Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Agrobacterium tumefaciens-mediert genetisk transformasjon av smalbladet plantain

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64777
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 3, 4, 1
1Department of Agronomy, Center for Plant Biology, Purdue University, 2Department of Biology, Purdue University, 3Department of Horticulture, Faculty of Agricultural Sciences, University of the Punjab, 4Department of Botany and Plant Pathology, Center for Plant Biology, Purdue University

Summary

På grunn av sin allsidige anvendelse som modellart i ulike fagområder, er det behov for en genetisk transformasjonsverktøykasse i smalbladet plantain (Plantago lanceolata). Her, ved bruk av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon, presenteres en protokoll som resulterer i stabile transgene linjer med en transformasjonseffektivitet på 20%.

Abstract

Artene i slekten Plantago har flere unike egenskaper som har ført til at de er tilpasset som modellplanter i ulike fagfelt. Mangelen på et genetisk manipulasjonssystem forhindrer imidlertid grundig undersøkelse av genfunksjon, og begrenser allsidigheten til dette slaget som modell. Her presenteres en transformasjonsprotokoll for Plantago lanceolata, den mest studerte Plantago-arten. Ved bruk av Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon ble 3 uker gamle røtter av aseptisk dyrkede P. lanceolata-planter infisert med bakterier, inkubert i 2-3 dager, og deretter overført til et skuddinduksjonsmedium med passende antibiotikavalg. Skudd kom typisk ut av mediet etter 1 måned, og røttene utviklet seg 1-4 uker etter at skuddene ble overført til rotinduksjonsmediet. Plantene ble deretter akklimatisert til et jordmiljø og testet for tilstedeværelse av et transgen ved hjelp av β-glukuronidase (GUS) reporteranalysen. Transformasjonseffektiviteten til den nåværende metoden er ~ 20%, med to transgene planter som dukker opp per 10 rotvev transformert. Etablering av en transformasjonsprotokoll for smalbladet plantain vil lette adopsjonen av denne planten som en ny modellart i ulike områder.

Introduction

Konseptet med å bruke modellarter for å undersøke flere aspekter av plantebiologi dukket opp med den utbredte bruken av Arabidopsis thaliana1. Arabidopsis ble opprinnelig valgt fordi den deler egenskaper med mange andre blomstrende planter og har flere egenskaper som gjør det praktisk å studere i et laboratoriemiljø, for eksempel å være liten og ha en kort generasjonssyklus. Det store volumet av forskningsartikler publisert med det som emne, sammen med sin lille genomstørrelse og enkle genetiske transformasjon2, gjør det mulig å fortsette som en mye brukt eksperimentell organisme. Arabidopsis kan imidlertid begrenses som modell for arter med ulike egenskaper eller unike egenskaper3. Dette har ført til utvikling av nye modellsystemer, som mais (Zea mays), en viktig plante for utviklingsgenetikk i monocots4, og tomat (Solanum lycopersicum), som er en viktig modell for evolusjonære studier, fruktutvikling og produksjon, og er en god representasjon for vegetabilske avlinger5. En metode for genetisk transformasjon er en forutsetning for at en planteart skal fungere som en modellorganisme2. En Agrobacterium tumefaciens-mediert transformasjon er et pålitelig verktøy i plantebiologi; den har blitt brukt til å transformere noen få modellarter og store avlinger, inkludert tobakk (Nicotiana tabacum)6, ris (Oryza sativa)7, bomull (Gossypium hirsutum)8, soyabønner (Glycine max)9, potet (Solanum tuberosum)10 og raps (Brassica napus)11. Plantearter er svært variable i hvor vellykket de reagerer på A. tumefaciens-infeksjon, og transformasjonsprotokoller må ofte skreddersys individuelt for hver art 6,12.

Slekten Plantago omfatter totalt 256 plantearter, utbredt over hele verden13. Artene i denne slekten har ofte unike egenskaper som gjør dem ønskelige som modellarter for å studere genetikk, økologi, stressfysiologi, sekundære metabolitter, medisinsk kjemi, plantemikrobeinteraksjoner, planteutvikling og evolusjon. Plantago lanceolata, også kalt smalbladet eller ribwort plantain, har vært en populær plante av interesse siden det 19. århundre, da den først ble brukt til å beskrive fenomenet mannlig sterilitet14. Som andre planter i slekten har den blitt brukt i studier på tvers av ulike forskningsfelt. Mer nylig har det blitt foreslått som en modell for vaskulær biologi, da dets vaskulære vev lett kan samles15. P. lanceolata er den mest studerte arten i slekten Plantago; En artikkel fra 2021 rapporterte at det var >1.400 publikasjoner inkludert eller relatert til denne arten på den tiden16, og ytterligere 102 artikler er publisert siden begynnelsen av 2022, ifølge et PubMed-søk utført 9. Den nest mest studerte planten i slekten, P. major, er gjenstand for bare 414 artikler når den søkes etter de samme kriteriene på samme dato.

Til tross for forskningsinteressen for P. lanceolata, er studier, spesielt på genfunksjonskarakterisering, ofte begrenset av mangelen på en genetisk manipulasjonsverktøykasse for arten. Pommerrienig et al. gjorde en innsats for å utvikle en transformasjonsprotokoll for P. major ved hjelp av en blomsterdyppteknikk17. Denne metoden kan imidlertid ikke brukes på P. lanceolata på grunn av den mannlige steriliteten som er karakteristisk for denne arten18,19. Så vidt vi vet, er det ingen eksisterende protokoll for transformasjon av P. lanceolata.

Denne studien presenterer en enkel protokoll for A. tumefaciens-mediert transformasjon av P. lanceolata. Ved å målrette rotvev, kan fullvoksne transgene planter genereres innen 3 måneder etter transformasjon.

Protocol

MERK: Trinn 1.4–1.8, 2.3–2.5, 3.3–3.6, 4.1–4.6, 5.1–5.7 og 6.1–6.3 må utføres under aseptiske forhold ved bruk av en ren hette for å unngå kontaminering.

1. Forplantning av plantemateriale for transformasjon

  1. Plasser kommersielt tilgjengelige villtype (WT) Plantago lanceolata frø (se materialfortegnelse) i et 50 ml sentrifugerør opp til 5 ml linjen, avhengig av ønsket antall planter.
    MERK: Alternativt kan et 2 ml mikrosentrifugerør brukes når et lite antall frø er nødvendig, men det bør fylles til et volum ikke større enn 0,1 ml, da for mange frø kan redusere effektiviteten av sterilisering.
  2. Fordyp frøene i 75% etanol i 60 s.
  3. Kast etanolen, senk deretter frøene i 20% natriumhypokloritt (20% NaClO, 80% sterilt vann) i 40 minutter, snu forsiktig røret slik at alle frøene kommer i kontakt med løsningen.
    MERK: Natriumhypoklorittoppløsningen må være nylaget for optimale resultater.
  4. Under en laminær strømningshette, kast natriumhypoklorittoppløsningen, vask deretter frøene med destillert vann (fem ganger). Tilsett et lite volum vann til frøene etter den endelige skyllingen, da dette kan bidra til å hjelpe bevegelsen av plantene på tallerkener.
  5. Bruk sterilisert tang til å overføre frøene til ferdig tilberedte 95 mm x 100 mm petriskåler med fast MS-medium (tabell 1). Spred frøene jevnt over overflaten av platen, med ca. 1 cm mellom hvert frø for å forhindre overbefolkning av de spirede plantene (figur 1A) .
  6. Forsegl platene med to lag parafinfilm for å forhindre forurensning, og inkuber deretter under et kjølig hvitt vekstlys (se materialfortegnelse) ved romtemperatur (22 °C med 50 μmol m-2 s-1, 12 timers dager). Frøene spirer vanligvis innen 5-6 dager.
  7. Når plantene har spiret og er store nok til å overføre (figur 1B), vanligvis 2 eller 3 dager etter spiring, bruk sterilisert tang for å overføre plantene til sterile bokser med 50-100 ml MS-medium (tabell 1). Ideelt sett plant bare fem frøplanter per boks for å oppnå røtter av beste kvalitet.
  8. Forsegl boksene med kirurgisk tape, og la plantene vokse under et kjølig hvitt vekstlys (se materialfortegnelse), under de samme forholdene som er nevnt i trinn 1.6. Plantene skal være klare til omdanning om 3-4 uker, eller når hovedrøttene har vokst ca 2 cm i lengde og siderøttene virker hvite.
    MERK: Oppskrifter med middels tilberedning og vitaminlagre er inkludert i tabell 1 og tabell 2.

2. Plasmidkonstruksjon og E. coli-transformasjon

MERK: Den nøyaktige plasmidkonstruksjonsprosedyren varierer avhengig av genet av interesse. I denne prosedyren ble restriksjonsenzymene HindIII og SalII brukt til å sette inn 1,5 kb AtPP2-promotoren i det binære plasmidet pBI101 (se materialtabell) med GUS, ved bruk av standard kloningsprosedyre20. AtPP2 (phloem protein 2) er et gen som er spesifikt uttrykt i floem21.

  1. Klon promotoren ved hjelp av primerparene 5'-AGTCAAGCTTCAAGTCCCTGTGGCTACTGAAC-3' (Forward) og 5'-AGTCGTCGACAAACCAGTATGATGTATTTTTG-3' (Reverse) fra Arabidopsis. Figur 2 viser et diagram over den binære plasmidvektoren med AtPP2:GUS-innsatsen .
  2. Etter plasmidkonstruksjon, transformer plasmidene til DH5a E. coli (se materialtabell) kompetente celler ved hjelp av varmesjokkmetoden22, og inkuber deretter i 1,5 timer ved 37 ° C med risting (150 rpm).
  3. Ta 150 μL av hver transformasjonskultur, plate på LB-agarmedieplater (tabell 1) med riktig valg (50 mg / l kanamycin for stammen som brukes i denne protokollen, se materialtabell), og inkuber deretter platene i 16-24 timer ved 37 ° C.
    MERK: Bakteriestammen som brukes i denne studien er A. tumefaciens GV3101.
  4. Bruk deretter koloni-PCR til å screene koloniene for positive rekombinanter23.
    MERK: I denne protokollen ble følgende primere brukt til å amplifisere det målrettede genet; 5'-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3'(Forward) og 5'-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3' (revers).
    1. Kjør reaksjonen i en termosyklist (se materialfortegnelse) med sykkelforhold på 3 minutter ved 95 °C, etterfulgt av 35 sykluser på: 30 s ved 95 °C, 30 s ved 55 °C, 2 min ved 72 °C og et siste forlengelsestrinn på 10 minutter ved 72 °C.
    2. Inokuler de positive koloniene i 6 ml LB-buljong (tabell 1) med passende antibiotika (50 mg / l kanamycin) og vokse ved 37 ° C over natten, ved 200-250 o / min.
  5. Etter vekst over natten, trekk ut plasmidene fra bakteriene ved hjelp av standardprosedyrer24.

3. A. tumefaciens transformasjon med plasmid

  1. Etter plasmidekstraksjon, bruk elektroporering for å transformere det modifiserte plasmidet til ønsket belastning av kompetente celler. I denne prosedyren ble A. tumefaciens stamme GV3101 brukt. Følge standardiserte metoder for elektroporasjonsteknikker25.
  2. Etter elektroporering, resuspender de kompetente cellene i 1 ml LB-buljong og inkuber deretter i 2-4 timer ved 28 ° C ved 100 o / min.
  3. Samle cellene gjennom sentrifugering ved 6 800 x g i 3 minutter i en mikrosentrifuge på bordplaten (se materialfortegnelse) ved romtemperatur (22 °C), og spred deretter 50-100 μL på en LB-agarplate med et passende utvalgsmiddel (50 mg/l kanamycin for plasmidet som brukes i denne protokollen).
  4. Etter at cellene har inkubert i 2 dager ved 28 °C, identifiser positive kolonier som inneholder genet av interesse ved bruk av koloni-PCR. I denne protokollen bruker du primere og betingelser som er nevnt i trinn 2.4.
  5. Deretter bruker du de positive koloniene til å streke en aksjeplate med LB agar media + utvalg. Platen kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
  6. Alternativt, for langtidslagring, inokulere en positiv koloni med et lite volum LB med passende utvalg. Rist den inokulerte kulturen over natten ved 28 °C ved 200 o / min, og lag deretter en glyserolbestand (50% w / v glyserol i en 50:50 blanding av bakterier og glyserol), som kan lagres ved -80 ° C i opptil 10 år.

4. A. tumefaciens forberedelse

  1. Strek A. tumefaciens som inneholder ønsket plasmid på preparerte 95 mm x 100 mm faste LB-plater med egnet valgmiddel. I denne protokollen ble bakteriestammen GV3101 med plasmidinnsatsen AtPP2:GUS brukt, med 50 mg/L kanamycin tilsatt for utvalget.
  2. Forsegl platene med parafinfilm, rug deretter ved 28 °C i opptil 48 timer, eller til bakteriene vokser seg store nok til å plukke.
  3. Bruk en pipettespiss til å plukke en bakteriekoloni 2 dager før transformasjon, og inokuler den i et 15 ml rundbunnsrør inneholdende 6 ml flytende LB med passende valg. Rist ved 200 o / min i en 28 ° C bordplateshaker over natten, til OD600 når 0,6-0,7.
    MERK: Plater og bakteriell inokulasjon på 6 ml kan oppbevares ved 4 °C i opptil 1 måned.
  4. Når bakteriene når riktig OD 600, bruk en pipette for å overføre A. tumefaciens til en steril kolbe inneholdende100 ml flytende LB med et seleksjonsmiddel. Vanligvis er 200 μL bakterier per 100 ml LB egnet for forplantning. Rist ved 200 o / min ved 28 ° C over natten, til OD600 når 0,6-0,7.
  5. Overfør bakteriene til 50 ml sterile sentrifugerør, og sentrifuge ved 2,200 xg i 10 minutter ved romtemperatur (22 ° C) i en bordplate sentrifuge for å samle bakteriene.
  6. Kast supernatanten med en pipette. Resuspender bakteriepelleten i 5 ml romtemperatur (22 °C) flytende suspensjonsløsning (SS) (tabell 1) ved pipettering, tilsett deretter opptil 50 ml SS og snu opp ned flere ganger for å blande. Bakteriene er nå klare for transformasjon.
    MERK: Den flytende SS må tilberedes fersk, innen 1 uke etter transformasjon.
    FORSIKTIG: Alt materiale som kommer i kontakt med A. tumefaciens må kastes i en biohazard avfallsbeholder. Resterende væsker fra bakteriekulturer kan steriliseres med natriumhypokloritt (blekemiddel) i en konsentrasjon på 20% eller høyere.

5. Transformasjon av Plantago-røtter

  1. Når plantene når det ideelle stadiet for transformasjon (plantene er 3 uker gamle) (figur 1C), bruk steril tang og saks for å skille røttene fra resten av planten (figur 3A). Kast blad- og stilkmaterialet.
  2. Umiddelbart etter kutting, overfør rotstykkene til sterile bokser som inneholder sterilt vann ved hjelp av steril tang. Dette trinnet gjør at røttene kan holde seg hydrert mens alt vev samles inn.
  3. Når alle røttene er kuttet, hell A. tumefaciens/SS-suspensjonen i sterile 150 mm x 15 mm petriskåler. Overfør røttene til A. tumefaciens-kulturen og inokuler i minst 20 minutter (figur 3B).
  4. Under inkubasjon, bruk en steril skalpell med et skarpt blad for å kutte røttene i 1 cm fragmenter, skille de primære røttene fra siderøttene. Lag tynne, grunne kutt på overflaten av røttene for å la bakteriene infisere planten.
    MERK: Hvis du arbeider med et stort antall planter, overfør rotbitene til bakteriekulturen i grupper for å sikre at alle røttene er nedsenket under inokulering.
  5. Etter inkubering, bruk den sterile tangen til å overføre rotstykkene til sterile papirhåndklær for å fjerne overflødige bakterier. Unngå å tørke røttene i mer enn 60 s, da dette kan forårsake dehydrering og skade rotvevet. Ideelt sett kan 10-15 røtter tørkes samtidig (figur 3C).
  6. Overfør de tørkede røttene til tilberedte 95 mm x 15 mm petriskåler med faste kokulturmedier (tabell 1), rundt 10-20 røtter per tallerken, avhengig av størrelsen på røttene (figur 3D).
  7. Forsegl platene med to lag gjennomsiktig plastfilm, og dekk deretter med aluminiumsfolie. Inkuberes ved romtemperatur (22 °C) i 3 dager. Dette trinnet gir tid for bakteriene å infisere røttene uten tilstedeværelse av et antibiotikavalg (figur 3E).

6. Seleksjon og regenerering av hele planter

  1. Etter inkubering i kokulturmedier, overfør rotstykkene til tilberedte 95 mm x 15 mm petriskåler med faste skuddinduksjonsmedier (SIM) (tabell 1) med timentin (500 mg/l; se materialfortegnelse) og passende valg av antibiotika. I denne protokollen brukte vi kanamycin (100 mg/L).
    MERK: Bunnen av røttene må komme i fullstendig kontakt med mediet. Røtter som ikke berører mediets overflate er for lange og må kuttes for å forhindre at vevet unnslipper valg.
  2. Forsegl platene med to lag gjennomsiktig plastfilm, og vokse deretter under et vekstlys i 1 måned (se trinn 1.6 for passende forhold), eller til skuddene begynner å dukke opp.
    MERK: Vanligvis kan skuddinitialer observeres etter 2 ukers vekst, og skuddene er vanligvis synlige etter 1 måned.
  3. Når plantlettene er 1,5-2,0 cm lange (figur 1D), overfør dem til preparerte sterile bokser med faste rotinduksjonsmedier (tabell 1).
  4. Dyrk plantene under et vekstlys (se trinn 1.6 for forhold) i flere uker, til røtter dannes. Røtter kan vanligvis først ses etter 1 uke.
    MERK: Det anbefales å la røttene vokse i flere uker før de flyttes til jorden, da planter med større rotsystemer har en tendens til å ha en høyere overlevelsesrate i jord.

7. Jordoverføring

  1. Når rotsystemene har blitt store nok til å overføre (figur 1E), vanligvis etter 1 måneds vekst, overfør plantene til 3,5 i firkantede potter som inneholder forfuktet allbruksjord (BM7). I denne protokollen ble BM7 barkblanding brukt (se materialtabell).
    1. Fjern ethvert medium som fester seg til røttene ved å vaske dem forsiktig i vann.
      MERK: Plantene kan dyrkes til modenhet i et drivhus ved 800 til 1400 μmol fotoner m-2 s-2 ved bruk av 600 W høynatriumtrykklys (se materialfortegnelse), eller i et vekstkammer ved romtemperatur (22 ° C) med kjølige hvite lys ved 50 μmol m-2 s-1, 12 timers dager.
  2. Dekk plantene med et plastdeksel, og dekk dem deretter med en klar plastpose. Dette trinnet gjør at plantene kan forbli i et fuktig miljø når de tilpasser seg jorden.
  3. Etter ca 3-5 dager, fjern plastposen, og fjern deretter lokket sakte for å tillate akklimatisering til det ytre miljøet.
    MERK: Avhengig av årstiden og miljøet som plantene overføres til, kan tiden plantene trenger for å tilpasse seg variere. Det anbefales å sjekke plantene daglig og tilsette vann til pottene etter behov.
  4. Vann plantene regelmessig og tilsett gjødsel etter behov. Planter kan også overføres til større potter for videre vekst (figur 1F).

8. β-glukuronidase (GUS) histokjemisk farging

  1. Forbered β-glukuronidase (GUS) fargeløsning, i henhold til publiserte protokoller15.
  2. Når skuddinitialene er ca. 0,5-1 cm lange, fjern en liten spiss av et ungt, fullt utvidet blad (<5 mm i lengden er vanligvis tilstrekkelig) og overfør umiddelbart til 0,5-1 ml GUS-fargeløsning i et 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør. Løsningen skal dekke plantevevet helt.
  3. Plasser de åpnede rørene i en vakuumtørker og vakuum ved 20-25 kPa i 5-10 minutter. Små bobler skal være synlige i løsningen under vakuumprosedyren. Dette gjør at løsningen kan komme inn i plantens celler.
  4. La luft filtrere tilbake i vakuumtørkeren. Lukk tubene og inkuber ved 37 °C over natten (12 timer), eller til den blå fargen er synlig.
    MERK: I denne studien ble GUS-aktivitet lokalisert til floem, noe som betyr at i positivt transformerte planter bør blå farging bare være synlig i floemvevet. Planter uten transgenet opplever ikke farging (figur 4).
  5. For bedre å visualisere flekken, overfør plantene til 100% etanol for å fjerne klorofyll. For å øke effektiviteten av klorofyllfjerningsprosessen, inkuber rørene ved 60 ° C i 10 minutter.
    MERK: Etanolen må kanskje endres flere ganger før all klorofyll fjernes, avhengig av størrelsen på bladet som blir farget.

Representative Results

En enkel protokoll er rapportert her for å oppnå transgene P. lanceolata-planter ved bruk av A. tumefaciens-mediert transformasjon. Reportergenet GUS (som koder for β-glukuronidase) transformeres, drevet av floem-uttrykt promotor av AtPP2, til 3 uker gamle P. lanceolata-røtter gjennom A. tumefaciens-stammen GV3101 (figur 2). En floem-spesifikk promotor ble valgt fordi vår hovedinteresse var å etablere et system for funksjonell genomikk av plantevaskulært vev, spesielt floem. Metoden ble testet på rot-, blad- og petiolevev i det foreløpige forsøket. Selv om callus kunne induseres i alle vevstyper, var det bare rotvevet som produserte skuddinitialer (figur 5A) etter 1 måned i SIM; bladet og petiole ble brune og døde (figur 5B). Dette førte til konklusjonen om at rotvev var den optimale vevstypen for bruk i transformasjonsmetoden. Røttene ble inkubert i de fremstilte bakteriene resuspendert i suspensjonsløsning (SS) (tabell 1) i minst 20 minutter, deretter inkubert ved romtemperatur på faste SS-plater i opptil 3 dager i mørket (figur 3E). Røttene ble deretter overført til skuddinduksjonsmediet (SIM) og holdt under vekstlys, under de forholdene som er angitt i protokollen (trinn 1.6). Figur 1 og figur 3 viser representative bilder av hvert trinn i protokollen for referanse.

Figur 6 viser progresjonen av skuddinitialer som kommer fra transformert vev, fra den første dagen røttene ble plassert på SIM-kortet (figur 6A) til skuddene var klare til å rotfestes (figur 6D). Etter 1 uke dannet rotvevet callus (figur 6B), og begynnelsen av skuddinitialer kunne observeres (figur 6B1). Skuddene fortsatte å dukke opp i uke 2 og 3 (figur 6C), og etter 4 uker var skuddene klare til å overføres til rotinduksjonsmediet (figur 6D).

Identifisering av de antatte transgene plantene ble utført ved hjelp av β-glukuronidase (GUS) histokjemisk analyse, ved bruk av bladsegmenter tatt når skuddene var rundt 0,5 cm lange. Positive transgene planter viste forventet fargemønster i floemets lokaliserte vev, vist i figur 4. Positive GUS-fargede skudd ble overført til rotinduksjonsmediet, der de utviklet robuste rotsystemer etter 4 uker (figur 1E). Rotte planter ble deretter overført til jorden. Figur 4 viser resultatet av farging i en smalbladet plantain transformert med AtPP2-promotoren og β-glukuronidase-genet (GUS), sammen med en villtype og en smalbladet plantain transformert med AtPP2-promotoren , for sammenligning. Alle skuddene som dukket opp ble bekreftet som transgene. Transformasjonseffektiviteten ble bestemt til å være et gjennomsnitt på 20%, med omtrent to skudd som dukket opp for hver 10 røtter som ble transformert. Bekreftede transgene planter ble overført til større potter og dyrket i 4-8 uker til de nådde voksenstadiet (figur 1F).

Figure 1
Figur 1: Tidslinje for Plantago lanceolata-transformasjon . Representative bilder av hvert trinn i protokollen. (A) Ungerminerte frø belagt på en MS-plate. (B) Frø spiret etter 1 uke, klar til å bli overført til magenta bokser. (C) Planter i MS-bokser etter 3 ukers vekst. Rødder er grønne og sunne, på det ideelle stadiet for transformasjon. (D) Skudd i skuddinduksjonsmedier etter 4 uker er klare til å overføres til rotmediet. På dette stadiet kan β-glukuronidase (GUS) histokjemisk farging utføres, hvis aktuelt. (E) Planter i esker med rotinduksjonsmedier, hvor røtter har dannet seg etter 4 ukers vekst. (F) Transgene planter dyrkes til full lengde etter 4 ukers vekst i jord. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Diagram over det binære vektorplasmidet pBI101 + β-glukuronidase (GUS) med den innsatte floemspesifikke promotoren AtPP2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Transformasjonstrinn. Representative bilder av hvert trinn i transformasjonen. (A) Skille røtter fra skudd under transformasjon. (B) Bløtlegging av røtter i bakterier/SS-suspensjon. (C) Tørking av røtter på tørkepapir for å fjerne overflødige bakterier. (D) Røtter belagt på co-kultur medium. (E) SS-plater innpakket i aluminiumsfolie. Plantene ble ruget i 2-3 dager før de ble overført til skytemediet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: GUS-farging. β-glukuronidase (GUS) farging resultater av smalblad plantain blad segmenter. (A) Vill type. (B) Smalbladet plantain transformert med plasmidet som har AtPP2-promotoren (tom vektor). (C) Smalbladet plantain transformert med plasmidet som har AtPP2-promotoren og β-glukuronidase (GUS) genet. Hvert blad ble farget ved hjelp av GUS histokjemiske fargeprotokoll, deretter avbildet med et mikroskopisk kamera. Bilder (B) og (C) viser ingen fargemønster på grunn av fravær av GUS-genet. Det høyre bildet viser et klart blått fargemønster i venene, som bekrefter at plantene er transgene. Stangen representerer 1 mm, hvor hvert bladsegment måler ca. 1 cm i lengde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning av transformasjonseffektivitet av forskjellige vevstyper etter >1 måneds inkubasjon på skytemedier . (A) Rotvev etter over 1 måneds vekst. Røtter har opplevd utvidet kallus, og skyteinitialer har dukket opp. Ikke-transformert callus har begynt å dø som svar på antibiotikavalg. (B) Blad og petiole vev etter over 1 måned med vekst. Vev opplevde noe kallusekspansjon, men døde snart som svar på antibiotika. Ingen skudd kom ut fra noen av vevene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Fremvekst av callus og skudd på transformert vev. Representative bilder av vev plassert på skytemedium etter forskjellige lengder av inkubasjon. (A) Rotvev like etter å ha blitt belagt på skytemediet. (B) Rotvev etter 1 uke på skytemedium. Callus-ekspansjon kan observeres, og (B1) de første skuddinitialene har begynt å dukke opp. (C) Rotvev etter 3 uker på skytemedium. Flere skuddinitialer har dukket opp. (C1) Skytingen som dukket opp fra B1-skytingen initial. (D) Rotvev etter 4 ukers inkubasjon. Ikke-transformert vev har begynt å bli svart/brunt og dø, og nye skudd fortsetter å vokse. På dette stadiet er skuddene klare til å flyttes til rotmediet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Media forberedelse oppskrifter. En beskrivelse av hvordan man forbereder medier for transformasjon. Mengden tilsatt vitaminer beregnes ut fra den angitte konsentrasjonen av stamløsningen. Se tabell 2 for tilberedning av vitaminstamoppløsning. For alle medier, tilsett reagenser til 900 ml dobbeltdestillert H2O, pH til det angitte nivået, og tilsett deretter vann til et endelig volum på 1000 ml. * = Legg til etter sterilisering. ** = pH med 1 M KOH. = pH med 1 M NaOH. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Vitaminaksjer for Plantago medium. Alle vitaminer må filtersteriliseres og merkes nøyaktig før lagring. Der det er indikert, oppløs pulverene først i 1 N NaOH, og utfør deretter ønsket volum med dobbeltdestillert H2O. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Mangelen på en transformasjonsprotokoll for planter i slekten Plantago begrenser bruken av disse plantene som modeller, spesielt når forskere er interessert i å utforske genfunksjoner. P. lanceolata ble valgt for å utvikle en genetisk transformasjonsprotokoll fordi den er den mest studerte planten i slekten16. Protokollen som er utviklet, vil sannsynligvis bli brukt som et verktøy for å fremme studier relatert til vaskulær biologi, økologi, plante-insekt-interaksjoner og abiotisk stressfysiologi.

Protokollen som presenteres skisserer tydelig trinn som tillater en bruker å skaffe transgene planter. Foruten P. lanceolatas evne til å trives i et vevskulturmiljø, bidro flere faktorer til suksessen til vår transformasjonsmetode. Først ble viktigheten av å bruke høy kvalitet, sterilt planterotvev for transformasjon observert. Røtter hadde de høyeste transformasjonsratene når de ble tatt fra 3-4 uker gamle planter, og virket grønne eller blekhvite. Røtter tatt fra bokser med en hvilken som helst mengde bakteriell eller soppforurensning resulterte ofte i forurensede skytekulturer, og eldre røtter som virket brune resulterte ikke i vellykket transformasjon. Rotvev var den mest effektive vevstypen for transformasjon med dagens metode, da blad- og petiolevev ikke lyktes med å utvikle skudd.

En annen viktig observasjon var at den optimale metoden for å samle rotvev for transformasjon var å plassere nykuttet rotmateriale i sterilt vann. Dette trinnet tillot effektivt rotmateriale å forbli hydrert mens resten av vevet ble samlet, da røtter har en tendens til å tørke ut raskt når de fjernes fra vekstbeholderne. Dette trinnet bidro også til å øke suksessraten for transformasjonen, fordi det tillot flere røtter å bli inkubert i bakteriene på en gang.

Denne protokollen kan endres ved å redusere tiden rotvevet inkuberer i samkulturmediet til 2 dager. Det ble observert at en 2 eller 3 dagers inkubasjonsperiode er tilstrekkelig til å tillate infeksjon som resulterer i skuddinitialer. Imidlertid anbefales ikke lengre inkubasjonstider, siden det ble observert at fraværet av en antibiotikainhibitor i media ofte resulterer i A. tumefaciens overvekst, noe som kan drepe det fremvoksende vevet.

En begrensning av denne studien er mangelen på tilgjengelige data om ytelsen til andre metoder eller arter av A. tumefaciens i P. lanceolata transformasjon for sammenligning. Så vidt vi vet er denne protokollen ny. Under de første forsøkene ble det observert en høy transformasjonseffektivitet med A. tumefaciens GV3101, og vi fokuserte på å raffinere teknikken ved hjelp av denne stammen i stedet for å eksperimentere med andre stammer. Vår transformasjonseffektivitet på 20% er relativt høy for anleggstransformasjon - mange konvensjonelle metoder anser alt >1% for å være vellykket26,27,28. Imidlertid kan bruk av en annen stamme av A. tumefaciens, som A. rhizogenes, kjent for bruk i rottransformasjon i flere arter 29,30,31, resultere i en enda høyere suksessrate. Ytterligere eksperimentering ville være nødvendig for å vurdere virkningen av å bruke andre stammer for å fremme økt transformasjonseffektivitet i P. lanceolata.

Den vellykkede transformasjonen av P. lanceolata vil trolig være til nytte for mange fagområder. Den høye transformasjonseffektiviteten, og den raske veksten av planten i vevskulturmedier, gjør P. lanceolata til en mulig kandidat for genfunksjonsstudier15.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation (EDGE IOS-1923557 til CZ og YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 mL Round Bottom TubeA4A2:A34 ThermoFisher Scientific 150268
1-Naphthylacetic acid Gold Biotechnology N-780
3M Micropore Surgical Paper Tape ThermoFisher Scientific 19-027761
50 mL Centrifuge Tubes Research Products International Corp. 163227LC
600 Watt High Pressure Sodium Lights Plantmax PX-LU600
6-Benzylaminopurine (6-BAP) Gold Biotechnology B-110
Aluminum Foil  ThermoFisher Scientific 01-213-100
Bacto Agar  Thermofisher Scientific 214010
Binary Plasmid pBI101 Clontech, USA  632522
Cool White Grow Light Sylvania LLC Home Depot 315952205
D-biotin ThermoFisher Scientific BP232-1
ddH2O
DH5a E. coli  Invitrogen, USA  18258012
Disposable Petri Dishes, Sterile 150 x 16 mm ThermoFisher Scientific FB0875712
Disposable Petri Dishes, Sterile 95 x 15 mm ThermoFisher Scientific FB0875714G
Dissecting Scissors Leica Biosystems 38DI12044
Ethanol 200 Proof Decon Labs 2705
Folic Acid Fisher Scientific BP2519-5
Forceps Leica Biosystems 38DI18031
Gelrite Research Products International Corp. G35020-1000
Glycerol ThermoFisher Scientific 17904
Glycine Sigma  241261
Incubated Tabletop Orbital Shaker ThermoFisher Scientific SHKE420HP
Indole-3-Acetic Acid (IAA) Gold Biotechnology I-110
Indole-3-Butyric Acid (IBA) Gold Biotechnology I-180
Kanamycin Monosulfate Gold Biotechnology K-120
Macrocentrifuge  ThermoFisher Scientific 75007210
Magenta Boxes ThermoFisher Scientific 50255176
Micro Pipet Tips 1000 µL Corning 4140
Micro Pipet Tips 200 µL Corning 4138
Micro Pipette Tips 10 µL Corning 4135
Microcentrifuge  ThermoFisher Scientific 75002410
Micropipettor 0.5-10 µL Corning 4071
Micropipettor 100-1000 µL Corning 4075
Micropipettor 20-200 µL Corning 4074
Micropipettor 2-20 µL Corning 4072
Murashige & Skooge Basal Medium with Vitamins PhytoTech M519
Murashige & Skooge Basal Salt Mixture PhytoTech M524
myo-Inositol Gold Biotechnology I-25
Nicotinic acid Sigma N0761-100g
Parafilm (paraffin film)  ThermoFisher Scientific S37440
Potassium Hydroxide (KOH) Research Products International Corp. P44000
Pyridoxine HCl Sigma P6280-10g
Scalpel Blade Handle Leica Biosystems 38DI36419
Scalpel Blades Leica Biosystems 3802181
Sodium Chloride, Crystal (NaCl) Mallinckrodt Chemicals 7581-06
Sodium Hydroxide (NaOH) Research Products International Corp. S24000
Sodium Hypochlorite Walmart 23263068401
Soil- Bark Mix Berger, USA BM7
Square Pots (3.5 inches squared) Greenhouse Megastore CN-TRK-1835
Sucrose Research Products International Corp. S24060
Thermocycler ThermoFisher Scientific A24811
Thiamine HCl Sigma T4625-5G
Timentin Ticarcillin/Clavulanate (15/1) (Timentin) Gold Biotechnology T-104
trans-Zeatin Riboside (ZR) Gold Biotechnology Z-100
Tryptone Thermofisher Scientific 211705
Wild Type Plantago lanceolata seeds Outsidepride Seed Source, OR, USA F1296 Outsidepride.com
Yeast Extract Granulated Research Products International Corp. Y20025-1000 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. The Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
  2. Bragg, J. N., Anderton, A., Nieu, R., Vogel, J. P. Brachypodium distachyon. Agrobacterium Protocols. , Springer. New York, NY. 17-33 (2015).
  3. Chang, C., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Field guide to plant model systems. Cell. 167 (2), 325-339 (2016).
  4. Müller, B., Grossniklaus, U. Model organisms-a historical perspective. Journal of Proteomics. 73 (11), 2054-2063 (2010).
  5. Ding, X., et al. Different fruit-specific promoters drive AtMYB12 expression to improve phenylpropanoid accumulation in tomato. Molecules. 27 (1), 317 (2022).
  6. Niedbała, G., Niazian, M., Sabbatini, P. Modeling agrobacterium-mediated gene transformation of tobacco (Nicotiana tabacum)-a model plant for gene transformation studies. Frontiers in Plant Science. 12, 695110 (2021).
  7. Kumari, D., Prasad, B., Dwivedi, P. Genome Editing Platforms in Rice (Oryza sativa L.): Basic methodology and troubleshooting. , (2022).
  8. Zhang, B. Agrobacterium-mediated transformation of cotton. Transgenic Cotton. , Humana Press. Totowa, NJ. 31-45 (2013).
  9. Tiwari, R., Singh, A. K., Rajam, M. V. Improved and reliable plant regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation in soybean (Glycine max L). Journal of Crop Science and Biotechnology. , 1-10 (2022).
  10. Bakhsh, A. Development of efficient, reproducible and stable Agrobacterium-mediated genetic transformation of five potato cultivars. Food Technology and Biotechnology. 58 (1), 57-63 (2020).
  11. Bates, R., Craze, M., Wallington, E. J. Agrobacterium-mediated transformation of oilseed rape (Brassica napus). Current Protocols in Plant Biology. 2 (4), 287-298 (2017).
  12. Hopp, H. E., Spangenberg, G., Herrera-Estrella, L. Plant transformation. Frontiers in Plant Science. 13, 876671 (2022).
  13. Abdelmuhsin, A. A., Alghamdi, A. A., Ibrahim, N. A. Assessing the phenotypic and genotypic variations of Plantago ciliata in Ha'il region, Saudi Arabia. Entomology and Applied Science Letters. (1), 14-22 (2021).
  14. Coleman, N. Plantago Lanceolata. Botanical Bulletin. 1 (11), 45 (1876).
  15. Huang, J., et al. Tissue-specific transcriptomic profiling of Plantago major provides insights for the involvement of vasculature in phosphate deficiency responses. Molecular Genetics and Genomics. 294 (1), 159-175 (2019).
  16. Penczykowski, R. M., Sieg, R. D. Plantago spp. as models for studying the ecology and evolution of species interactions across environmental gradients. The American Naturalist. 198 (1), 158-176 (2021).
  17. Pommerrenig, B., et al. Common plantain. A collection of expressed sequence tags from vascular tissue and a simple and efficient transformation method. Plant Physiology. 142 (4), 1427-1441 (2006).
  18. Bergero, R., Levsen, N., Wolff, K., Charlesworth, D. Arms races with mitochondrial genome soft sweeps in a gynodioecious plant, Plantago lanceolata. Molecular Ecology. 28 (11), 2772-2785 (2019).
  19. Aalto, E. A., Koelewijn, H. P., Savolainen, O. Cytoplasmic male sterility contributes to hybrid incompatibility between subspecies of Arabidopsis lyrata. G3: Genes, Genomes, Genetics. 3 (10), 1727-1740 (2013).
  20. Bloch, K. D., Grossmann, B. Digestion of DNA with restriction endonucleases. Current Protocols in Molecular Biology. 3 (1), (1995).
  21. Du, C., et al. Prokaryotic expression, purification, physicochemical properties and antifungal activity analysis of phloem protein PP2-A1 from cucumber. International Journal of Biological Macromolecules. 194, 395-401 (2022).
  22. Deshmukh, S. 22, Kulkarni, R., Bose, K. Transformation and protein expression. Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant Proteins. , Springer. Singapore. 83-114 (2022).
  23. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, Academic Press. 299-309 (2013).
  24. Broehan, G., Kroeger, T., Lorenzen, M., Merzendorfer, H. Functional analysis of the ATP-binding cassette (ABC) transporter gene family of Tribolium castaneum. BMC Genomics. 14, 6 (2013).
  25. Dong, Z., et al. Stable transformation of fluorescent proteins into Nosema bombycis by electroporation. Parasites & Vectors. 15 (1), 141 (2022).
  26. Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246 (2017).
  27. Manimaran, P., et al. Infection of early and young callus tissues of indica rice BPT 5204 enhances regeneration and transformation efficiency. Rice Science. 20 (6), 415-426 (2013).
  28. Wang, J., Nie, J., Pattanaik, S., Yuan, L. Efficient Agrobacterium-mediated transformation of Artemisia annua L. using young inflorescence. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant. 52 (2), 204-211 (2016).
  29. Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in soybean. Plants. 11 (8), 1044 (2022).
  30. Geng, S., et al. An efficient root transformation system for CRISPR/Cas9-based analyses of shoot-root communication in cucurbit crops. Horticulture Research. 9, (2022).
  31. Xiao, Y., et al. Efficient Agrobacterium-mediated genetic transformation using cotyledons, hypocotyls and roots of 'Duli'(Pyrus betulifolia Bunge). Scientia Horticulturae. 296, 110906 (2022).

Tags

Tilbaketrekking utgave 193
<em>Agrobacterium tumefaciens-mediert</em> genetisk transformasjon av smalbladet plantain
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Levengood, H., Dou, Y., Fan, J.,… More

Levengood, H., Dou, Y., Fan, J., Bajszar, A., Huang, J., Abbas, S. M., Zhou, Y., Zhang, C. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain. J. Vis. Exp. (193), e64777, doi:10.3791/64777 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter