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Bioengineering

采用多转染的细胞状态识别电路的快速开发

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64793
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,3
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

Summary

复杂的基因回路在设计、测试和优化方面非常耗时。为了促进这一过程，哺乳动物细胞的转染方式允许在单个孔中测试电路组件的多个化学计量。该方案概述了实验计划、转染和数据分析的步骤。

Abstract

哺乳动物遗传回路已经显示出感知和治疗各种疾病状态的潜力，但电路组件水平的优化仍然具有挑战性和劳动密集型。为了加速这一过程，我们的实验室开发了多转染，这是传统哺乳动物转染的高通量扩展。在多转染中，转染群体中的每个细胞基本上执行不同的实验，测试不同DNA拷贝数下的电路行为，并允许用户在单罐反应中分析大量化学计量。到目前为止，已经证明了优化单孔细胞中三组分电路比例的多转染;原则上，相同的方法可用于开发更大的电路。多转染结果可以轻松用于找到瞬时回路中DNA与共转染的最佳比例，或为产生稳定细胞系的电路组分选择表达水平。

在这里，我们演示了如何使用多转染来优化三组分电路。该方案从实验设计原则开始，并解释了多转染如何在传统共转染方法的基础上进行构建。接下来，进行细胞的多转染，几天后进行流式细胞术。最后，通过检查对应于具有特定成分比例的细胞亚群的单细胞流式细胞术数据切片来分析数据。在实验室中，多转染已被用于优化细胞分类器、反馈和前馈控制器、双稳基序等。这种简单但强大的方法加快了哺乳动物细胞中复杂遗传回路的设计周期。

Introduction

哺乳动物合成生物学领域发展迅速，从在培养细胞系中开发简单的感知和反应部分到优化复杂的基因网络，以应对诊断和治疗方面的现实挑战1。这些精密电路能够检测从microRNA谱到细胞因子再到小分子药物的生物输入，并实现逻辑处理电路，包括晶体管、带通滤波器、拨动开关和振荡器。他们还在癌症，关节炎，糖尿病等疾病的动物模型中显示出有希望的结果1，2，3，4，5。然而，随着电路复杂性的增加，优化其每个组件的电平变得越来越具有挑战性。

一种特别有用的遗传回路类型是细胞分类器，它可以被编程为感知和响应细胞状态。在特定细胞状态下选择性生产蛋白质或RNA输出是指导和编程细胞和类器官分化，识别和破坏患病细胞和/或不良细胞类型以及调节治疗细胞功能的有力工具1，2，3，4，5.然而，在哺乳动物细胞中创建能够准确分类来自多个细胞RNA和/或蛋白质物种的细胞状态的回路一直极具挑战性。

开发细胞分类回路最耗时的步骤之一是优化环内单个组分基因（如传感器和处理因子）的相对表达水平。为了加快电路优化并允许构建更复杂的电路，最近的工作使用细胞分类器电路及其组件的数学建模来预测最佳组成和拓扑6，7。虽然到目前为止这已经显示出强大的结果，但数学分析受到需要系统表征电路中组件基因的输入输出行为的限制，这非常耗时。此外，在复杂的遗传回路中可能会出现无数与上下文相关的问题，导致完整回路的行为违背基于单个部分特征的预测8，9。

为了更快地开发和测试复杂的哺乳动物电路，如细胞状态分类器，我们的实验室开发了一种称为多转染10的技术，这是质粒共转染方案的演变。在共转染中，将多个质粒DNA物种与带正电荷的脂质或聚合物试剂络合在一起，然后以相关方式递送到细胞（图1A）。在多转染中，质粒与试剂单独复合，使得每个转染复合物的DNA以去相关方式递送到细胞（图1B）。使用这种方法，转染群体中的细胞暴露于携带不同电路组件的两个或多个DNA有效载荷的多种比例组合中。

为了测量输送到每个细胞的电路元件的比例，多转染中的每个转染复合物都包含一个组成型表达的荧光报告基因，该荧光报告基因可作为细胞摄取复合物的代表。不含哺乳动物细胞内任何活性元素的填充DNA用于调节单个转染复合物中递送到细胞的荧光报告基因和电路元件的相对量，并在讨论中更详细地讨论。Weiss实验室中使用的填充DNA的一个例子是包含终止子序列的质粒，但没有启动子，编码序列等。然后可以比较具有不同电路组件比例的细胞，以找到基因回路功能的最佳比例。这反过来又为选择启动子和其他电路元件提供了有用的预测，以便在将电路组分组合到单个载体中进行遗传整合（例如，慢病毒、转座子或着陆垫）时达到最佳基因表达水平。因此，多转染不是根据 直觉或通过耗时 的试错过程来选择电路组件之间的比率，而是在单罐反应中评估遗传部分之间的各种化学计量。

在我们的实验室中，多转染已经优化了许多遗传回路，包括细胞分类器、反馈和前馈控制器以及双稳态基序。这种简单但强大的方法大大加快了哺乳动物细胞中复杂遗传回路的设计周期。此后，多转染已被用于表征多个遗传电路，以高分辨率10揭示其多维输入输出传递函数，优化细胞状态分类11的替代电路拓扑，并加速各种已发表的12，13 和正在进行的项目。

在这里，我们描述并使用多转染快速优化遗传电路的工作流程（图2）。该实验方案展示了如何生成高质量的多转染数据，并避免多转染方案和数据分析中的几个常见错误（图3）。然后演示如何使用多转染来表征简单的电路元件，并在此过程中将多转染结果与共转染进行基准比较（图4）。最后，多转染结果表明癌症分类器电路的优化（图5）。

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Protocol

注意：表 1 和 表2 是该协议的重要参考。表 1 显示了反应的试剂缩放， 表2 显示了方案中描述的示例多转染（上半部分）和可能的后续实验（下半部分）的DNA比率算术。

1. 制备转染用细胞

  1. 在开始方案之前，确保人胚胎肾（HEK293）细胞的培养为60%-80%汇合。为此，2天前在100mm x 15mm组织培养培养皿中接种1 x 106 细胞，并在37°C下用5%CO2孵育。
    注意：虽然我们的实验方案侧重于HEK293细胞，但其他细胞类型可能会被替代。
  2. 如下所述准备用于转染的培养基和细胞。
    1. 将至少 20 mL 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 溶液与 10% 胎牛血清 （FBS） 和 1% 非必需氨基酸 （NEAA;参见 材料表） 预热至 37 °C。 将至少 2.4 mL 胰蛋白酶和 2.4 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 预热至 37 °C。预热还原血清培养基至~16°C。
      注意：所有组织培养工作都应在生物安全柜中小心进行。
  3. 如下所述将细胞重悬于DMEM溶液中。
    1. 吸出并处理当前介质。将 2 mL PBS 分配到 HEK293 细胞培养物上以洗涤细胞。吸出并处理 PBS。
    2. 将 2 mL 胰蛋白酶分配到 HEK293 细胞培养物中。将培养皿置于37°C的培养箱中3分钟或直到细胞不再粘附在培养皿上。将培养皿放回生物安全柜中，通过将 8 mL DMEM 溶液分配到板中来稀释细胞溶液。
    3. 通过轻轻上下移液几次来混合溶液。吸出所有培养基并将其放入 15 mL 锥形管中。
  4. 将细胞以300 x g 离心3分钟以沉淀它们。吸出培养基（注意不要吸出细胞）并丢弃它。将细胞重悬于 5 mL DMEM 溶液中，通过轻轻上下移液进行混合。
  5. 使用自动细胞计数器（在 材料表中列出）估计当前的细胞浓度。在具有1 x 105 个细胞的24孔板中接种六个孔（在本例中）（接种密度为50，000个细胞/ cm2）。
  6. 加入最多 500 μL 的 DMEM 溶液（首先将 DMEM 溶液添加到孔中），然后每次处理标记一个孔，如下所示：无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、NeonGreen 对照、全颜色对照和多转染 1。TagBFP、mKO2和NeonGreen对照孔是多转染中所有荧光蛋白的单色对照。

2. 进行转染

  1. 为每个DNA聚集体准备试管。留出 1.5 mL 微量离心管，并将试管标记为：无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、NeonGreen 对照、全色对照、多转染混合物 1 和多转染混合物 2。
    1. 向无颜色对照、mKO2 对照、TagBFP 对照、NeonGreen 对照和所有颜色对照管中加入 36 μL 还原血清培养基。向各多转染混合物 1 和多转染混合物 2 管中加入 18 μL 还原血清培养基。
      注意：假设质粒浓度为150ng / μL。
    2. 将 600 ng 填充质粒添加到无颜色对照管中。向mKO2颜色对照管中加入300ng的mKO2和300ng的填充质粒。向 TagBFP 颜色对照管中加入 300 ng 的 TagBFP 和 300 ng 的填充质粒。
    3. 向NeonGreen颜色对照管中加入300ng组成型NeonGreen质粒和300ng填充质粒。向全色对照管中加入 mKO2、TagBFP 和组成型 NeonGreen 各 100 ng，以及 300 ng 填充质粒。
    4. 将 150 ng mKO2 加入聚转染混合物 1 管中。将 75 ng 的报告基因 NeonGreen 质粒和 75 ng 填充质粒加入多转染混合物 1 管中。
    5. 将 150 ng TagBFP 加入聚转染混合物 2 管中。将 75 ng 的 L7ae 质粒和 75 ng 的填充质粒加入到多转染混合物 2 管中。
  2. 将 216 μL 还原血清培养基与 9.48 μL 转染试剂混合，在 1.5 mL 微量离心管中创建转染预混液（试剂比例和反应规模见 表 1 ）。上下移液充分混合，放在一边。
  3. 向每个无色对照管、单色对照管和所有颜色对照管中加入 1.58 μL 增强剂试剂。向每个聚转染混合管中加入 79 μL 增强剂试剂。通过剧烈移液单独混合每个试管。
  4. 将转染预混液添加到每个含有DNA的试管中。
    1. 向无色对照管、单色对照管和所有色控管中加入37.58 μL转染预混液。通过剧烈移液单独混合每个试管。
    2. 向每个多转染混合管中加入 18.79 μL 转染预混液。通过剧烈移液单独混合每个试管。
  5. 将转染混合物分配到孔中。
    1. 将无色、单色和全色对照的每种转染混合物移液 65.97 μL 到相应的孔中。
    2. 将 32.98 μL 的聚乙烯转染混合物 1 移入多转染孔中，沿平坦表面以紧密的八字形模式快速、轻柔地旋转板，以有效分布复合物。然后，将 32.98 μL 的多转染混合物 2 移液到同一聚转染孔中，并以相同的方式旋转板。
  6. 将板置于37°C的培养箱中，用5%CO2 并且不摇动，持续48小时。
    注意：为了提高细胞活力，可以在转染后每6小时更换一次细胞培养基（尽管这并不总是必要的，并且对于HEK293细胞及其衍生物，更换培养基时必须注意不要将细胞从板上分离）。
试剂 量 缩放
用于DNA混合物的还原血清培养基 每个对照管 36 μL，每个多转染管 18 μL 每管 0.05 μL 降低血清培养基/ng DNA，额外 10-20% 体积用于移液
脱氧核糖核酸 每管 300-600 ng
P3000系列 每个对照管 1.58 μL，每个聚转染管 0.79 μL 每管 0.0022 μL P3000/ng DNA，额外含 10-20%
用于脂质预混液的还原血清培养基 每个对照管 36 μL，每个多转染管 18 μL 0.05 μL 降低血清培养基/ng 总 DNA，额外 10-20% 体积用于移液
转染和增强剂试剂 每个对照管 1.58 μL，每个聚转染管 0.79 μL 0.0022 μL 脂质菌胺 3000/ng DNA，含额外 10-20%

表1：转染试剂缩放。 该表显示了单个孔中包含的DNA数量的试剂的正确比例。这可用于有效地调整反应规模并形成预混液。试剂数量已扩大到包括20%的过量。

3. 制备流式细胞术用细胞

  1. 将至少 4.2 mL 的 DMEM 溶液预热至 37 °C。 将至少 4.2 mL 胰蛋白酶和 4.2 mL PBS 预热至 37 °C。 将荧光激活细胞分选（FACS）缓冲溶液保持在4°C直至准备使用。
  2. 将细胞重悬于FACS缓冲溶液（PBS补充有1%BSA，5mM乙二胺四乙酸[EDTA]和0.1%叠氮化钠[NaN3]，以减少结块;参见 材料表）如下所述。
    1. 吸出并处理每个孔中的当前介质。将 5 mL PBS 分配到每个孔中以洗涤细胞。吸出并处理 PBS。
    2. 将 5 mL 胰蛋白酶分配到每个孔中。将板置于37°C的培养箱中3分钟，或直到细胞不再粘附在培养皿上。将板放回生物安全柜，并通过向每个孔中分配 5 mL DMEM 溶液来稀释细胞溶液。
    3. 对于每个孔，通过轻轻上下移液几次来混合溶液。对于每个孔，吸出所有培养基并将其放入 15 mL 锥形管中。
  3. 将细胞以300 x g 离心3分钟以沉淀它们。吸出培养基，注意不要吸出细胞并将其丢弃。在每个试管中，将细胞重悬于 5 mL FACS 缓冲溶液中，通过轻轻上下移液进行混合。
  4. 将每个细胞悬液通过过滤器（去除团块）放入单独的流式细胞术锥形管中。将这些试管放在冰上不超过1小时，并尽快进行流式细胞术。

4. 流式细胞术

注意：操作流式细胞仪需要适当的培训和必要任务的知识。由于软件和设备可能有所不同，并且用户应接受一般培训，因此本节是指有用的特定操作。

  1. 首先，检查用填充质粒对照（无颜色对照）转染的细胞，以选择细胞特征并避免异常（包括聚集体、碎片等）。虽然有许多参数组合可以区分像元，但请使用以下三个常规选项作为可视化区分要素的好方法。
    1. 查看侧向散射区域（每个首选项/像元类型的对数或线性刻度）与前向散射区域（线性刻度）。
    2. 查看侧散射高度（对数刻度）与侧散射宽度（线性刻度）。
    3. 查看前向散射宽度（线性刻度）与前向散射高度（线性刻度）。
  2. 接下来，查看单色控件。使用全颜色控制来调节仪器电压，以便将来自每个荧光蛋白的信号归一化为等效的任意荧光单位（a.u.）。接下来，运行每种荧光蛋白的单色对照，用于设置补偿基质，允许渗漏校正。
    注意：理想情况下，荧光值的整个动态范围应该是可见的。荧光蛋白信号的进一步归一化 可以通过转换为标准化 单位来完成（例如，等效荧光素分子[MEFL;参见Beal等人.15]）。要在分析过程中启用MEFL转换，请运行彩虹校准珠。这种校准对于减少仪器间和日常信号变化也很有用16。
  3. 运行多转染样品管。
    注意：在可能的情况下，建议运行1，000 x 10^（^ =混合）细胞，因为在分析过程中需要将高维多转染细分为更多箱，并且每个箱需要足够的细胞（理想情况下>10）才能进行具有统计学意义的比较。

5. 进行实验后分析

  1. 首先，使用来自对照（以及磁珠（如果适用）的数据来确保准确的结果。使用可用的软件工具之一进行活细胞门控（使用上述门）、补偿和自发荧光校正。
    注意：我们通常使用自定义 MATLAB 代码（例如 https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis 或 Cytoflow17），该代码具有图形用户界面和适用于预处理阶段和多转染分析的 python 库。
方法 复杂 ng荧光标记 ng L7ae （馏分） 吴报告员（分数） ng 填充物 DNA（分数） 总计（纳克）
多转染 1 600
→ 1 150 75 (½) 75 (½) 300
→ 2 150 75 (½) 75 (½) 300
多转染 2 600
→ 1 150 25 (1/6) 125 (5/6) 300
→ 2 150 125 (5/6) 25(1/6) 300

表2：方案中演示的多转染DNA量，以及调谐质粒比例的示例后续实验。 表格的上半部分显示了简单多转染实验中使用的质粒组成。下半部分显示了更新实验的组成，该实验调整质粒比率以更好地对假设的浓度空间进行子采样，其中基因表达调节剂相对于其报告基因处于更理想的 1：5 比率，产生更多转染细胞来采样该比率。

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Representative Results

在 图1中，我们比较了共转染与多转染。在共转染中，所有质粒都在同一转染混合物中递送，导致任何单个细胞接收的每个质粒的量之间存在高度相关性（图1A）。虽然递送到每个细胞的总质粒数量差异很大，但整个群体中单个细胞中两种报告蛋白的荧光密切相关，表明两种质粒以相当恒定的比例共同递送。转染的细胞可能摄取很少或许多复合物，但由于每个复合物都有相关数量的每个质粒，因此共转染仅探索两个质粒之间浓度空间的一个小对角线区域。相反，在多转染中，质粒以多种转染复合物递送，导致不同转染混合物中质粒的去相关递送（图1B）。转染的细胞摄取复合物的不同组合，导致细胞含有来自两种、一种或两种复合物的不同剂量的质粒。

图2显示了具有代表性的多转染工作流程。通常，多转染实验包括以下步骤：确定问题、创建转染混合物、孵育细胞、流式细胞术和分析。如果初始多转染结果无法精确缩小最佳部分比例，则还有一个可选步骤，即使用优化的部件比例重复多转染。协议中概述了这些步骤。

在图3中，提供了一些性能良好的共转染和多转染示例以及常见错误。图3A显示了一种执行良好的共转染，共递送的TagBFP和表达eYFP的质粒之间具有紧密的相关性。相比之下，图3B中的共转染显示这两种质粒之间的相关性较差。在如图所示中，相关性差是由于在添加质粒之前向还原的血清培养基中添加增强剂试剂。实验中的这种不良相关性也可能是由于不同的启动子驱动荧光蛋白的表达，转染混合物创建过程中混合不良，或者允许复合物孵育太短或太长的间隔。

图3C 显示了一种性能良好的多转染，具有良好的二维空间覆盖率，并很好地补偿了荧光蛋白之间的任何光谱渗漏。 图3D 显示了活细胞数量较少的多转染数据，很难细分为足够的活细胞箱，每个活细胞箱中都有足够数量的细胞进行分析。为了改善这个问题，起始细胞群应该身体健康，没有过度生长，并且通过使用不同的转染试剂和/或转染较少的总DNA来降低实验毒性。 图3E 显示了一种转染效率较差的多转染，再次导致二维空间覆盖稀疏，无法进行分析。在这种情况下，通过形态门控的细胞数量很高，但细胞不表达荧光蛋白。为了提高效率，应优化转染试剂的选择，并严格遵守制造商的方案。每种转染混合物必须含有等量的DNA质量，确保细胞接受每种复合物的机会大致相等，并且每种转染混合物应按照试剂盒说明进行。不同的转染试剂盒最适合不同的细胞类型;应使用在感兴趣的细胞类型中提供最佳效率的试剂盒。最后，无论使用何种试剂盒，某些细胞类型都难以转染。在这些情况下，应转染更多的细胞，并在流式细胞术期间收集尽可能多的细胞，以确保有足够的细胞进行分析。 图3F 显示了多转染数据，其中一个荧光蛋白标记物清楚地显示了光谱渗漏到另一个荧光蛋白中。应始终对系统中的所有荧光蛋白运行单色对照，并用于生成补偿基质，该基质应在分析前应用于所有多转染。

首次进行多转染实验（整体或新实验系统）时，应针对标准共转染进行基准测试。一种方法是使用共转染（通过 调整DNA剂量）和多转染单独测量关键系统部件的输入-输出传递函数。

在图4中，我们展示了翻译抑制因子L7Ae的基准测试，此处改编自原始多转染出版物10。L7Ae 是一种 RNA 结合蛋白，可识别 RNA 扭结转 （KT） 基序20;当将两个KTs（2xKT）放置在mRNA的5'非翻译区（UTR）时，L7Ae21可以有效地抑制下游开放阅读框（ORF）翻译。L7Ae以前已被用于构建基于RNA的细胞类型分类器21和其他基于RNA的电路22。为了通过标准共转染测试L7Ae，可以调整不同转染混合物中编码L7Ae的质粒及其靶报告基因的比例（图4A和表3）。对于多转染，应在单独的转染混合物中独立递送组成型L7Ae和相应的2xKT报告基因，以便将各种质粒比例递送到细胞（图4B）。进行转染和流式细胞术后，可以进行数据分析。为了使数据具有可比性，可以将单个共转染结果整理到单个数据集中，然后对多转染数据执行类似的多维分箱（图4C，D）。比较L7Ae抑制输出报告基因的剂量-反应曲线可以看出，共转染和多转染数据之间每个bin的中位数输出水平非常相似（图4E-G）。

一般来说，我们已经看到，多转染数据与宽DNA比例的共转染数据相关性良好，在高度偏斜的DNA剂量比下，精度较低（部分原因是多转染实验箱中的细胞覆盖率较低，特别是对于在低质粒剂量下具有很强活性的部分）。为了提高此类敏感部分的测量精度，可以使用较弱的启动子、上游开放阅读框18或microRNA沉默介导的微调剂（miSFIT）19来降低其表达水平。

图5展示了多转染在细胞类型分类器优化中的成功应用，该分类器同样改编自Gam等人10。分类器是一种相对简单的设计，可响应miR-21-5p的表达产生输出，miR-21-5p是一种在许多肿瘤细胞中过表达的miRNA23。在没有miR-21的情况下，分类器输出被细菌衍生的转录抑制因子BM3R124抑制，其适应先前被证明在哺乳动物细胞中起作用25。当miR-21存在时，它会结合放置在BM3R1的3'和5'UTR中的四个靶位点，敲低其表达，从而允许输出转录（图5A）。为了优化该系统，三种电路组分以单独的转染混合物形式给药：（1）BM3R1（具有miR-21靶位点），（2）输出报告基因（mKO2）和（3）Gal4-VP16，其激活输出转录（表4）。请注意，输出启动器在逻辑 （Gal4-VP16） 而不是 BM3R1 上运行，即使在存在 Gal4-VP1625 的情况下也会抑制输出。每个部分分别在同一质粒上编码转染标记物TagBFP、mNeonGreen和iRFP720，以指示每种复合物的相对DNA剂量。一般来说，增加 Gal4-VP16 表达应增加报告基因 mKO2 输出，而增加 BM3R1 表达应导致较低的 mKO2 输出。由于BM3R1被miR-21-5p敲低，因此HeLa细胞中的输出表达应该更高，其miR-21-5p水平较高，因此BM3R1的表达少于HEK细胞。

在对HEK293和HeLa细胞进行多转染后，我们获得了不同质粒比例的3D分布（图5B-HEK细胞）。Gam 等人 10 通过考虑特定欧几里得距离内的细胞与感兴趣的比率，以不同的比率对该分布进行子采样;此距离应足够宽，以包含足够的像元，以便从分析中获得具有统计显著性的结果，但又应足够窄，以避免因包含三个部分的一组分量比太宽而导致不必要的噪声。Gam等人10 随后使用优化算法来确定最大化共转染分类精度的部分比例（即，转染的HeLa细胞的输出表达呈阳性，而转染的HEK细胞则不是）。零件的最佳配比为10.9：1.5：1：Gal4-VP16：输出：BM3R1;在整个多转染空间内以最佳比例进行亚采样的细胞如图 5C所示。该子采样预测，在该比率下，共转染电路在对HEK293与HeLa细胞进行分类时具有91%的特异性，62%的灵敏度和77%的准确度（图5D）。将质粒比例设置为此最佳值的共转染可产生更好的结果：特异性为99%，灵敏度为68%，准确率为84%10。此外，这些比率指导了单质粒版本的电路的实施，通过使用不同的截短启动子和上游ORF（uORF）调整相对表达，产生具有91%特异性，90%灵敏度和90%准确度的电路10。因此，多转染是更广泛地指导细胞分类器和基因回路设计的有力工具。

Figure 1
图 1：共转染和多转染的比较。 （A，B） 质粒递送与两个质粒共转染和两个质粒多转染的概述和比较。对于每种转染方法，最左边的图表显示了带负电荷的DNA和带正电荷的脂质之间转染复合物的形成。在这些示例中，每个彩色质粒（蓝色和红色）编码不同荧光蛋白的表达。中心图显示了质粒递送到细胞的示例，以及直方图或散点图中预期分布的示意图。直方图上的颜色强度对应于相应质粒颜色的荧光。最右边的图表显示了使用每种给定方法转染的细胞的真实数据。（A）在与两种不同质粒共转染时，在加入转染试剂之前将两种质粒混合在一起，从而形成两种质粒种类的高度相关的包装。在实际的共转染数据中，细胞表现出两种质粒的相关递送（右）。（B）在多转染中，每组对应于电路部分和转染标记物的共递送质粒分别与转染试剂混合，得到仅包含这些质粒的复合物（左）。在实际的多转染数据中，细胞探索广泛的浓度空间，同时探索许多不同的质粒化学计量（右）。这个数字是从10修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 2
图 2：多转染工作流程。 第 1 步：定义问题。从具有多个零部件的系统开始，其部件之间的理想比率未知，然后选择零部件之间的起始比率。第 2 步：创建转染混合物。每种转染混合物包含一个电路元件和一个荧光转染标记物。输送到细胞的电路部分的量与标记物的荧光相关。第 3 步：孵育细胞。在典型的工作流程中，我们在转染和流式细胞术之间孵育细胞48小时。第 4 步：流式细胞术。运行相应的控件，如协议中所述，然后运行示例。第5步：分析使用转染标记物根据细胞接收的部位的数量或比例对细胞进行分箱。使用输出蛋白测量电路性能。查找优化电路性能的器件的箱/比率。第 6 步：重复优化的零件比（可选）。如果最佳分瓶/比例处于高度偏斜的比例，则中试多转染可能无法精确缩小最佳部分比例。使用调谐的部分比例重复多转染，这样接受等量的每种转染混合物的细胞现在获得接近最佳比例的部件，如前一轮确定的那样。这个数字是从10修改而来的。培养箱的图像来自施维雅医学艺术，细胞仪的图像来自BioRender。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：具有代表性的阳性和阴性多转染结果 。 （A）两个荧光报告基因的共转染表现良好，显示出紧密的相关性。此处和 （B） 中总共绘制了 20，000 个单元格以进行比较。在开始多转染实验之前，最好对两个荧光报告基因进行类似的小型试验共转染，以确保质粒在转染混合物中具有良好的相关性。（B）噪声较大的共转染：质粒在每个转染混合物中的相关性不高，这可能导致多转染中的荧光标记物成为质粒比值的不良标志物。（C） 良好的多转染结果显示良好的细胞计数、转染效率和补偿。（D）活细胞计数低，不允许将子采样到具有统计学显着细胞数量的箱中。（E）转染效率差，不允许对具有统计学显着数量的细胞的箱子进行子采样。（F）缺乏适当的补偿，这导致荧光数据不能很好地代表系统中荧光蛋白的量。使用单色控件确定理想的线性补偿矩阵，并在进一步处理之前将其应用于数据。根据软件的选择，还建议使用所有颜色控件。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 4
图 4：多转染与共转染的基准测试。 （A）在共转染中，可以在每个实验孔中测试翻译抑制子L7Ae与荧光报告质粒的比例。（B）在多转染中，可以在同一孔中测试L7Ae与报告基因的许多比率。有关多转染质粒混合物的详细信息，请参见表3。（中，四）分箱工作流程，用于将多转染与多个共转染进行基准测试。为每个转染标记尺寸分配了总共10个双指数间隔的箱，其近似于两个质粒中每个质粒的水平。这里显示了表示不同水平质粒#2的箱。对一组经过整理的11个不同质粒比例的共转染样品（C）和来自单个多转染的数据（每个样品由约500，000个细胞（D））进行分档。颜色对应于由基因 2 （TagBFP） 水平定义的箱组。（E-G）对代表性电路的多转染与共转染进行基准测试。评估每个箱中细胞的中位输出荧光，并比较代表性系统L7Ae翻译抑制的方法。（E）用于测量L7Ae活性的结构。mKO2荧光用于估计L7Ae（基因#1）的递送，而TagBFP荧光用于估计调节的mNeonGreen输出（基因#2）的递送。（F） L7Ae的多维滴定曲线。每行代表 TagBFP 一级的箱集，如 （C） 和 （D） 所示。实线表示多转染数据，虚线表示共转染数据。在报告质粒的每个分档水平上，报告基因输出随着L7Ae的增加而降低。（G） L7Ae系统的共转染和多转染之间的视觉比较。每个点代表多转染和共转染测量的相应箱中的测量输出，其中更多的等效值更接近红色的1：1线。总体而言，在多转染和共转染衍生之间观察到的差异很小，这为多转染方法的可靠性提供了信心。这个数字是从10修改而来的。请点击此处查看此图的大图。

Figure 5
图 5：多转染的数据分析。 在多转染中，可以将细胞分组到箱或切片中进行分析。 图4 展示了一种分析形式，其中细胞被分箱成与系统组件水平（例如报告质粒水平）相对应的切片，这对于模型拟合和理解剂量反应非常有用。另一个有用的策略是分析不同比例的电路元件的电路性能。（A） 用于优化的分类器电路图。TagBFP、NeonGreen 和 iRFP720 的水平分别对应于 BM3R1、输出 mKO2 和 Gal4-VP16 的水平。有关多转染质粒混合物的详细信息，请参见 表4 。（B）多转染混合物的实验设置。（C）从（A）中的电路进行多转染收集的流式细胞术数据。三种报告荧光蛋白中每种蛋白的水平作为回路多转染到HEK细胞的结果，显示了数据中存在的广泛的电路成分比例。HEK和HeLa细胞的电路转染也获得了类似的结果。（D） 以特定比例对聚转染进行子采样。为了分析数据，我们扫描了电路组件之间的大量比率，并确定了每个比率的分类器性能。例如，我们在这里展示了一个表现出良好性能的特定比率（Gal4-VP16 = 435 ng DNA 报告基因，报告基因 = 60 ng，BM3R1 = 40 ng）。蓝色标示的是三种不同电路元件的荧光标记的相应比例。接下来，我们通过仅考虑与荧光轨迹的特定欧几里得距离内的点来对数据进行子采样。我们从HEK和HeLa转染中以相同的轨迹对细胞进行子采样。（E）HEK和HeLa细胞中相同轨迹下的电路性能比较。通过比较许多比率的灵敏度、特异性和分类准确性等统计数据，可以优化成分比率以生成理想的遗传回路。这个数字是从10修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。

复杂 ng L7Ae 质粒 吴报告质粒 优化内存 （微升） P3000 （微升） 脂质 3000 （微升）
1 250 75 1.5 1.5
2 250 75 1.5 1.5

表3：与图4对应的转染混合物。 HEK293细胞在24孔板的一个孔中用这些转染混合物进行多转染。

复杂 ng BM3R1质粒 ng Gal4-VP16质粒 吴报告质粒 优化内存 （微升） P3000 （微升） 脂质 3000 （微升）
1 900 75 1.5 1.5
2 900 75 1.5 1.5
3 900 75 1.5 1.5

表4：与 图5对应的转染混合物。 HEK293和HeLa细胞分别在6孔板的一个孔中与这些转染混合物进行多转染。

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Discussion

计算机辅助设计 （CAD）、试验板和 3D 打印等快速原型制作方法彻底改变了机械、电气和土木工程学科。快速搜索针对给定挑战的许多可能解决方案的能力极大地加快了该领域的进展。我们相信多转染是生物工程的类似技术，能够快速制作基因回路的原型。此外，其他快速原型技术需要对多种可能的解决方案进行手动顺序迭代，而多转染能够同时探索多种解决方案。多转染可以在单个孔中测试大量遗传回路成分比例组合，并已用于优化多个已发表的遗传电路10，11，13。该实验方案是标准共转染的简单扩展，允许许多哺乳动物细胞研究人员直接采用。通常，聚转染和共转染结果之间的一致性非常接近10（图4就是一个例子）。因此，多转染可用于大多数在共转染混合物中滴定质粒比率并在单细胞水平测量输出的情况。

多转染的复杂性和规模随着遗传回路优化的复杂性而增加。随着要分析的维度数量的增加，不同部分的组合比率及其分析所需的单元格数量呈指数级增长。例如，为了优化 图5中的分类器，以6孔板格式转染细胞，并收集至少150万个活细胞的数据。我们还优化了带有附加电路组件10的分类器，需要以10厘米的板规模转染并收集数百万个细胞。在这种规模及以上，DNA生产非常耗时，转染试剂也很昂贵。也就是说，与在单个孔中测试相当数量的电路元件比例组合相比，多转染使用的细胞、DNA和转染试剂要少几个数量级。此外，通过减少几个数量级的转染混合物，可以节省大量时间。

多转染为流式细胞术数据提供了先进的分析方法。两种主要方法是（1）根据每个转染标记物的表达分箱细胞和（2）以规定的转染标记比例提取细胞，从而模拟共转染。前者为每个复合物（以及每个部分）选择具有特定DNA剂量组合的细胞，产生输入 - 输出传递函数。后者为每个部分选择特定比例的DNA剂量的细胞，模拟质粒DNA质量数比例的共转染。在子采样选择中绘制电路输出报告器的表达式电平，可以测量定义输入电平或比率下的输出。对于电路优化，可以确定由电路目的定义的最佳性能箱/比率 - 对于细胞分类器，这些是电路在目标细胞类型中打开，在非目标细胞类型中关闭的箱/比率。在选择箱尺寸时，应考虑所需的精度水平以及每个箱的单元格数量。较小的箱子更精确地关注电路元件的理想组合，但如果箱的电池太少，可能会给测量带来不良噪声。

未来对多转染数据计算分析的改进可能有助于优化，即使每个箱/比率的细胞覆盖率较低。目前，我们从小于设定的单元格阈值（例如，10）的箱中排除数据，以避免过度嘈杂的测量。结合重复测量，可以更准确和精确地计算剂量反应曲线、分类器精度和基于每个箱定义的其他指标。然而，聚转染中的每个细胞都可以被认为是一个独立的实验，以精细的分辨率测量精确输入电平的电路输出。考虑到这一点，剂量反应和回路优化的机制和表型模型可以直接适应每个标记和报告基因的基因表达分布，而不是它们的分箱汇总统计10。这样可以实现更可靠的测量，并利用每个实验收集的许多单个数据点。因此，这种建模方法即使在稀疏采样的高维多转染中也可以产生预测电路表征和优化。此外，机器学习方法（如响应面方法和随机森林回归）可用于分析相对稀疏的高维数据10。

对于越来越大的多转染，另一种方法是使用多转染的层次结构按顺序优化电路。在这种方法中，首先，使用多转染来优化由更大电路中的遗传组分子集组成的模块。然后，这些优化的模块作为单独的多转染混合物提供，从而能够找到每个电路模块的最佳比例/剂量。这种方法使用的细胞、DNA和转染试剂数量明显较少。然而，相对于其他元件，组件组不一定是模块化的，因此在较大的电路环境中，单独测量的模块中组件的最佳比例可能不是最佳的8。

多转染方法还受到用于收集数据的流式细胞仪的激光/滤光片配置的限制。除了测量的荧光输出外，每种转染混合物还含有荧光蛋白标记物。因此，选择可以在细胞仪上得到良好补偿的荧光蛋白至关重要。我们之前在五激光流式细胞仪（BD LSRFortessa）上系统地分析了一组22种荧光蛋白的渗漏，发现Sirius，TagBFP，mNeonGreen，mKO2和iRFP720的集合可以一起使用并很好地补偿，而不会出现重大问题10。然而，较大电路的优化可能需要先进的细胞术方法，例如光谱细胞术来分离具有更多重叠光谱的荧光蛋白，我们的实验室目前正在使用多达八种荧光蛋白进行优化。诸如荧光蛋白数据库（https://www.fpbase.org）之类的数据库可用于选择具有特定光谱重叠的荧光蛋白。然而，这个过程可能会因各种因素而变得复杂，其中一些因素特定于特定的细胞仪。例如，仅在某些激光/滤光片配置中，使用某些红色蛋白质（如tdTomato）可能会导致不希望的渗入蓝色通道10。此外，几种远红蛋白已显示出DNA剂量与荧光输出10之间的非线性关系，从而减少了它们作为DNA剂量的有效标记物的使用。

为了在不同数量的复合物（一种、两种、三种等）上进行的实验的一致性，每次转染混合物使用相同的分数质粒是有用的。例如，如果测试一个三基因系统，每个基因编码在三个质粒（A、B和C）之一中，则可以以1：1：1的比例与编码转染标记物的质粒的等比例共转染电路质粒。这将使每个质粒占混合物总质量的四分之一，因此大约是形成的每个转染复合物质量的四分之一。当使用自己的报告基因在单独的复合物中多转染A、B和C时，与其将质粒与报告基因1：1混合或保持其总DNA质量数，不如将每个质粒保持在每种复合物质量数的四分之一，填充DNA占据剩余质量数（示例见 表5 ）。这是因为转染细胞中基因表达的分布不太依赖于复合物中递送的DNA的总质量，而更多地取决于每种复合物中DNA的分数量10。如果需要1：1：1以外的比例，则计算每个部分的转染混合物中总DNA质量数的相应分数。例如， 表 5 [底部] 显示了 1：1：4 的比例。

方法 复杂 纳克 A （分数） ng B （分数） 纳克 C （分数） 吴报告员（分数） ng 填充物 DNA（分数） 总计（纳克）
共转染 1 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 150 (¼) 0 (0) 600
多转染 600
→ 1 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 2 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
→ 3 50 (¼) 50 (¼) 100 (½) 200
共转染 1 75 (⅛) 75 (⅛) 300 (½) 150 (¼) 0 (0) 600
多转染 600
→ 1 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 2 25 (⅛) 50 (¼) 125 (⅝) 200
→ 3 100 (½) 50 (¼) 50 (¼) 200

表5：使用填充DNA提高共转染和多转染实验一致性的示例。 这里显示了两个具有相同量填充DNA的共转染三个质粒的通用示例。在上面的示例中，质粒的质量都相等。在底部示例中，与其他质粒相比，一个质粒以更高的质量递送。用于共转染复合物的总DNA部分被转化为多转染复合物，剩余的DNA量（每个复合物的总量，在复合物之间是固定且相等的）由填充DNA构成。

填充DNA的总体目标是保持每个细胞相似剂量的质粒，无论独特的转染混合物数量如何。作为该原理的粗略近似，与包含所有三种质粒的单一混合物相比，将三个质粒分成三种混合物，同时保持每种质粒的相同DNA质量（以及适当的转染试剂比例），可将接受给定复合物的细胞百分比降低三分之一。然而，每个转染的细胞随后接受~3倍的基因剂量。因此，在没有填充DNA的情况下单独减少质粒的相对量不足以保持一致的质粒剂量，因为这只会降低转染效率，而不会改变转染细胞中表达的基本分布10。另一方面，填充DNA允许在不影响整体转染效率的情况下调整DNA剂量（尽管可检测的转染细胞可能会因信号降低而降低）10。按照上述粗略近似值，将多转染混合物中的DNA比例降低到三分之一，并添加填充DNA可保持与原始共转染相比的相对基因剂量。因此，填充DNA可确保高效、准确地形成转染复合物。

为了改变其报告基因所覆盖的目标基因的表达范围，可以相对于报告基因调整用于驱动基因的每个测试质粒和/或启动子的比例。如果一个部分在低DNA剂量下具有强/高活性，则使用较低的DNA级分可以帮助将部分的动态范围集中在转染细胞中报告基因荧光分布的中间。同样，对于弱/仅在高DNA剂量下具有活性的部分，使用更高的部分可能是有用的。然而，必须注意这种调整，因为与报告基因10相比，过多地减少DNA组分会增加细胞递送的随机性，并且高基因表达水平会使细胞基因表达机制过载12，14。为了避免随机性，并且在每个基因以固定比率递送到细胞的情况下（例如，如果电路要生成为单个lenti，PiggyBac或Landing Pad载体），可以使用更强/更弱的启动子，小uORFs 18和/或miSFITs19来调整每个基因的相对表达。

虽然实验方案描述了一种反向转染技术，但正向转染也可以进行多转染。在反向转染中，细胞同时接种和转染;在正向转染中，细胞在首次铺板后~24小时以大约用于反向转染的密度的一半转染（以允许在转染时进行细胞分裂）。一般来说，反向转染效率更高，但毒性也更大，我们注意到基于试剂、转染时间和细胞系的转染分布形状存在一些差异。因此，应针对每个细胞系优化选择的转染方法，以最大限度地提高转染细胞的数量和每个细胞质粒剂量的多维浓度空间的覆盖率。

总体而言，多转染能够快速优化哺乳动物的遗传回路。电路元件的许多可能的比例组合可以在单个孔中轻松测试。此外，由于聚转染比传统转染包含更多关于系统中每个部分水平的信息，因此已发现它对于表征各种遗传部分的行为非常有价值10，11，12，13。多转染的采用有望加快开发用于哺乳动物细胞的新的和改进的基因回路的步伐。

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Disclosures

R.W.是Strand Therapeutics和Replay Bio的联合创始人;R.W.和R.J.申请了与细胞类型分类器相关的临时专利。

Acknowledgments

我们要感谢前Weiss实验室成员，他们领导或贡献了多转染方法的开发及其在细胞分类器中的应用：Jeremy Gam，Bre DiAndreth和Jin Huh;其他为进一步的方法开发/优化做出贡献的Weiss实验室成员：徐文龙，王磊和Christian Cuba-Samaniego;Josh Leonard教授和小组成员，包括Patrick Donahue和Hailey Edelstein，用于测试多转染并提供反馈;以及 Nika Shakiba 教授邀请此手稿并提供反馈。我们还要感谢美国国立卫生研究院[R01CA173712， R01CA207029， P50GM098792];美国国家科学基金[1745645];癌症中心支持（核心）拨款[P30CCA14051，部分]来自NCI和美国国立卫生研究院[P50GM098792]，用于资助这项工作。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15mL Corning Falcon conical tubes ThermoFisher Scientific 14-959-53A
24-well petri dish Any company of choice (Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin NEB B9000S
Centrifuge Any company of choice Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides ThermoFisher Scientific C10228
Cytoflow Non-commercial software package https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEM VWR 10-013-CV Use the correct media for your cell type
EDTA  ThermoFisher Scientific 03690-100ML
Fetal bovine serum Sigma Aldrich F4135
HEK cells ATCC CRL-1573 Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells ATCC CRL-12401 Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer ThermoFisher Scientific L3000001 Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer BD Biosciences N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution Gibco 11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL Any company of choice
Opti-MEM ThermoFisher Scientific 31985070 reduced serum medium
Phosphate buffered saline ThermoFisher Scientific 70011044
Rainbow calibration beads Spherotech URCP-100-2H
Sodium azide Sigma Aldrich S2002
Trypsin VWR 25-053-CI

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References

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生物工程，第192期，合成生物学，遗传电路，细胞分类器，高通量优化，遗传回路快速原型，转染，流式细胞术分析
采用多转染的细胞状态识别电路的快速开发
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Wauford, N., Jones, R., Van De Mark, C., Weiss, R. Rapid Development of Cell State Identification Circuits with Poly-Transfection. J. Vis. Exp. (192), e64793, doi:10.3791/64793 (2023).

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