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Biology

चूहों में एक डायफिसियल फीमर फ्रैक्चर मॉडल की स्थापना

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64766
Automatic Translation
*1, *2, 3
1Postgraduate Program in Biological Sciences – Biophysics, Institute of Biophysics Carlos Chagas Filho, Federal University of Rio de Janeiro, 2Postgraduate Program in Surgical Sciences, Faculty of Medicine, Federal University of Rio de Janeiro, 3Institute of Biomedical Sciences, Federal University of Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल चूहों की फीमर में एक डायफिसियल फ्रैक्चर की स्थापना के लिए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन करता है, जिसे फ्रैक्चर हीलिंग अध्ययन के लिए इंट्रामेडुलरी तार के साथ स्थिर किया जाता है।

Abstract

हड्डियों में एक महत्वपूर्ण पुनर्योजी क्षमता होती है। हालांकि, फ्रैक्चर उपचार एक जटिल प्रक्रिया है, और घावों की गंभीरता और रोगी की उम्र और समग्र स्वास्थ्य स्थिति के आधार पर, विफलताएं हो सकती हैं, जिससे संघ या गैर-संघ में देरी हो सकती है। उच्च-ऊर्जा आघात और उम्र बढ़ने के परिणामस्वरूप फ्रैक्चर की बढ़ती संख्या के कारण, कंकाल / मेसेनकाइमल स्टेम / स्ट्रोमल कोशिकाओं और बायोमिमेटिक बायोमैटेरियल्स के संयोजन के आधार पर हड्डी की मरम्मत में सुधार के लिए अभिनव चिकित्सीय रणनीतियों के विकास की तत्काल आवश्यकता है। यह अंत करने के लिए, विश्वसनीय पशु मॉडल का उपयोग प्रमुख सेलुलर और आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए मौलिक है जो उपचार परिणामों को निर्धारित करता है। सभी मॉडलों में से, माउस पसंदीदा अनुसंधान मॉडल है क्योंकि यह प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए विभिन्न प्रकार के ट्रांसजेनिक उपभेदों और अभिकर्मकों की पेशकश करता है। हालांकि, चूहों में फ्रैक्चर की स्थापना उनके छोटे आकार के कारण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकती है। इसलिए, इस लेख का उद्देश्य चूहों में एक डायफिसियल फीमर फ्रैक्चर की सर्जिकल स्थापना के लिए प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करना है, जो एक इंट्रामेडुलरी तार के साथ स्थिर होता है और कार्टिलाजिनस कैलस गठन के माध्यम से सबसे आम हड्डी की मरम्मत प्रक्रिया जैसा दिखता है।

Introduction

कंकाल एक महत्वपूर्ण और कार्यात्मक रूप से बहुमुखी अंग है। कंकाल की हड्डियां शरीर की मुद्रा और आंदोलन को सक्षम करती हैं, आंतरिक अंगों की रक्षा करती हैं, हार्मोन का उत्पादन करती हैं जो शारीरिक प्रतिक्रियाओं को एकीकृत करती हैं, और हेमटोपोइजिस और खनिज भंडारणकी साइट हैं। यदि फ्रैक्चर होता है, तो हड्डियों में पुन: उत्पन्न करने और उनके पूर्व-चोट रूप और कार्य को पूरी तरह से बहाल करने की उल्लेखनीय क्षमता होती है। उपचार प्रक्रिया एक हेमेटोमा और एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के गठन से शुरू होती है, जो पेरीओस्टियम, एंडोस्टेम और अस्थि मज्जा से कंकाल स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं के सक्रियण और संघनन और नरम कार्टिलाजिनस कैलस बनाने के लिए उनके बाद के भेदभाव को प्रेरित करती है। खंडित सिरों का ब्रिजिंग तब एक प्रक्रिया के माध्यम से होता है जो एंडोकॉन्ड्रल हड्डी के गठन जैसा दिखता है, जिसमें कार्टिलाजिनस मचान फैलता है और फिर खनिज होता है, जिससे कठोर अस्थि कैलस बनता है। अंत में, हार्ड कैलस को धीरे-धीरे मूल हड्डीसंरचना 2,3 को बहाल करने के लिए ओस्टियोक्लास्ट्स और ओस्टियोब्लास्ट द्वारा फिर से तैयार किया जाता है।

यद्यपि फ्रैक्चर उपचार प्रक्रिया काफी मजबूत है, इसमें घटनाओं का एक जटिल योग शामिल है और रोगी की सामान्य स्वास्थ्य स्थिति, आयु और लिंग के साथ-साथ चोट कारकों सहित कई व्यक्तिगत कारकों से काफी प्रभावित होता है, जैसे कि यांत्रिक स्थिरीकरण का तरीका खंडित हड्डी, संक्रमण की घटना, और आसपास के नरम ऊतक की चोट की गंभीरता4, 5,6. इसलिए, विफलताएं आम हैं, जो गैर-संघ के विकास के लिए अग्रणी हैं, जो रोगी के पुनर्वास और जीवन की गुणवत्ता 7,8 को बहुत प्रभावित करती है। उच्च-ऊर्जा आघात और उम्र बढ़ने के साथ-साथ उपचार की उच्च लागत के परिणामस्वरूप फ्रैक्चर की बढ़ती संख्या के कारण, गैर-संघ फ्रैक्चर दुनिया भर में स्वास्थ्य प्रणालियों के लिए बोझ बन गए हैं 9,10. यह बढ़ता बोझ अस्थि की मरम्मत 11,12 कंकाल/मेसेनकाइमल स्टेम/स्ट्रोमल कोशिकाओं और बायोमिमेटिक बायोमैटेरियल्स 13,14के संयोजन के आधार पर सुधार करने के लिए नवीन चिकित्सीय रणनीतियों की तत्काल आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया।

इस लक्ष्य की खोज में, पशु मॉडल व्यापक रूप से फ्रैक्चर चिकित्सा तंत्र के मौलिक जीव विज्ञान को समझने के उद्देश्य से अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है और सबूत की अवधारणा preclinical अध्ययन में हड्डी की मरम्मत 15,16,17 को बढ़ावा देने के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों तैयार करने का लक्ष्य है. छोटे पशु मॉडल, जैसे कि माउस, प्रयोगात्मक विश्लेषण और उनके कम रखरखाव लागत के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों और अभिकर्मकों की व्यापक उपलब्धता के कारण फ्रैक्चर उपचार अध्ययन के लिए उत्कृष्ट हैं। इसके साथ ही, चूहों एक तेजी से चिकित्सा समय पाठ्यक्रम, जो मरम्मत की प्रक्रिया15 के सभी चरणों के अस्थायी विश्लेषण के लिए अनुमति देता है है. हालांकि, जानवर का छोटा आकार मनुष्यों में लागू होने वाले निर्धारण मोड के साथ फ्रैक्चर के सर्जिकल उत्पादन के लिए चुनौतियों का सामना कर सकता है। यह प्रोटोकॉल चूहों में फ्रैक्चर उपचार के एक सरल और कम लागत वाले मॉडल का वर्णन करता है, जो एक इंट्रामेडुलरी तार के साथ स्थिर एक खुले ऊरु ऑस्टियोटॉमी का उपयोग करता है, जो कार्टिलाजिनस कैलस गठन के माध्यम से सबसे आम हड्डी की मरम्मत प्रक्रिया जैसा दिखता है, और बुनियादी और अनुवाद संबंधी जांच दोनों में इस्तेमाल किया जा सकता है जिसमें फ्रैक्चर साइट तक पहुंच की आवश्यकता होती है।

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Protocol

सभी प्रयोगों को रियो डी जनेरियो के संघीय विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल संख्या 101/21) के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र की पशु उपयोग और देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में 10-12 सप्ताह की आयु (25-30 ग्राम शरीर के वजन) में नर बाल्ब / सी चूहों का उपयोग किया गया था। सर्जिकल प्रक्रिया में प्रति माउस लगभग 15-20 मिनट लगते हैं। प्रत्येक प्रक्रिया से पहले, आवश्यक उपकरणों ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध) ऑपरेटिंग टेबल(चित्रा 1 ए) को कवर करने वाले एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र पर आयोजित किया जाना चाहिए। धातु शल्य चिकित्सा उपकरणों 30 मिनट के लिए 123 डिग्री सेल्सियस पर स्वयं सील लिफाफे में autoclaved किया जाना चाहिए. डिस्पोजेबल आइटम, जैसे सुई और धुंध पैड, बाँझ खरीदे जाने चाहिए।

1. पशु तैयारी

  1. माउस को एनेस्थेटाइज़ करें और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग कार्यक्रम द्वारा अनुमोदित पशु चिकित्सा-अनुशंसित आहार के अनुसार एनाल्जेसिया करें।
    नोट: यदि उपलब्ध हो, तो साँस लेना संज्ञाहरण अधिमानतः किया जाना चाहिए। साँस लेना संज्ञाहरण के लिए प्रोटोकॉल का विवरण Ewald एट अल 18 द्वारा रिपोर्ट में पाया जा सकता है. हालांकि, अगर फ्रैक्चर osteoimmunology अध्ययन के लिए उत्पादन किया है, संज्ञाहरण के इस प्रकार से बचा जाना चाहिए, सबूत से पता चलता है कि कई अस्थिर संज्ञाहरण, isoflurane सहित, दोनों जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा कोशिकाओं19,20 की गतिविधि को प्रभावित.
  2. एक बार माउस स्थिर है, बाएं पैर दाढ़ी, और फिर एक बाँझ शल्य शल्य चिकित्सा पर्दे के साथ कवर 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म हीटिंग पैड ( सामग्री की तालिकादेखें) पर शल्य चिकित्सा तालिका के लिए हस्तांतरण.
  3. 10% पोविडोन-आयोडीन स्पंज के साथ त्वचा को रगड़कर चीरा क्षेत्र की एंटीसेप्टिक धुलाई करें। कीटाणुशोधन चीरा लाइन के साथ शुरू होना चाहिए और एक परिपत्र पैटर्न में बाहर की ओर विस्तार करना चाहिए। बाँझ धुंध पैड के साथ रगड़ क्षेत्र सूखी, 70% इथेनॉल के साथ धो लें, और एक बाँझ धुंध पैड के साथ फिर से सूखी. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
  4. माउस को सही पार्श्व डिकुबिटस स्थिति में रखें, और सर्जिकल टेप(चित्रा 1सी)के साथ पंजे को स्थिर करें।
  5. माउस लपेटना इतना है कि केवल चीरा क्षेत्र (चित्रा 1 डी) दिखाई दे रहा है.

2. सर्जिकल प्रक्रिया

  1. शल्य प्रक्रिया के दौरान, लगातार माउस साँस ले रहा है कि जाँच करें और सूखापन से बचने के लिए और माउस को अंधा बनने से रोकने के लिए उसकी आँखों में आँख की बूंदें प्रदान करें.
    नोट: पूरी शल्य प्रक्रिया आमतौर पर ~ 15-20 मिनट लगते हैं जब एक प्रशिक्षित सर्जन द्वारा किया जाता है। इसलिए, प्रक्रिया की शुरुआत में एक बार आई ड्रॉप लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए। यदि प्रक्रिया लंबी होने लगती है, तो अतिरिक्त अनुप्रयोग किए जा सकते हैं जब भी यह पहचाना जाता है कि आंखें सूखना शुरू हो रही हैं।
  2. चीरा करने के लिए आगे बढ़ने से पहले, दर्द प्रतिक्रिया पलटा की जांच करने के लिए पूंछ चुटकी द्वारा संवेदनाहारी गहराई का मूल्यांकन और नेत्रहीन श्वास की दर का निरीक्षण (प्रति मिनट वक्ष आंदोलनों की संख्या की गिनती)21. इष्टतम संज्ञाहरण के तहत, माउस एक पूंछ चुटकी का जवाब नहीं देना चाहिए, और सांस लेने की दर 55-65 सांसों / मिनट21 के आसपास होना चाहिए.
  3. एक स्केलपेल ब्लेड (संख्या 11, सामग्री की तालिका) के साथ 1 सेमी त्वचीय पार्श्व पैरापेटेलर चीरा बनाएं, टिबियल ट्यूबरोसिटी के स्तर से शुरू होकर पटेला के स्तर तक और फिर, समान दूरी के लिए, डिस्टल फीमर (चित्रा 1ई) की ओर।
  4. कुंद अंत कैंची के साथ, चीरा लाइन के आसपास चमड़े के नीचे प्रावरणी काटना प्रावरणी लाटा, पार्श्व वास्तु, और ऊरु बाइसेप्स मांसपेशियों22 बेनकाब करने के लिए.
  5. स्केलपेल ब्लेड नंबर 11 के साथ, त्वचा में बने एक के समान प्रावरणी लता में एक और चीरा बनाएं, टिबियल ट्यूबरोसिटी के स्तर से शुरू होता है और डिस्टल फीमर के स्तर तक बाइसेप्स फेमोरिस एपोन्यूरोसिस के साथ चल रहा है, आर्टिकुलर कैप्सूल खोलने और घुटने के जोड़ (चित्रा 1 एफ, जी) तक पहुंचने के लिए।
  6. इसके नीचे एक सीधे दाँतेदार सटीक टिप चिमटी ( सामग्री की तालिकादेखें) की नोक रखकर और इसे पटेलर और क्वाड्रिसेप्स स्नायुबंधन के साथ एक साथ किनारे पर धकेलकर पटेला का एक औसत दर्जे का लक्सेशन करें, इस प्रकार फीमर (चित्रा 1एच) के कंडाइल को उजागर करें।
  7. एक दाँतेदार टिप चिमटी के साथ फीमर पकड़े हुए, 90 डिग्री पर घुटने फ्लेक्स, और मैन्युअल रूप से एक 26 जी हाइपोडर्मिक सुई(चित्रा 1I, जे)के साथ intercondylar फोसा के माध्यम से फीमर के intramedullary नहर perforate.
  8. घुटने को 90 डिग्री पर फ्लेक्स बनाए रखना, 0.016 इंच (0.40 मिमी) स्टेनलेस स्टील रॉड वायर (चित्रा 1K, इन्सर्ट) ( सामग्री की तालिका) के उद्घाटन के माध्यम से 0.016 के 1.0 सेमी का एक खंड डालें महान ट्रोचेंटर(चित्रा 1K)की ओर फीमर की मज्जा नहर में।
    नोट: घुटने को 90 डिग्री पर फ्लेक्स बनाए रखना मज्जा नहर में तार के उचित सम्मिलन के लिए महत्वपूर्ण है। ऐसा नहीं करने से हड्डी और आसपास के नरम ऊतक घावों से तार का एक्सट्रावेशन होगा।
  9. तार के पूर्व-तुला बाहर का छोर को सीधे दाँतेदार टिप चिमटी के साथ कसकर पार्श्व कंडिल (चित्रा 1L) में ठीक करने के लिए समायोजित करें। तार को जगह में ठीक करने के अलावा, मुड़ा हुआ छोर तार के पोस्टमॉर्टम हटाने की सुविधा प्रदान करेगा।
  10. पार्श्व वास्तु और ऊरु बाइसेप्स मांसपेशियों को कुंद अंत विच्छेदन के माध्यम से एक दाँतेदार टिप चिमटी के साथ फीमर (चित्रा 1 एम) के डिस्टल डायफिसिस तक पहुंचने के लिए अलग करें।
  11. लगभग 90 डिग्री के कोण पर फीमर डायफिसिस के आसपास एक विदारक कैंची डालें, और धीरे से एक पूर्ण कॉर्टिकल ऑस्टियोटॉमी(चित्रा 1एन)प्रदर्शन करें।
    नोट: चूहों femurs आसानी से काट रहे हैं. इंट्रामेडुलरी तार के झुकने और व्यापक फ्रैक्चर कमिशन से बचने के लिए ऑस्टियोटॉमी के दौरान अत्यधिक बल लगाने से बचें।
  12. मांसपेशियों और पटेला condyle क्षेत्र पर एक सीधे दाँतेदार सटीक टिप चिमटी की नोक धक्का द्वारा reposition.
  13. एक 6-0 resorbable सिवनी के साथ मांसपेशियों प्रावरणी बंद करें और फिर एक 6-0 नायलॉन सिवनी ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर त्वचा, दोनों एक साधारण बाधित फैशन (चित्रा 1O) में.
  14. वसूली के लिए एक व्यक्ति साफ पिंजरे के लिए माउस स्थानांतरण. एक बार जागृत, माउस अप्रतिबंधित वजन असर के साथ स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने में सक्षम होना चाहिए.
  15. सर्जरी के बाद के दिनों में, संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग कार्यक्रम द्वारा अनुमोदित पशु चिकित्सा-अनुशंसित आहार के अनुसार एनाल्जेसिया करें।

3. एक्स-रे इमेजिंग

  1. चरण 1.1 में वर्णित के रूप में माउस को एनेस्थेटाइज करें।
    नोट: यदि रेडियोग्राफी शल्य प्रक्रिया के ठीक बाद की जाती है और माउस अभी भी इष्टतम संज्ञाहरण (चरण 2.2) के अंतर्गत है, तो यह इस चरण को करने के लिए आवश्यक नहीं है।
  2. खंडित फीमर के एक साफ पार्श्व दृश्य के लिए, पृष्ठीय decubitus स्थिति में माउस जगह, और थोड़ा पक्ष करने के लिए संचालित hindlimb खींच.
  3. सर्जिकल टेप के साथ पंजे को स्थिर करें।
  4. उपलब्ध उपकरण प्रोटोकॉल के अनुसार रेडियोग्राफिक इमेजिंग करें।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, एक डिजिटल दंत एक्स-रे जनरेटर का उपयोग निम्नलिखित मापदंडों के साथ किया गया था: 70 केवीपी वोल्टेज, 7 एमए वर्तमान, और 0.2 एस एक्सपोजर समय।

4. ऊतक विज्ञान प्रसंस्करण और एच एंड ई धुंधला हो जाना

  1. एनेस्थेटिक्स के इंट्रापेरिटोनियल ओवरडोज के साथ चूहों को यूथेनाइज करें (कृपया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग कार्यक्रम द्वारा अनुमोदित पशु-अनुशंसित आहार देखें)। पूंछ चुटकी के साथ संज्ञाहरण की गहराई की जांच करने के बाद, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था करें। अगला, खंडित हड्डी इकट्ठा, अतिरिक्त आसपास की मांसपेशियोंके ऊतकों 23 को हटा दें, और 3 दिनों के लिए 10% बफर formalin समाधान (पीएच 7.4) में हड्डी को ठीक.
  2. लेबल ऊतक विज्ञान कैसेट ( सामग्री की तालिकादेखें) में हड्डी के नमूने रखें, और उन्हें decalcification के लिए 14 दिनों के लिए फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस), पीएच 7.4 में 10% EDTA में विसर्जित कर दिया. प्रति सप्ताह दो बार डीकैल्सीफिकेशन समाधान बदलें।
  3. प्रत्येक 1 घंटे के लिए इथेनॉल सांद्रता (70%, 80%, 90%, 100%, 100%) बढ़ाने के समाधान की एक श्रृंखला में नमूनों को निर्जलित करें।
  4. प्रत्येक 30 मिनट के लिए xylene के दो अनुक्रमिक स्नान में नमूने साफ़ करें.
  5. मोम घुसपैठ के लिए, 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर दो अनुक्रमिक पैराफिन स्नान में नमूने विसर्जित कर दिया. अगला,24 अनुभाग के लिए ब्लॉक में नमूने एम्बेड करें.
    नोट: कैलस को बेहतर ढंग से देखने के लिए, अनुदैर्ध्य कटौती की अनुमति देने के लिए क्षैतिज स्थिति में अपनी लंबी धुरी के साथ हड्डी को एम्बेड करें।
  6. ऊतक को माइक्रोटोम के साथ 4 माइक्रोन मोटी वर्गों में काटें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  7. एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में वर्गों फ्लोट, और हिस्टोलॉजिकल स्लाइड ( सामग्री की तालिकादेखें) पर वर्गों माउंट.
  8. एच&ई धुंधला हो जाना के लिए, 5 मिनट के लिए xylene के तीन अनुक्रमिक स्नान में स्लाइड deparaffinize, और 5 मिनट के लिए इथेनॉल सांद्रता (95%, 80%, और 70%) घटती इथेनॉल सांद्रता के समाधान की एक श्रृंखला में ऊतक को फिर से हाइड्रेट.
  9. 30 एस के लिए नल के पानी में स्लाइड कुल्ला, 6 मिनट के लिए हैरिस hematoxylin ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ स्लाइड दाग, और एक और 30 एस के लिए नल के पानी में उन्हें कुल्ला.
  10. 30 एस के लिए इथेनॉल में 1% हाइड्रोक्लोरिक एसिड में स्लाइड विसर्जित करें और फिर 30 एस के लिए 70% इथेनॉल में।
  11. 2 मिनट के लिए ईोसिन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ दाग, और 30 एस के लिए नल के पानी से धो लें।
  12. इथेनॉल (70%, 80%, और 5 मिनट के लिए 95%) के साथ स्लाइड निर्जलीकरण, और 5 मिनट प्रत्येक के लिए xylene के दो स्नान के साथ स्पष्ट.
  13. बढ़ते के लिए, प्रत्येक स्लाइड पर बढ़ते माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) की एक से दो बूंदों ड्रिप, और एक साफ coverslip के साथ स्लाइड कवर.

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Representative Results

फ्रैक्चर के उत्पादन में शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की सफलता का मूल्यांकन करने का सबसे सरल और तत्काल तरीका एक्स-रे इमेजिंग है। रेडियोग्राफ सर्जरी के तुरंत बाद किया जा सकता है, माउस अभी भी संज्ञाहरण के तहत, और बाद में 7 दिन, 14 दिन, और 21 दिनों के बाद फ्रैक्चर के बाद कॉलस गठन और प्रगति का मूल्यांकन करने के लिए। स्वीकार्य फ्रैक्चर पैटर्न वे हैं जिनमें कॉर्टिस पूरी तरह से टूट जाते हैं, तारों को मज्जा नहर के भीतर सही ढंग से रखा जाता है, और फ्रैक्चर लाइनें अनुप्रस्थ होती हैं (हड्डी की धुरी पर 90 ° के कोण के साथ), तिरछी (टुकड़ा विस्थापन के बिना घुमावदार या ढलान वाला पैटर्न), या छोटा तिरछा (हड्डी की धुरी के सापेक्ष लगभग 30 डिग्री) (चित्र 2ए-डी). ये पैटर्न स्वीकार्य हैं क्योंकि वे सभी एंडोकॉन्ड्रल हड्डी के गठन (यानी, कैलस गठन के साथ) के माध्यम से मरम्मत के लिए प्रगति करेंगे यदि हड्डी के टुकड़े ठीक से गठबंधन (कम) हैं, इस प्रकार मॉडल के मुख्य उद्देश्य को प्राप्त करते हैं। इसलिए, अस्वीकार्य फ्रैक्चर केवल व्यापक कमिशन (कई छोटे हड्डी के टुकड़े) के साथ होते हैं, खराब संरेखण के परिणामस्वरूप अंग को छोटा करने के साथ, और गलत तारों के साथ (चित्र 3)। अस्वीकार्य फ्रैक्चर पैटर्न वाले जानवरों को अध्ययन से बाहर रखा जाना चाहिए। समय के साथ, फ्रैक्चर साइट (चित्रा 4) पर एक मजबूत और दृश्यमान कैलस मनाया जाना चाहिए।

इसके अलावा, फ्रैक्चर क्षेत्र के भीतर ऊतक नवनिर्माण का आकलन करने के लिए फ्रैक्चर के 7 दिन, 14 दिन और 21 दिन बाद एक हिस्टोलॉजिकल परीक्षा की जा सकती है। चूंकि इंट्रामेडुलरी तारों के साथ निर्धारण हड्डी के टुकड़ों के आंदोलन की एक निश्चित डिग्री के लिए अनुमति देता है, पुनर्योजी प्रक्रिया अस्थिभंग के एंडोकॉन्ड्रल तंत्र का अनुसरण करती है, जिसमें हाइलिन उपास्थि के मजबूत क्षेत्रों को दिन 7 (चित्रा 5 ए, बी) पर फ्रैक्चर लाइन के आसपास देखा जाता है। 14 दिन, अस्थिभंग मोर्चों उपास्थि क्षेत्र के आसपास मनाया जाता है, trabecular हड्डी और पुनर्गठित अस्थि मज्जा(चित्रा 5C,D)के साथ भरा गुहाओं का निर्माण. अंत में, 21 दिन, उपास्थि क्षेत्रों को लगभग पूरी तरह से ट्रैब्युलर हड्डी द्वारा बदल दिया जाता है, जो सफल बोनी ब्रिजिंग(चित्रा 5ई,एफ) और फ्रैक्चर उपचार अध्ययन के लिए मॉडल की वैधता का संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1: माउस में एक इंट्रामेडुलरी तार के साथ तय किए गए डायफिसियल फीमर फ्रैक्चर का उत्पादन करने के लिए सर्जिकल प्रक्रिया के चरणों को दर्शाते हुए फोटोमाइक्रोग्राफ। (ए) ऑपरेटिंग टेबल पर बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों का संगठन। (बी) एनेस्थेटिक्स के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन। (सी) पार्श्व decubitus स्थिति और पंजे के स्थिरीकरण में माउस की स्थिति. (डी) माउस की ड्रेपिंग, केवल उस क्षेत्र को उजागर करना जिस पर संचालित किया जाएगा। (ई) त्वचीय पार्श्व parapatellar चीरा. (एफ, जी) प्रावरणी लता चीरा के दृश्य। (ज) पटेला का औसत दर्जे का लक्सेशन, ऊरु कंडिल के क्षेत्र को उजागर करना। (I) इंटरकॉन्डिलर फोसा में सुई की स्थिति। (जे) ऊरु मज्जा नहर का छिद्र। (K) ऊरु उद्घाटन के माध्यम से इंट्रामेडुलरी तार का सम्मिलन। (एल) पार्श्व कंडिल में तार के मुड़े हुए छोर का समायोजन। (एम) आसपास की मांसपेशियों का कुंद अंत जुदाई। (एन) पूर्ण कॉर्टिकल ऊरु ऑस्टियोटॉमी। (ओ) नरम ऊतकों का बंद होना। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: स्वीकार्य फ्रैक्चर पैटर्न के प्रतिनिधि रेडियोग्राफ। (ए, बी) अनुप्रस्थ डायफिसियल फ्रैक्चर (फ्रैक्चर लाइनें हड्डी की धुरी पर 90 डिग्री के कोण पर होती हैं)। (सी) लघु तिरछा फ्रैक्चर (फ्रैक्चर लाइन हड्डी की धुरी के सापेक्ष 30 डिग्री से कम है)। (डी) कम करने योग्य खंडित फ्रैक्चर (हड्डी के कुछ छोटे टुकड़े देखे जाते हैं, लेकिन हड्डी का शारीरिक संरेखण रहता है)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: गलत तरीके से रखे तारों के प्रतिनिधि रेडियोग्राफ। (ए) इस माउस में, तार समीपस्थ फीमर टुकड़े की मज्जा नहर के अंदर नहीं है, इस प्रकार खंडित हड्डी के गलत निर्धारण में जिसके परिणामस्वरूप. (बी) इस मामले में, तार किसी भी हड्डी के टुकड़े से नहीं गुजरा, और खंडित हड्डी पूरी तरह से असंरेखित है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फ्रैक्चर साइट पर दृश्यमान कैलस। सर्जरी के बाद (ए) दिन 14 और (बी) दिन 21 पर फ्रैक्चर कॉलस के प्रतिनिधि रेडियोग्राफ, दिखा रहा है कि मॉडल की पुनर्योजी प्रक्रिया अप्रत्यक्ष (एंडोकॉन्ड्रल) मार्ग का अनुसरण करती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: फ्रैक्चर कॉलस का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण। एच एंड ई के साथ दाग सर्जरी के बाद (ए, बी) दिन 7, (सी, डी) दिन 14, और (ई, एफ) दिन 21 पर खंडित हड्डियों की प्रतिनिधि छवियां कैलस के विकास पर ध्यान दें; कैलस शुरू में फ्रैक्चर लाइन के चारों ओर हाइलिन उपास्थि के व्यापक क्षेत्रों के साथ प्रस्तुत करता है ( ए में डालें, बी में आवर्धित), ये क्षेत्र तब ट्रैब्युलर हड्डी के गठन के लिए टेम्पलेट्स के रूप में काम करते हैं ( सी में डालें, डी में आवर्धित), और प्रक्रिया हड्डी द्वारा उपास्थि के पूर्ण प्रतिस्थापन में समाप्त होती है और, इस प्रकार, हड्डी ब्रिजिंग ( ई में डालें, एफ में आवर्धित)। स्केल बार: (ए, सी, डी) 500 माइक्रोन; (बी, डी, एफ) 100 माइक्रोन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

जैसे-जैसे दुनिया भर में फ्रैक्चर की संख्या 9,10,25 बढ़ती है, गैर-संघ के लिए अभिनव उपचार तेजी से जरूरी होते जा रहे हैं। फ्रैक्चर उपचार के रूप में एक लंबेसमय से अधिक होने वाली घटनाओं का एक जटिल और कसकर ऑर्केस्ट्रेटेड योग शामिल है 3, वैध पशु मॉडल का उपयोग तंत्र है कि हड्डी की मरम्मत की सफलता का निर्धारण और प्रभावी दवाओं और चिकित्सीय प्रोटोकॉल16,17 का चयन करने के बारे में हमारी समझ में सुधार करने के लिए केंद्रीय है.

माउस में, फीमर और टिबिया दोनों का उपयोग लंबी हड्डी फ्रैक्चर हीलिंग अध्ययन के लिए किया जा सकता है। इस मॉडल में, टिबिया के बजाय फीमर को चुना गया था क्योंकि यह एक बड़ी हड्डी है जिसमें एक बड़ा व्यास और बेहतर नरम ऊतक कवरेज होता है। दूसरी ओर, माउस टिबिया की डायफिसिस घुमावदार है, और इसके कैलिबर उत्तरोत्तर बाहर का अंत है, जो intramedullary निर्धारण उपकरणों26 के सम्मिलन जटिल के साथ कम हो जाती है. इसलिए, फीमर की विशेषताएं इसे उन मॉडलों के लिए आदर्श बनाती हैं जिनमें इंट्रामेडुलरी निर्धारण का इरादा है। सेक्स के बारे में, पुरुष चूहों का उपयोग किया गया था, क्योंकि सबूत हैं कि पुरुष महिलाओं की तुलना में अधिक प्रमुख कार्टिलाजिनस कैलस गठन के साथ तेजी से फ्रैक्चर उपचार दिखाते हैं27. हालांकि, यदि आवश्यक हो, तो तकनीक को आसानी से मादा फीमर की थोड़ी छोटी लंबाई फिट करने के लिए इंट्रामेडुलरी तार के आकार को समायोजित करके महिलाओं के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

गिलोटिन28 के साथ तीन-बिंदु झुकने तंत्र का उपयोग करने वाले बंद फ्रैक्चर मॉडल की तुलना में, यहां वर्णित ओपन सर्जरी मॉडल भी फायदेमंद है क्योंकि यह फ्रैक्चर साइट को उजागर करता है, जो शोधकर्ता को फ्रैक्चर को नेत्रहीन रूप से देखने की अनुमति देता है। यह विज़ुअलाइज़ेशन तकनीकी त्रुटियों से बचने में मदद करता है जिसके परिणामस्वरूप निम्नलिखित अस्वीकार्य फ्रैक्चर पैटर्न होते हैं: गंभीर टुकड़ा विस्थापन, जो हड्डी के शारीरिक पुनर्गठन (गैर-कम करने योग्य फ्रैक्चर) की अनुमति नहीं देता है; कई छोटे टुकड़ों (कमीशन) में हड्डी का व्यापक विखंडन, एक ऐसी स्थिति जो मरम्मत प्रक्रिया को खराब कर सकती है; और/या निर्धारण उपकरणों का गलत स्थान। चूंकि फ्रैक्चर इस मॉडल में कोमल ऑस्टियोटॉमी के कारण होता है, इसलिए व्यापक टुकड़ा विस्थापन और/या कमिशन आमतौर पर नहीं देखा जाता है।

हालांकि, तकनीक इस अर्थ में सीमित है कि इसके लिए अन्य तरीकों की तुलना में माउस की शारीरिक रचना के अधिक तकनीकी शल्य चिकित्सा कौशल और ज्ञान की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, माउस का छोटा आकार चूहों या बड़े जानवरों के मॉडल की तुलना में हेरफेर को पेचीदा बनाता है। एक बार जब इन सीमाओं को प्रशिक्षण के साथ दूर कर दिया जाता है, तो स्वीकार्य फ्रैक्चर के उत्पादन में सफलता की दर लगभग 100% है, जिससे अध्ययन से जानवरों को हटाने की संख्या कम हो जाती है।

इसके अलावा, ओपन सर्जरी फ्रैक्चर मॉडल चिकित्सीय एजेंटों के स्थानीय आवेदन की अनुमति देता है, जैसे स्टेम / पूर्वज कोशिकाओं, बायोमटेरियल्स, और/या फार्मास्युटिकल ड्रग्स, जो पर्क्यूटेनियस या सिस्टमिक डिलीवरी26 का उपयोग करके लागू करना संभव नहीं होगा। अंत में, intramedullary उपकरणों के साथ निर्धारण आसान है, सस्ता, और थाली और बाहरी उपकरणों के साथ की तुलना में अधिक अनुकूलन और लंबी हड्डीफ्रैक्चर 29 के उपचार के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया नैदानिक रणनीति की नकल करता है. इसलिए, यहां वर्णित मॉडल फ्रैक्चर उपचार का अध्ययन करने के लिए कम लागत वाले मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है, दोनों बुनियादी और अनुवाद संबंधी सेटिंग्स में, जिसका अर्थ है कि यह अध्ययन न केवल फ्रैक्चर हीलिंग जीव विज्ञान के ज्ञान में वृद्धि करता है बल्कि हड्डी की मरम्मत के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में भी योगदान देता है।

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Disclosures

लेखकों के कोई परस्पर विरोधी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम को कार्लोस चगास फिल्हो फाउंडेशन फॉर रिसर्च सपोर्ट ऑफ द स्टेट ऑफ रियो डी जनेरियो (FAPERJ) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alcohol 70º Merck 109-56-8 Or any general available supplier
Canada balsam (mounting medium) Merck C1795 Or any general available supplier
Cefazoline ABL Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Coverslip Merck CSL284525 Or any general available supplier
Dental X-Ray Generator Focus - Sold by Instrumentarium Dental Inc. 
DEPC water Merck W4502 Or any general available supplier
Dissecting Scissor ABC Instrumentos 0327 Similar brands of the item may be used according to local availability
EDTA Vetec 60REAVET014340 Similar brands of the item may be used according to local availability
Eosin solution Laborclin EA-65 Similar brands of the item may be used according to local availability
Ethanol P.A Vetec 60REAVET012053 Similar brands of the item may be used according to local availability
Gauze pads Cremer Not applicable Or any general available supplier
Harris Hematoxylin Solution Laborclin 620503 Similar brands of the item may be used according to local availability
Heating pad Tonkey Electrical Technology E114273 Similar brands of the item may be used according to local availability
Histological slides Merck CSL294875X25 Or any general available supplier
Histology cassettes Merck H0542-1CS Or any general available supplier
Hydrochloric acid - 37% Merck 258148 Similar brands of the item may be used according to local availability
Insulin syringe BD 324918 Or any general available supplier
Iodopovidone sponge Rioquímica 372106 Or any general available supplier
Ketamine hydrochloride Ceva Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Lacribel collyrium Cristalia Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Microtome Leica 149AUTO00C1
Mouse Tooth Forceps Tweezer ABC Instrumentos 0164 Similar brands of the item may be used according to local availability
Needle 26 G BD 2239 Or any general available supplier
Needle Holder  Golgran 135-18 Similar brands of the item may be used according to local availability
Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 Atramat C1546-NT Or any general available supplier
Paraffin Exodo 8002 - 74 - 2 Similar brands of the item may be used according to local availability
Paraformaldehyde Sigma 30525-89-4 Similar brands of the item may be used according to local availability
PBS 1x  Lonza  BE17-516F Similar brands of the item may be used according to local availability
Resorbable Nylon Suture thread nº 6 Atramat C1596-45B Or any general available supplier
Rod Wire SS CrNi 0.016" Orthometric 56.50.2016
Scalpel nº 11 Descarpak 15782 Or any general available supplier
Serrated Tip Tweezer Quinelato QC.404.12 Similar brands of the item may be used according to local availability
Shaver Phillips Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Surgical tape 3M 2734 Or any general available supplier
Surgical tnt field Polarfix 6153 Or any general available supplier
Tramadol hydrochloride Teuto  Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Water bath for histology Leica HI1210
Xylazine hydrochloride Ceva Not applicable Similar brands of the item may be used according to local availability
Xylene Dinamica 60READIN001105 Similar brands of the item may be used according to local availability

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Braga Frade, B., Dias da Cunha Muller, L., Bonfim, D. C. Establishing a Diaphyseal Femur Fracture Model in Mice. J. Vis. Exp. (190), e64766, doi:10.3791/64766 (2022).

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