Summary
Cet article présente une nouvelle méthode pour la synthèse d’hydrogels de matrice extracellulaire cartilagineuse décellularisée (DC-ECM). Les hydrogels DC-ECM ont une excellente biocompatibilité et fournissent un microenvironnement supérieur pour la croissance cellulaire. Par conséquent, ils peuvent être des échafaudages cellulaires et des systèmes d’administration biologique idéaux.
Abstract
Les hydrogels de matrice extracellulaire cartilagineuse décellularisée (DC-ECM) sont des biomatériaux prometteurs pour l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative en raison de leur biocompatibilité et de leur capacité à imiter les propriétés naturelles des tissus. Ce protocole vise à produire des hydrogels DC-ECM qui imitent étroitement l’ECM natif du tissu cartilagineux. Le protocole implique une combinaison de perturbation physique et chimique et de digestion enzymatique pour éliminer le matériel cellulaire tout en préservant la structure et la composition de l’ECM. Le DC-ECM est réticulé à l’aide d’un agent chimique pour former un hydrogel stable et biologiquement actif. L’hydrogel DC-ECM a une excellente activité biologique, une structure spatiale et une fonction d’induction biologique, ainsi qu’une faible immunogénicité. Ces caractéristiques sont bénéfiques pour favoriser l’adhésion, la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires et pour créer un microenvironnement supérieur à la croissance cellulaire. Ce protocole constitue une ressource précieuse pour les chercheurs et les cliniciens dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Les hydrogels biomimétiques peuvent potentiellement améliorer le développement de stratégies efficaces d’ingénierie tissulaire pour la réparation et la régénération du cartilage.
Introduction
L’ingénierie du tissu cartilagineux est un domaine en plein développement qui cherche à régénérer le tissu cartilagineux endommagé ou malade1. L’un des principaux défis dans ce domaine est le développement d’échafaudages biomimétiques capables de soutenir la croissance et la différenciation des chondrocytes, les cellules responsables de la production du cartilage2. L’ECM du tissu cartilagineux joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement des chondrocytes. DC-ECM est un échafaudage efficace pour les applications d’ingénierie tissulaire3.
Un certain nombre de techniques ont été développées pour produire de la DC-ECM à partir de tissu cartilagineux, y compris des méthodes chimiques, enzymatiques et physiques. Cependant, ces méthodes aboutissent souvent à la génération d’hydrogels ECM insuffisamment biomimétiques, ce qui limite leur potentiel d’utilisation dans les applications d’ingénierie tissulaire 4,5. Il est donc nécessaire de disposer d’une méthode plus efficace pour produire des hydrogels DC-ECM.
Le développement de cette technique est important car il peut faire progresser le domaine de l’ingénierie tissulaire en fournissant une nouvelle approche pour créer des échafaudages biomimétiques qui peuvent soutenir la régénération et la réparation des tissus. De plus, cette technique pourrait être facilement adaptée pour produire des hydrogels ECM à partir d’autres tissus, élargissant ainsi ses applications potentielles.
Dans l’ensemble de la littérature, il y a eu un intérêt croissant pour l’utilisation de la DC-ECM comme échafaudage pour les applications d’ingénierie tissulaire6. De nombreuses études ont démontré l’efficacité des hydrogels DC-ECM dans la promotion de la croissance et de la différenciation cellulaires dans divers tissus, dont le cartilage 7,8. Par conséquent, le développement d’un protocole pour la production d’hydrogels DC-ECM qui imitent étroitement l’ECM naturelle du tissu cartilagineux est une contribution significative au domaine.
Le protocole présenté dans cet article répond à ce besoin en fournissant une nouvelle méthode de production d’hydrogels DC-ECM qui imitent étroitement l’ECM naturelle du tissu cartilagineux. Le protocole consiste à décellulariser le tissu cartilagineux, à isoler l’ECM résultante et à créer un hydrogel en réticulant l’ECM avec un polymère biocompatible. L’hydrogel qui en résulte a montré des résultats prometteurs dans le soutien de la croissance et de la différenciation des chondrocytes.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital Tongde de la province du Zhejiang.
1. Préparation de l’hydrogel DC-ECM
NOTE : Dans cette étude, le cartilage a été obtenu à partir des articulations du genou de porcs miniatures Bama âgés de 12 mois, évitant ainsi la collecte de tissu osseux.
- Prenez le cartilage collecté, bloquez-le et coupez-le en3 morceaux de 1 à 2 mm avec un scalpel.
- Placez 20 g de cartilage haché dans un tube à centrifuger de 50 mL et ajoutez 20 mL de tampon hypotonique Tris-HCl (10 mM de Tris-HCl, pH 8,0) pour immerger complètement le tissu. Placez le tube à centrifuger dans un congélateur à −80 °C pendant 3 h, puis dans un four à 37 °C pendant 3 h. Répétez l’étape de congélation et de chauffage six fois. Dans cette étape, le tampon hypotonique Tris-HCl n’a pas besoin d’être remplacé.
- Agiter le tube de centrifugation pendant 30 s à l’aide d’un mélangeur vortex à une vitesse de 1 000 tr/min. Placez un tamis en acier inoxydable (taille des pores : ~250 μm) sur un nouveau tube à centrifuger de 50 ml.
- Décantez lentement le cartilage décellularisé dans le tamis en acier inoxydable, lavez le tissu trois fois avec du PBS stérile et collectez le cartilage.
- Ajouter 10 mL de solution de trypsine (0,25 % de trypsine dans le PBS) et placer le tube sur un shaker à 37 °C pendant 24 h. Pendant cette période, remplacez la trypsine toutes les 4 h. Filtrez la suspension à l’aide du tamis en acier inoxydable et conservez les tissus. La trypsine peut être traitée pendant la nuit pendant l’un des processus de digestion, et cela n’affectera pas la digestion finale.
- Laver le tissu trypsinisé avec un tampon hypertonique (1,5 M de NaCl, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6).
- Ajouter 10 mL de solution de nucléase (50 U/mL de désoxyribonucléase et 1 U/mL de ribonucléase dans 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5) et placer le tube sur un agitateur à 37 °C pendant 4 h.
- Retirez la solution de nucléase, lavez le cartilage trois fois avec du PBS stérile et ajoutez une solution hypotonique de Tris-HCl. Placez le tube à centrifuger sur un shaker et rincez pendant 20 h à température ambiante (RT).
- Retirez la solution hypotonique de Tris-HCl, lavez le cartilage trois fois avec du PBS stérile et ajoutez une solution de Triton X-100 à 1 % pour immerger le tissu pendant 24 h.
- Retirez la solution Triton X-100 et rincez abondamment le cartilage décellularisé avec de l’eau distillée pendant 3 jours, en changeant l’eau distillée toutes les 12 h.
- Faire tremper le cartilage dans une solution d’acide peracétique (0,1 % d’AAP dans 4 % d’éthanol) pendant 4 h. Retirez la solution d’acide peracétique et lavez le cartilage trois fois avec de l’eau distillée stérile.
- Placez le tamis en acier inoxydable (taille des pores : ~250 μm) sur un tube à centrifuger de 50 ml. Décantez lentement le cartilage décellularisé dans le tamis en acier inoxydable et collectez le cartilage. Testez le degré de décellularisation et la rétention matricielle du cartilage en estimant la teneur en ADN, en collagène et en glycosaminoglycane (GAG).
- Mettez le cartilage décellularisé dans un bol de broyage, ajoutez de l’azote liquide et broyez le cartilage décellularisé pour former une poudre. Prélever 2 g de poudre de cartilage décellularisé, ajouter 80 mL d’acide acétique 0,5 M et 20 mg de pepsine, et digérer pendant 24 h. Centrifuger à 400 x g pendant 10 min ; jeter le sédiment et recueillir la solution surnageante (solution DC-ECM).
- Décanter 1 mL de solution DC-ECM par puits dans des plaques à 6 puits. Placez les plaques à 6 puits dans un lyophilisateur. Congelez la solution DC-ECM. Une fois que la température dans le lyophilisateur descend à −40 °C, allumez la pompe à vide et maintenez le degré de vide à 10 Pa pendant 22 h.
- Retirez la solution DC-ECM lyophilisée, placez-la dans des tubes à centrifuger et conservez-la à −20 °C. La durée minimale de stockage de la solution DC-ECM lyophilisée dépasse six mois.
- Ajouter 1 mL d’eau distillée stérile pour dissoudre 20 mg de solution DC-ECM lyophilisée dans le tube à centrifuger. Agiter pendant 1 min à l’aide d’un mélangeur vortex à une vitesse de 1 000 tr/min à RT. Ajouter 1 mg de vitamine B2 (0,1 % p/v) à la solution DC-ECM, incuber à 37 °C pendant 60 min et irradier avec une lumière UV (370 nm, 3,5 mW/cm2) pendant 3 min pour former un hydrogel (hydrogel DC-ECM).
2. Détection du cartilage décellularisé
- Détection du contenu en ADN du cartilage décellularisé
REMARQUE : Extrayez l’ADN à l’aide du kit de sang et de tissus DNEasy.- Tout d’abord, prenez 20 mg de cartilage DC-ECM dans un tube à centrifuger. Ajouter 180 μL de Buffer GTL et 20 μL de Protéinase K par oscillation vortex, et incuber le cartilage à 56 °C pendant 4 h jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous.
- Agiter le tube de centrifugation pendant 15 s à l’aide d’un mélangeur vortex à une vitesse de 1 000 tr/min à RT. Ensuite, ajoutez 200 μL de Buffer GL et d’éthanol anhydre, et mélangez soigneusement par vibration vortex. Centrifuger les échantillons pendant 1 min à une vitesse de 6 000 x g à 4 °C.
- Ajouter 500 μL de tampon GW1 dans la colonne d’adsorption et centrifuger les échantillons pendant 1 min à une vitesse de 12 000 x g à 4 °C. Ajouter 500 μL de tampon GW2 dans la colonne d’adsorption et centrifuger à 20 000 x g à 4 °C pendant 1 min. Enfin, ajoutez 50 μL d’eau stérilisée dans la colonne d’adsorption et centrifugez pendant 1 min à une vitesse de 6 000 x g à 4 °C pour recueillir la solution d’ADN. Déterminer la teneur en ADN à l’aide d’un spectrophotomètre.
- Détection de la teneur en collagène dans le cartilage décellularisé
- Pour détecter la teneur en collagène dans le cartilage décellularisé, utilisez l’hydroxyproline comme marqueur d’acides aminés de collagène. Acidifier 5 mg de cartilage décellularisé avec 5 mL d’acide chlorhydrique 6 M à 100 °C pendant 20 min, puis le neutraliser avec 5 mL d’une solution d’hydroxyde de sodium 6 M.
- Calculer la teneur en hydroxyproline en mesurant l’absorbance de l’échantillon à 570 nm à l’aide d’un spectrophotomètre. Obtenir une régression linéaire concentration-absorption à l’aide de l’échantillon standard d’hydroxyproline.
- Détection du contenu en GAG dans le cartilage décellularisé
REMARQUE : La teneur en GAG dans le cartilage DC-ECM a été détectée à l’aide d’un kit de détection quantitative colorimétrique GAG tissulaire. Tous les réactifs ci-dessous sont disponibles dans le kit.- Prenez 200 mg de poudre de cartilage DC-ECM et ajoutez 500 μL de réactif A par oscillation vortex. Incuber l’échantillon à 4 °C pendant 16 h, puis centrifuger à 14 000 x g pendant 10 min.
- Prélever 50 mL de solution d’échantillon et ajouter 50 μL de solution à haute teneur en sel (réactif B) et 50 μL de solution acide (réactif C) par oscillation vortex. Incuber l’échantillon pendant 10 min.
- Ajouter 750 μL de solution colorante (réactif D) par oscillation vortex, et incuber l’échantillon pendant 30 min dans des conditions d’obscurité. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 10 min, puis jeter le surnageant.
- Ajouter 1 μL de solution de nettoyage (réactif E) et bien mélanger. Centrifuger l’échantillon à 14 000 x g pendant 10 min et jeter le surnageant.
- Ajouter 1 μL de solution de dissociation (réactif F) à l’échantillon et bien mélanger. Incuber l’échantillon pendant 30 min dans des conditions d’obscurité. Enfin, déterminer la teneur en GAG à l’aide d’un spectrophotomètre à 600 nm.
- Analyse au microscope électronique à balayage (MEB) et au microscope électronique à transmission (MET) du cartilage décellularisé
- Comparez le cartilage décellularisé et le tissu cartilagineux normal. Placez l’échantillon dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 %, incubez à 4 °C pendant la nuit, puis lavez-le trois fois avec du PBS.
- Fixez l’échantillon dans de l’OsO4 à 1 % pendant 1 h, puis lavez-le trois fois avec du PBS.
- Déshydrater l’échantillon par immersion séquentielle dans de l’éthanol à 50 %, 70 %, 90 % et 100 %, ainsi que de l’acétone à 100 % pendant 15 min chacun. Placer l’échantillon dans une solution mixte d’hexaméthyldisilazane et d’éthanol (1 :1) pendant 15 min, suivi d’une immersion dans de l’hexaméthyldisilazane pur pendant 15 min.
- Placez l’échantillon dans un séchoir HCP-2, puis séchez-le à l’aide d’azote liquide. Ensuite, enduisez l’échantillon entièrement séché d’une fine couche d’or-palladium à l’aide d’un revêtement par pulvérisation cathodique et imagez à l’aide d’un MEB. Le revêtement par pulvérisation cathodique a été effectué à une puissance de 120 W pendant 5 min. L’expérience a été réalisée dans les conditions suivantes : une tension de fonctionnement de 15 kV et un degré de vide inférieur à 5 x 10−5 Pa.
- Pour l’analyse MET, placer l’échantillon dans un mélange d’acétone anhydre et de résine (1 :1) pendant 1 h, suivi d’un mélange d’acétone anhydre et de résine (1 :3) pendant 3 h. Ensuite, placez l’échantillon dans de la résine pendant la nuit.
- Placez l’échantillon dans des capsules remplies de milieu et chauffez à 70 °C pendant 9 h.
- Après l’enrobage, coupez l’échantillon en tranches minces de 70 nm à l’aide d’un microtome ultrafin et placez-le sur une maille de cuivre.
- Pipeter 20 μL de solution de coloration à l’acétate d’uranyle sur la maille de cuivre et colorer pendant 15 min à RT. Retirez la solution de coloration en lavant doucement la maille deux fois avec de l’eau distillée.
- Ensuite, appliquez 20 μL de solution de coloration au citrate de plomb sur la maille de cuivre et colorez pendant 15 minutes à RT. Lavez la maille trois fois avec de l’eau distillée.
- Placez la maille de cuivre sur une boîte de Pétri propre tapissée de papier filtre. Après le séchage à l’air libre, photographiez les sections à l’aide de la MET et de la MET. La sonde a été appliquée avec une force descendante de 500 nN, balayée à une vitesse de 1 Hz et avait une constante élastique (valeur k) de 40 Nm-1. Le rayon de la pointe de la sonde a été mesuré à 8 nm.
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Representative Results
Pour préparer un meilleur hydrogel de cartilage DC-ECM, nous avons étudié et passé en revue la littérature précédente et comparé les différents protocoles de décellularisation en termes de taux de décellularisation, d’immunogénicité et de fonctionnalité mécanique9.
Sur cette base, nous avons préparé l’hydrogel cartilagineux DC-ECM et exploré l’effet d’une bio-encre d’exosome de cellules souches mésenchymateuses à matrice extractive orientée radialement dans le traitement des défauts ostéochondrals. Les résultats ont montré que l’hydrogel cartilagineux DC-ECM avait une faible immunogénicité et pouvait améliorer la migration cellulaire et favoriser la réparation du cartilage10.
Au cours des dernières années, nous avons optimisé la préparation du cartilage DC-ECM. Nous avons préparé le cartilage décellularisé en utilisant les étapes expérimentales ci-dessus. Les résultats ont montré que la teneur en ADN était éliminée dans le cartilage décellularisé par rapport à celle du cartilage natif (p < 0,001, Figure 1A). Le test à l’hydroxyproline a indiqué que la teneur en collagène était similaire entre les cartilages natifs et décellularisés (p = 0,48, Figure 1B). Le test DMMB a montré que le glycosaminoglycane était bien retenu dans le cartilage décellularisé par rapport au cartilage natif (p = 0,68, Figure 1C). De plus, le MEB et le MET ont été utilisés pour observer l’ultrastructure de la MCC-DC (Figure 1D).
Pour préparer un hydrogel DC-ECM, la solution DC-ECM lyophilisée a été solubilisée pour une concentration finale de 2 % en poids. De plus, la solution DC-ECM a été mélangée avec du VB2, suivie d’une réticulation induite par les UVA (370 nm) (Figure 2A). Nous avons placé la solution DC-ECM et l’hydrogel DC-ECM dans des tubes de microcentrifugation (Figure 2B). Lorsque les tubes étaient inversés, l’hydrogel contenu dans les tubes ne s’écoulait pas vers le fond, ce qui était un signe de gélification. Le temps de gélification de la solution DC-ECM basée sur l’auto-assemblage du collagène à 37 °C sans agent de réticulation était d’environ 15 min (Figure 2C). La viscosité et le module dynamique de la solution DC-ECM et de l’hydrogel ont été testés. Nous avons constaté que la viscosité de la solution de l’hydrogel DC-ECM était supérieure à celle de la solution DC-ECM, et des taux de cisaillement plus élevés étaient associés à une viscosité de solution plus faible (Figure 2D). De plus, le module de stockage de la solution DC-ECM et de l’hydrogel était beaucoup plus élevé que le module de perte, ce qui indique qu’ils avaient tous deux les propriétés d’un gel plutôt que d’un liquide (Figure 2E). Notamment, après réticulation et lyophilisation, la taille des pores de la solution DC-ECM et de l’hydrogel DC-ECM, mesurée par MEB, a diminué de 137,672 μm à 37,936 μm (p < 0,00195, Figure 2F,G).
Figure 1 : Préparation et caractérisation du cartilage décellularisé. Le cartilage décellularisé a été comparé au cartilage natif. (A-C) Quantification de la teneur en ADN, collagène et glycosaminoglycane (GAG). n = 5, ***p < 0,001 (test t de l’étudiant). Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois. (D) Structures microscopiques du cartilage natif et du cartilage décellularisé photographiées au MEB et au MET. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation et caractérisation de l’hydrogel DC-ECM. Sous la lumière ultraviolette, la solution DC-ECM et le VB2 se sont réticulés et ont formé un hydrogel DC-ECM. (A) Structures moléculaires et synthèse de l’hydrogel DC-ECM. L’apparence, la caractérisation et les propriétés mécaniques ont été comparées entre la solution DC-ECM et l’hydrogel DC-ECM. (B) Les images de la solution DC-ECM et de l’hydrogel DC-ECM dans des tubes de microcentrifugation. (C) Le temps de gélification de l’hydrogel DC-ECM et de l’hydrogel DC-ECM/VB2. n = 3, ***p < 0,001 (test t de l’étudiant). (D) La viscosité et le module dynamique (E) de la solution DC-ECM et de l’hydrogel DC-ECM. (F) Structures microscopiques de la solution DC-ECM et de l’hydrogel (faible et fort grossissement). Barres d’échelle = 100 μm. (G) Taille des pores de la solution DC-ECM et de l’hydrogel. n = 5, ***p < 0,001 (test t de l’étudiant). Toutes les expériences ont été réalisées au moins trois fois. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole fournit une approche systématique pour la préparation d’hydrogels de matrice extracellulaire cartilagineuse décellularisée qui imitent étroitement la MEC native du tissu cartilagineux. Le protocole implique une combinaison de perturbations physiques, chimiques et enzymatiques pour éliminer le matériel cellulaire tout en préservant la structure et la composition de l’ECM. Les étapes critiques du protocole comprennent l’ajustement du temps et des méthodes de décellularisation et la garantie d’une décellularisation complète.
Comparé à d’autres méthodes existantes d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative, ce protocole offre plusieurs avantages. Les hydrogels DC-ECM ont une excellente activité biologique, une structure spatiale et une fonction d’induction biologique, ainsi qu’une faible immunogénicité, et ces caractéristiques sont bénéfiques pour favoriser l’adhésion, la prolifération, la différenciation et la migration cellulaires11. Les hydrogels DC-ECM peuvent également être utilisés pour l’administration de médicaments et le traitement des défauts cartilagineux12.
Une modification qui peut être apportée à ce protocole est l’utilisation de différents agents de réticulation pour améliorer les propriétés mécaniques de l’hydrogel. Par exemple, des matériaux nanométalliques peuvent être utilisés pour améliorer les propriétés mécaniques de l’hydrogel13. De plus, la concentration de riboflavine et les temps d’exposition aux rayons UV peuvent être optimisés pour contrôler les résistances à la compression et à la traction de l’hydrogel.
Malgré ses nombreux avantages, cette technique présente certaines limites qui doivent être prises en compte. L’une des limites est que le processus de décellularisation peut causer des dommages à l’ECM, ce qui entraîne des modifications de ses propriétés mécaniques14. Une autre limite est que le processus de décellularisation peut ne pas éliminer complètement tout le matériel antigénique, ce qui entraîne une réponse immunitaire potentielle15. De plus, il est important de noter que le protocole décrit dans cet article est spécifique au tissu cartilagineux et que d’autres types de tissus peuvent nécessiter des ajustements de la méthode de décellularisation.
En termes d’applications futures, ce protocole peut être encore optimisé pour développer des hydrogels DC-ECM avec différentes résistances à la compression et à la traction. De plus, cette technique peut être appliquée à d’autres tissus pour développer des hydrogels biomimétiques pour des applications d’ingénierie tissulaire et de médecine régénérative. Dans l’ensemble, le protocole présenté dans cet article constitue une ressource précieuse pour les chercheurs et les cliniciens dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et a le potentiel d’améliorer le développement de stratégies efficaces d’ingénierie tissulaire pour la réparation et la régénération du cartilage.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été parrainé par le Plan de la médecine et des technologies de la santé de la province du Zhejiang (2019KY050), le Plan de science et de technologie de la médecine traditionnelle chinoise de la province du Zhejiang (2019ZA026), le Plan clé de recherche et de développement de la province du Zhejiang (subvention n° 2020C03043), le Plan de science et de technologie de la médecine traditionnelle chinoise de la province du Zhejiang (2021ZQ021) et la Fondation provinciale des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (LQ22H060007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL | |
| -80 °C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood &Tissue Kit | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG colorimetric quantitative detection kit | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 dryer | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | Spectrophotometer |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | Scanning electron microscope |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | Transmission electron microscope |
| Stainless steel sieve | SHXB-Z-1 | Shanghai Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| Trypsin | Gibco | 15050065 | |
| Ultraviolet lamp | Omnicure 2000 | N/A | |
| Vitamin B2 | Gibco | R4500-5G | |
| Vortex mixer | Shanghai Qiasen | 78HW-1 |
References
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