturas debido a la amplia disponibilidad de cepas y reactivos modificados genéticamente para análisis experimentales y sus bajos costos de mantenimiento. Además, los ratones tienen un curso de tiempo de curación rápido, lo que permite el análisis temporal de todas las etapas del proceso de reparación15. Sin embargo, el pequeño tamaño del animal puede plantear desafíos para la producción quirúrgica de fracturas con modos de fijación similares a los aplicados en humanos. Este protocolo describe un modelo simple y de bajo costo de cicatrización de fracturas en ratones utilizando una osteotomía femoral abierta estabilizada con un alambre intramedular, que se asemeja al proceso de reparación ósea más común, a través de la formación de callos cartilaginosos, y puede ser utilizado tanto en investigaciones básicas como traslacionales en las que se requiere acceso al sitio de la fractura.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Federal de Río de Janeiro (Protocolo Número 101/21). En este estudio se utilizaron ratones machos Balb/c de 10-12 semanas de edad (25-30 g de peso corporal). El procedimiento quirúrgico dura aproximadamente 15-20 minutos por ratón. Antes de cada procedimiento, los instrumentos requeridos (enumerados en la Tabla de Materiales) deben organizarse sobre un campo quirúrgico estéril que cubra la mesa de operaciones (Figura 1A). Los instrumentos quirúrgicos metálicos deben esterilizarse en autoclave en sobres autosellantes a 123 °C durante 30 min. Los artículos desechables, como agujas y gasas, deben adquirirse estériles.
1. Preparación animal
- Anestesiar al ratón y realizar analgesia de acuerdo con el régimen recomendado por el veterinario aprobado por el programa institucional de cuidado y uso de animales.
NOTA: Si está disponible, preferiblemente se debe realizar anestesia inhalatoria. Una descripción del protocolo para la anestesia inhalatoria se puede encontrar en el relato de Ewald et al.18. Sin embargo, si la fractura se produce para estudios de osteoinmunología, este tipo de anestesia debe ser evitada, ya que la evidencia muestra que varios anestésicos volátiles, incluido el isoflurano, afectan la actividad de las células inmunes tanto innatas como adaptativas19,20. - Una vez que el ratón esté inmóvil, afeitar la pierna izquierda y luego transferirla a la mesa quirúrgica sobre una almohadilla térmica tibia (ver Tabla de materiales) a 37 °C cubierta con un paño quirúrgico estéril.
- Realice un lavado antiséptico de la zona de la incisión frotando la piel con una esponja de povidona yodada al 10%. La desinfección debe comenzar a lo largo de la línea de incisión y extenderse hacia afuera en un patrón circular. Seque el área frotada con gasas estériles, lávela con etanol al 70% y vuelva a secar con una gasa estéril. Repita este procedimiento tres veces.
- Coloque el ratón en la posición de decúbito lateral derecho e inmovilice las patas con cinta quirúrgica (Figura 1C).
- Coloque el ratón de modo que solo se vea la región de la incisión (Figura 1D).
2. Procedimiento quirúrgico
- Durante el procedimiento quirúrgico, verifique constantemente que el ratón esté respirando y proporciónele gotas para los ojos para evitar la sequedad y evitar que el ratón se quede ciego.
NOTA: Todo el procedimiento quirúrgico suele durar ~15-20 minutos cuando lo realiza un cirujano capacitado. Por lo tanto, aplicar las gotas para los ojos una vez al comienzo del procedimiento debería ser suficiente. Si el procedimiento comienza a ser más largo, se pueden realizar aplicaciones adicionales siempre que se identifique que los ojos comienzan a secarse. - Antes de proceder a la incisión, evalúe la profundidad anestésica pellizcando la cola para comprobar el reflejo de respuesta al dolor e inspeccionando visualmente la frecuencia respiratoria (contando el número de movimientos torácicos por minuto)21. Bajo anestesia óptima, el ratón no debe responder a un pellizco de cola, y la frecuencia respiratoria debe ser de alrededor de 55-65 respiraciones/min21.
- Realizar una incisión parapatelar lateral cutánea de 1 cm con una hoja de bisturí (Número 11, ver Tabla de Materiales), comenzando a nivel de la tuberosidad tibial y extendiéndose hasta el nivel de la rótula y luego, a igual distancia, hacia el fémur distal (Figura 1E).
- Con unas tijeras de punta roma, diseccione la fascia subcutánea alrededor de la línea de incisión para exponer la fascia lata, el vasto lateral y los músculos del bíceps femoral22.
- Con la hoja de bisturí número 11, realizar otra incisión en la fascia lata similar a la realizada en la piel, comenzando a nivel de la tuberosidad tibial y recorriendo la aponeurosis del bíceps femoral hasta el nivel del fémur distal, para abrir la cápsula articular y acceder a la articulación de la rodilla (Figura 1F, G).
- Realice una luxación medial de la rótula colocando la punta de una pinza recta dentada de precisión (ver Tabla de Materiales) debajo de ella y empujándola hacia un lado junto con los ligamentos rotuliano y cuádriceps, exponiendo así los cóndilos del fémur (Figura 1H).
- Sujetando el fémur con una pinza de punta dentada, flexionar la rodilla a 90° y perforar manualmente el canal intramedular del fémur a través de la fosa intercondílea con una aguja hipodérmica de 26 G (Figura 1I, J).
- Manteniendo la rodilla flexionada a 90°, inserte un segmento de 1,0 cm de un alambre de varilla de acero inoxidable de 0,016 pulgadas (0,40 mm) (Figura 1K, inserto) (ver Tabla de Materiales) a través de la abertura en el canal medular del fémur hacia el trocánter mayor (Figura 1K).
NOTA: Mantener la rodilla flexionada a 90° es crucial para la correcta inserción del alambre en el canal medular. Si no lo hace, el alambre se extravasará del hueso y de las lesiones de los tejidos blandos circundantes. - Ajuste la extremidad distal predoblada del alambre con una pinza de punta dentada recta para fijarlo firmemente en el cóndilo lateral (Figura 1L). Además de fijar el alambre en su lugar, la extremidad doblada facilitará la extracción postmortem del alambre.
- Separe los músculos del vasto lateral y del bíceps femoral mediante una disección del extremo romo con una pinza de punta dentada para acceder a la diáfisis distal del fémur (Figura 1M).
- Inserte una tijera de disección alrededor de la diáfisis del fémur en un ángulo de aproximadamente 90° y realice suavemente una osteotomía cortical completa (Figura 1N).
NOTA: Los fémures de los ratones se cortan fácilmente. Abstenerse de aplicar una fuerza excesiva durante la osteotomía para evitar la flexión del alambre intramedular y la trituración extensa de la fractura. - Vuelva a colocar los músculos y la rótula empujando la punta de una pinza recta dentada de punta de precisión sobre la región del cóndilo.
- Cerrar la fascia muscular con una sutura reabsorbible 6-0 y luego la piel con una sutura de nylon 6-0 (ver Tabla de Materiales), ambas de forma simple e interrumpida (Figura 1O).
- Transfiera el ratón a una jaula limpia individual para su recuperación. Una vez despierto, el ratón debe ser capaz de moverse libremente con una carga de peso sin restricciones.
- En los días siguientes a la cirugía, realice analgesia de acuerdo con el régimen recomendado por el veterinario aprobado por el programa institucional de cuidado y uso de animales.
3. Imágenes de rayos X
- Anestesiar el ratón como se describe en el paso 1.1.
NOTA: Si la radiografía se realiza inmediatamente después del procedimiento quirúrgico y el ratón todavía está bajo anestesia óptima (paso 2.2), no es necesario realizar este paso. - Para obtener una vista lateral limpia del fémur fracturado, coloque el ratón en la posición de decúbito dorsal y tire ligeramente de la extremidad posterior operada hacia un lado.
- Inmovilizar las patas con cinta quirúrgica.
- Realizar imágenes radiográficas de acuerdo con el protocolo del equipo disponible.
NOTA: Para este estudio se utilizó un generador digital de rayos X dental con los siguientes parámetros: tensión de 70 kVp, corriente de 7 mA y tiempo de exposición de 0,2 s.
4. Procesamiento histológico y tinción de H&E
- Aplicar la eutanasia a los ratones con una sobredosis intraperitoneal de anestésicos (consulte el régimen recomendado por el veterinario aprobado por el Programa Institucional de Cuidado y Uso de Animales). Después de verificar la profundidad de la anestesia con un pellizco en la cola, realice la luxación cervical. A continuación, recoja el hueso fracturado, elimine el exceso de tejido muscular circundante23 y fije el hueso en una solución de formalina tamponada al 10% (pH 7,4) durante 3 días.
- Coloque las muestras óseas en casetes histológicos marcados (consulte la Tabla de materiales) y sumérjalas en EDTA al 10% en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4, durante 14 días para su descalcificación. Cambie la solución de descalcificación dos veces por semana.
- Deshidratar las muestras en una serie de soluciones de concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) durante 1 h cada una.
- Limpie las muestras en dos baños secuenciales de xileno durante 30 minutos cada uno.
- Para la infiltración de cera, sumergir las muestras en dos baños de parafina secuenciales a 60 °C durante 30 min. A continuación, incruste las muestras en bloques para seccionar24.
NOTA: Para ver mejor el callo, incruste el hueso con su eje largo en posición horizontal para permitir cortes longitudinales. - Cortar el tejido en secciones de 4 μm de grosor con un micrótomo (ver Tabla de Materiales).
- Flotar las secciones en un baño de agua a 56 °C y montar las secciones en portaobjetos histológicos (ver Tabla de Materiales).
- Para la tinción de H&E, desparafinar los portaobjetos en tres baños secuenciales de xileno durante 5 min, y rehidratar el tejido en una serie de soluciones de concentraciones decrecientes de etanol (95%, 80% y 70%) durante 5 min.
- Enjuague los portaobjetos con agua del grifo durante 30 s, tiña los portaobjetos con hematoxilina Harris (ver Tabla de materiales) durante 6 minutos y enjuáguelos con agua del grifo durante otros 30 s.
- Sumergir los portaobjetos en ácido clorhídrico al 1% en etanol durante 30 s y luego en etanol al 70% durante 30 s.
- Manchar con eosina (ver Tabla de materiales) durante 2 min, y lavar con agua del grifo durante 30 s.
- Deshidratar los portaobjetos con etanol (70%, 80% y 95% durante 5 min) y clarificar con dos baños de xileno durante 5 min cada uno.
- Para el montaje, gotee una o dos gotas de medio de montaje (consulte la Tabla de materiales) en cada portaobjetos y cubra el portaobjetos con un cubreobjetos limpio.
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Representative Results
La forma más sencilla e inmediata de evaluar el éxito del procedimiento quirúrgico en la producción de la fractura es la radiografía. Las radiografías se pueden realizar inmediatamente después de la cirugía, con el ratón aún bajo anestesia, y posteriormente 7 días, 14 días y 21 días después de la fractura para evaluar la formación y progresión del callo. Los patrones de fractura aceptables son aquellos en los que las cortezas están completamente rotas, los alambres están colocados correctamente dentro del canal medular y las líneas de fractura son transversales (con un ángulo de 90° con respecto al eje del hueso), oblicuas (patrón curvo o inclinado sin desplazamiento del fragmento) u oblicuas cortas (alrededor de 30° con respecto al eje del hueso) (Figura 2A-D). Estos patrones son aceptables porque todos progresarán hasta repararse a través de la formación de hueso endocondral (es decir, con formación de callos) si los fragmentos óseos se alinean correctamente (se reducen), logrando así el objetivo principal del modelo. Por lo tanto, las fracturas inaceptables son solo aquellas con una trituración extensa (múltiples fragmentos óseos pequeños), con acortamiento de la extremidad como consecuencia de una mala alineación y con alambres mal colocados (Figura 3). Los animales con patrones de fractura inaceptables deben ser excluidos del estudio. Con el tiempo, se debe observar un callo robusto y visible en el sitio de la fractura (Figura 4).
Además, se puede realizar un examen histológico a los 7 días, 14 días y 21 días después de la fractura para evaluar la neoformación de tejido dentro del área fracturada. Como la fijación con alambres intramedulares permite un cierto grado de movimiento de los fragmentos óseos, el proceso regenerativo sigue el mecanismo endocondral de osificación, en el que se observan áreas robustas de cartílago hialino alrededor de la línea de fractura en el día 7 (Figura 5A,B). En el día 14, se observan frentes de osificación alrededor del área del cartílago, formando hueso trabecular y cavidades llenas de médula ósea reconstituida (Figura 5C, D). Finalmente, en el día 21, las áreas de cartílago son reemplazadas casi por completo por hueso trabecular, lo que indica un puente óseo exitoso (Figura 5E, F) y la validez del modelo para estudios de cicatrización de fracturas.
Figura 1: Fotomicrografías que ilustran los pasos del procedimiento quirúrgico para producir fracturas diafisarias de fémur fijadas con un alambre intramedular en el ratón. (A) Organización de los instrumentos quirúrgicos estériles en la mesa de operaciones. (B) Inyección intraperitoneal de los anestésicos. (C) Colocación del ratón en la posición de decúbito lateral e inmovilización de las patas. (D) Cubrir el ratón, dejando expuesta solo la zona que se va a operar. (E) La incisión parapatelar lateral cutánea. (F,G) Vistas de la incisión de la fascia lata. (H) Luxación medial de la rótula, exponiendo la región del cóndilo femoral. (I) Colocación de la aguja en la fosa intercondílea. (J) Perforación del canal medular femoral. (K) Inserción del alambre intramedular a través de la abertura femoral. (L) Ajuste de la extremidad doblada del alambre en el cóndilo lateral. (M) Separación roma de los músculos circundantes. (N) Osteotomía femoral cortical completa. (O) Cierre de los tejidos blandos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Radiografías representativas de patrones de fractura aceptables. (A,B) Fracturas diafisarias transversales (las líneas de fractura están en un ángulo de 90° con respecto al eje del hueso). (C) Fractura oblicua corta (la línea de fractura es inferior a 30° con respecto al eje del hueso). (D) Fractura fragmentaria reducible (se observan pocos fragmentos pequeños de hueso, pero se mantiene la alineación anatómica del hueso). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Radiografías representativas de alambres colocados incorrectamente. (A) En este ratón, el alambre no está dentro del canal medular del fragmento proximal del fémur, lo que resulta en una fijación incorrecta del hueso fracturado. (B) En este caso, el alambre no pasó a través de ningún fragmento de hueso, y el hueso fracturado está completamente desalineado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Callo visible en el sitio de la fractura. Radiografías representativas de callos de fractura en (A) día 14 y (B) día 21 después de la cirugía, mostrando que el proceso regenerativo del modelo sigue la vía indirecta (endocondral). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis histológico de las callosidades de fractura. Imágenes representativas de huesos fracturados en (A,B) día 7, (C,D) día 14 y (E,F) día 21 después de la cirugía teñidos con H & E. Obsérvese la evolución del callo; el callo se presenta inicialmente con extensas áreas de cartílago hialino alrededor de la línea de fractura (inserto en A, magnificado en B), estas áreas sirven como plantillas para la formación de hueso trabecular (inserto en C, magnificado en D), y el proceso culmina con el reemplazo completo del cartílago por hueso y, por lo tanto, el puente óseo (insertar en E, magnificado en F). Barras de escala: (A,C,D) 500 μm; (B,D,F) 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
A medida que aumenta el número de fracturas en todo el mundo 9,10,25, los tratamientos innovadores para la pseudoartrosis son cada vez más urgentes. Dado que la cicatrización de fracturas implica una suma compleja y estrechamente orquestada de eventos que ocurren a lo largo de una larga escala de tiempo3, el uso de modelos animales válidos es fundamental para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos que determinan el éxito de la reparación ósea y para seleccionar fármacos y protocolos terapéuticos eficaces16,17.
En el ratón, tanto el fémur como la tibia se pueden utilizar para estudios de curación de fracturas de huesos largos. En este modelo, se eligió el fémur en lugar de la tibia porque es un hueso recto con un diámetro mayor y una mejor cobertura de tejidos blandos. Por otro lado, la diáfisis de la tibia del ratón es curvada y su calibre disminuye progresivamente a lo largo del extremo distal, lo que complica la inserción de dispositivos de fijación intramedular26. Por lo tanto, las características del fémur lo hacen ideal para los modelos en los que se pretende la fijación intramedular. En cuanto al sexo, se utilizaron ratones machos, ya que existe evidencia de que los machos muestran una cicatrización más rápida de las fracturas con una formación de callos cartilaginosos más prominente en comparación con las hembras27. Sin embargo, si es necesario, la técnica se puede adaptar fácilmente a las mujeres simplemente ajustando el tamaño del alambre intramedular para que se ajuste a la longitud ligeramente más pequeña del fémur femenino.
En comparación con los modelos de fractura cerrada que hacen uso del mecanismo de flexión de tres puntos con la guillotina28, el modelo de cirugía abierta descrito aquí también es ventajoso porque expone el sitio de la fractura, lo que permite al investigador ver visualmente la fractura que se está produciendo. Esta visualización ayuda a evitar errores técnicos que dan lugar a los siguientes patrones de fractura inaceptables: desplazamiento severo de fragmentos, que no permite la realineación anatómica del hueso (fracturas no reducibles); fragmentación extensa del hueso en varios pedazos pequeños (conminución), una condición que puede perjudicar el proceso de reparación; y/o la extravío de los dispositivos de fijación. Como la fractura es causada por una osteotomía suave en este modelo, generalmente no se observa un desplazamiento extenso de los fragmentos y/o una disminución.
Sin embargo, la técnica es limitada en el sentido de que requiere mayores habilidades quirúrgicas técnicas y conocimiento de la anatomía del ratón que otros métodos. Además, el pequeño tamaño del ratón hace que la manipulación sea más complicada en comparación con las ratas o los modelos animales grandes. Una vez superadas estas limitaciones con el entrenamiento, la tasa de éxito en la producción de fracturas aceptables es de casi el 100%, lo que reduce el número de extracciones de animales del estudio.
Además, el modelo de fractura de cirugía abierta permite la aplicación local de agentes terapéuticos, como células madre/progenitoras, biomateriales y/o fármacos, que no serían posibles de aplicar mediante la administración percutánea o sistémica26. Por último, la fijación con dispositivos intramedulares es más fácil, más barata y más personalizable que con dispositivos de placa y externos e imita la estrategia clínica más utilizada para el tratamiento de las fracturas de huesos largos29. Por lo tanto, el modelo aquí descrito representa un modelo de bajo coste para el estudio de la cicatrización de fracturas, tanto en entornos básicos como traslacionales, por lo que este estudio contribuye no solo a un mayor conocimiento de la biología de la cicatrización de fracturas, sino también al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para la reparación ósea.
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Disclosures
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Fundación Carlos Chagas Filho de Apoyo a la Investigación del Estado de Río de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | - | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid - 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 - 74 - 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
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