Summary
Ici, nous décrivons un protocole décrivant comment isoler les follicules ovariens humains du tissu cortical gelé-décongelé pour effectuer des analyses d’expression génique.
Abstract
L’ovaire est un organe hétérogène composé de différents types de cellules. Pour étudier les mécanismes moléculaires se produisant au cours de la folliculogenèse, la localisation des protéines et l’expression des gènes peuvent être effectuées sur des tissus fixes. Cependant, pour évaluer correctement les niveaux d’expression génique dans un follicule humain, cette structure complexe et délicate doit être isolée. Par conséquent, un protocole adapté précédemment décrit par le laboratoire de Woodruff a été développé pour séparer les follicules (l’ovocyte et les cellules de la granulosa) de leur environnement. Le tissu cortical ovarien est d’abord traité manuellement pour obtenir de petits fragments à l’aide de deux outils: une trancheuse de tissu et un hachoir à tissus. Le tissu est ensuite digéré enzymatiquement avec 0,2% de collagénase et 0,02% de DNase pendant au moins 40 min. Cette étape de digestion est réalisée à 37 °C et 5% de CO2 et s’accompagne d’un pipetage mécanique du milieu toutes les 10 min. Après incubation, les follicules isolés sont collectés manuellement à l’aide d’une pipette microcapillaire calibrée sous grossissement au microscope. Si les follicules sont toujours présents dans les morceaux de tissu, la procédure est complétée par une microdissection manuelle. Les follicules sont recueillis sur de la glace dans un milieu de culture et sont rincés deux fois dans des gouttelettes de solution saline tamponnée au phosphate. Cette procédure de digestion doit être soigneusement contrôlée pour éviter la détérioration du follicule. Dès que la structure des follicules semble compromise ou après un maximum de 90 min, la réaction est arrêtée avec une solution bloquante à 4 °C contenant 10% de sérum bovin fœtal. Un minimum de 20 follicules isolés (de moins de 75 μm) doit être recueilli pour obtenir une quantité adéquate d’ARN total après extraction de l’ARN pour la réaction en chaîne quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR). Après extraction, la quantification de l’ARN total de 20 follicules atteint une valeur moyenne de 5 ng/μL. L’ARN total est ensuite rétrotranscrit en ADNc, et les gènes d’intérêt sont analysés plus en détail à l’aide de la RT-qPCR.
Introduction
L’ovaire est un organe complexe composé d’unités fonctionnelles et structurelles, y compris les follicules dans le cortex et le stroma. La folliculométrie, le processus d’activation, de croissance et de maturation des follicules d’un état de repos primordial à un follicule mature capable d’être fécondé et de soutenir le développement embryonnaire précoce, est largement étudiée dans la recherche1. Démêler les mécanismes à l’origine de ce phénomène pourrait améliorer les soins de fertilité pour les femmes2. Les analyses sur tissus humains fixes permettent d’évaluer l’expression des protéines et la localisation des gènes au sein des unités fonctionnelles de l’ovaire 3,4. Cependant, des techniques spécifiques sont nécessaires pour dissocier les follicules du cortex environnant afin d’évaluer avec précision les niveaux d’expression génique dans les follicules ovariens. Ainsi, dans une étude précédente, une technique d’isolement des follicules a été développée pour permettre des analyses de l’expression génique directement à partir de l’unité fonctionnelle de l’ovaire5. Différentes approches ont été développées, telles que la digestion enzymatique et/ou l’isolation mécanique, ainsi que la microdissection par capture laser, qui permettent l’isolation du follicule dans un morceau de tissu 6,7,8,9. L’isolement des follicules est largement utilisé, que ce soit avec du tissu ovarien humain ou animal, pour évaluer les profils d’expression génique des follicules à tous les stades de développement10,11,12. Cependant, une procédure d’isolement optimale doit tenir compte de la structure fragile du follicule dans le cortex dense et, par conséquent, doit être effectuée avec soin pour éviter tout dommage7. Ce manuscrit décrit une procédure, adaptée d’un protocole décrit par le laboratoire de Woodruff, pour isoler des follicules humains du cortex ovarien gelé-décongelé afin d’effectuer des analyses d’expression génique13.
La première étape de l’isolement du follicule ovarien à partir de tissus humains congelés est la procédure de décongélation. Ce processus est réalisé sur la base du protocole clinique utilisé pour la greffe de tissu ovarien cryoconservé, tel que décrit précédemment14,15. Le procédé vise à éliminer les agents cryoprotecteurs en rinçant le cortex ovarien à des concentrations décroissantes du milieu. Ensuite, le tissu est fragmenté avant isolement enzymatique et mécanique pour récupérer les follicules. Les follicules à différents stades peuvent être distingués à l’aide d’un stéréomicroscope à fort grossissement et à optique de bonne qualité afin d’isoler ceux qui vous intéressent. Chaque follicule isolé est mesuré à l’aide d’une règle intégrée au microscope, et les follicules peuvent être regroupés en fonction de leur stade de développement : follicules primordiaux (30 μm), follicules primaires (60 μm), follicules secondaires (120-200 μm) et follicules antraux (>200 μm)16. Une classification plus poussée peut être effectuée en fonction de la morphologie des follicules: les follicules primordiaux ont une couche de cellules granulosa aplaties (GC), les follicules primaires ont une couche de GC cuboïdes, les follicules secondaires ont au moins deux couches de GC cuboïdes et la présence d’une cavité parmi les GC caractérise le stade antral. Lorsque les follicules d’intérêt sont sélectionnés, une extraction d’ARN est effectuée. La quantité et la qualité de l’ARN sont évaluées avant la réaction quantitative en chaîne de la polymérase en temps réel (RT-qPCR) (Figure 1).
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Protocol
Ce projet a été approuvé par le Comité d’éthique de l’hôpital Erasme (Bruxelles, Belgique). La patiente incluse dans ce protocole a subi une cryoconservation du tissu ovarien (OTC) pour la préservation de la fertilité avant l’exposition à la chimiothérapie en 2000. La patiente a signé un consentement écrit éclairé pour faire don de ses tissus congelés résiduels à la recherche à la fin de la période d’entreposage.
1. Décongélation du tissu ovarien cryoconservé
- Préparer une plaque à 6 puits contenant cinq solutions de décongélation. Le premier puits contient 5 mL de solution cryoprotectrice composée de milieu Leibovitz-15, de 0,1 mol/L de saccharose, de 1,5 mol/L de diméthylsulfoxyde (DMSO) et de 1 % d’albumine sérique humaine (HSA). Les puits suivants contiennent 5 mL de milieu Leibovitz-15 avec des concentrations décroissantes de cryoprotecteur : 1 mol/L, 0,5 mol/L et 2 x 0 mol/L de DMSO.
REMARQUE: La solution cryoprotectrice peut différer selon le protocole utilisé dans la clinique de fertilité. - Retirer un flacon contenant un fragment cortical ovarien de l’azote liquide dans le respect des règles de sécurité (gants cryogéniques, lunettes de protection et chaussures fermées) et conserver le tube à température ambiante (RT) pendant 30 s.
- Faire tremper le flacon dans de l’eau bidistillée pendant 2 min à TA en agitant doucement avant d’ouvrir le flacon sous une hotte verticale et de le transférer directement dans le premier puits de la plaque à 6 puits (sur glace).
- Transférer le fragment successivement dans chaque puits de la plaque de 6 puits, chacun contenant des concentrations décroissantes de cryoprotecteur dans 5 mL de milieu Leibovitz-15. Agiter doucement le tissu dans chaque milieu pendant 5 min (sur glace).
2. Isolement des follicules
NOTE: Toutes les expériences sont menées en utilisant des matériaux sans RNase et sous un capot vertical.
- Transférer le tissu décongelé dans une boîte de Petri grillée de 2 mm remplie de 10 mL de milieu de dissection (milieu Leibovitz-15, pyruvate de sodium [2 mmol/L], L-glutamine [2 mmol/L], HSA [0,3 %], pénicilline G [30 μg/mL] et streptomycine [50 μg/mL]). Ajustez la taille du tissu avec un scalpel si nécessaire.
REMARQUE : Selon le protocole clinique, la taille du tissu congelé peut varier de 8 mm x 4 mm x 1 mm à 4 mm x 2 mm x 1 mm. Pour ce protocole, deux bandes de 4 mm x 2 mm x 1 mm ont été utilisées. - Empilez les trois morceaux de la trancheuse à tissu, placez le fragment entre les deux blocs et coupez le fragment en deux à l’aide d’une lame, en glissant à travers les blocs pour obtenir deux fragments de 0,5 mm d’épaisseur.
- Utilisez le hachoir à tissus pour couper le fragment et obtenir des morceaux plus petits. Si nécessaire, coupez les morceaux restants manuellement avec un scalpel jusqu’à ce que le tissu soit totalement brisé.
- Transférer le tissu fragmenté dans une boîte de Petri quadrillée remplie de 7 mL de milieu de digestion (milieu de culture [milieu de McCoy’s 5A, 3 mmol / L de glutamine, 0,1% HSA, 30 μg / mL de pénicilline G, 50 μg / mL de streptomycine, 2,5 μg / mL de transferrine, 4 ng / mL de sélénium et 50 μg / mL d’acide ascorbique] complété par 0,2% de collagénase et 0,02% de DNase).
- Mettez le plat dans l’incubateur à 5% de CO2 et 37 °C. Toutes les 10 minutes, sortez la boîte de Petri de l’incubateur et rincez le tissu en le pipetant de haut en bas avec une pipette de 1 mL.
- Après 45 min d’incubation dans le milieu de digestion, placer la capsule sous un stéréomicroscope avec une plage de grossissement de 5x-6,3x, et récupérer les follicules à l’aide d’une pipette microcapillaire. Sélectionnez les follicules d’intérêt et isolez-les en les aspirant avec une pipette buccale.
REMARQUE : Le pipetage buccal doit être effectué avec soin pour éviter la perte de matière dans le tuyau et la contamination. - Si les follicules restent coincés dans un morceau de cortex, isolez-les mécaniquement avec deux seringues de 27 G en arrachant le cortex avec l’extrémité des seringues pour libérer les follicules du stroma.
REMARQUE: Ne touchez pas les follicules avec les seringues pour éviter de les endommager. - Transférer les follicules avec le microcapillaire dans une plaque à 4 puits contenant des gouttes de 15 μL du milieu de culture étalonné recouvert de 500 μL de culture huileuse (1 à 10 follicules par goutte). Cette étape maintient la viabilité du follicule pendant le processus de collecte. À la fin de la procédure, rincer les follicules deux fois pendant 5 s à chaque fois en deux gouttes de 15 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) recouverte de 500 μL d’huile de culture (sur glace).
- Prélever 20 follicules avec une quantité minimale de PBS à l’aide de la pipette buccale (maximum 10 μL) dans un tube vide et garder le tube sur de la glace.
REMARQUE: Pour la stabilité de l’ARN, il est crucial d’effectuer les étapes 2.8 et 2.9 sur la glace. Environ 20 follicules (<75 μm) sont nécessaires pour avoir suffisamment d’ARN pour la RT-qPCR standard (SYBR Green). - Après un maximum de 90 min d’incubation dans le milieu de digestion, arrêter la réaction enzymatique en ajoutant dans la boîte de Petri un excès de solution de blocage froide (4 °C) (7,5 mL) composée d’un milieu de culture supplémenté à 10% de sérum fœtal bovin (FBS).
REMARQUE: La solution bloquante peut être ajoutée dès que l’expérimentateur observe des follicules collés sur la plaque ou des follicules endommagés (forme asymétrique ou follicules de couleur plus foncée). Il est conseillé d’effectuer une isolation folliculaire dans un délai maximum de 2,5 heures pour éviter les dommages folliculaires et d’effectuer une extraction d’ARN immédiatement après l’isolement.
3. Extraction de l’ARN
NOTE: L’extraction de l’ARN est effectuée en suivant les instructions fournies avec un kit d’extraction d’ARN en adaptant les volumes d’élution.
- Suspendre les follicules isolés en ajoutant 100 μL de la solution de lyse fournie avec le kit d’extraction d’ARN au tube contenant les follicules sous une capuche chimique, et vortex à grande vitesse (2 500 tr/min) pour briser la structure des follicules. Ajouter 50 μL d’éthanol (100%) dans le tube et vortex brièvement à grande vitesse.
NOTE: Comme le tampon de lyse contient du 2-mercaptoéthanol et de l’acide thiocyanique, cette étape doit être effectuée avec prudence sous une hotte chimique. - Transférer le volume total du tube (environ 160 μL) dans une cartouche de microfiltre comprenant une colonne et un tube de collecte, et le centrifuger pendant 10 s à 16,363 x g à 4 °C. Laver la colonne avec 180 μL de solution de lavage 1, fournie avec le kit, et centrifuger le tube pendant 10 s à 16 363 x g à 4 °C.
- Ajouter 180 μL de solution de lavage 2/3, fournie avec le kit, dans la colonne et centrifuger pendant 10 s à 16 363 x g à 4 °C. Effectuez cette étape deux fois. Centrifuger le tube une dernière fois pendant 1 min pour sécher le filtre, et placer un nouveau tube de collecte sous la cartouche.
- Effectuer l’élution des acides nucléiques en deux étapes:
- Tout d’abord, ajouter 8 μL de solution d’élution chaude (75 °C) dans le filtre, attendre 1 min à TA et centrifuger pendant 30 s à 16 363 x g à 4 °C.
- Répétez cette étape avec 7 μL de solution d’élution.
REMARQUE : Le tube contenant les acides nucléiques élués doit être conservé sur de la glace. Pour éviter la contamination de l’ADN, une étape supplémentaire de dégradation de l’ADN est fortement recommandée - étape 3.5.
- Incuber le tube avec 2 UI de DNase et 1x tampon DNase pendant 20 min à 37 °C. Bloquer l’activité enzymatique avec le réactif d’inactivation de la DNase 1/10 pendant 2 min à TA.
- Centrifuger le tube pendant 1,5 min à 16 363 x g à 4 °C. Enfin, récupérez la suspension contenant l’ARN et transférez-la dans un nouveau tube.
- Évaluer la quantité d’ARN présente dans l’échantillon à l’aide d’un spectrophotomètre (logiciel NanoDrop 2000 > l’ARN > des acides nucléiques). Utiliser 1 μL de solution d’élution comme blanc et mesurer la quantité d’ARN extraite des follicules isolés avec 1 μL de solution.
- Vérifiez le rapport 260/280 pour la pureté de l’ARN (environ 2,0). Conservez l’échantillon à -80 °C ou rétrotranscrivez-le directement pour effectuer la RT-qPCR.
REMARQUE : Pour évaluer l’intégrité de l’ARN, l’échantillon peut être traité avec un système d’électrophorèse automatisé à haute résolution avant ou après la congélation à -80 °C. Dans ce travail, après rétrotranscription, la RT-qPCR a été réalisée avec le cycle suivant:
Tenir l’étage avec 20 s à 50 °C et 10 min à 95 °C
40 cycles de PCR avec 15 s à 95 °C et 1 min à 60 °C
Étage de courbe de fusion avec 15 s à 95 °C, 1 min à 60 °C, 30 s à 95 °C et 15 s à 60 °C
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Representative Results
En utilisant cette procédure d’isolement, l’expérimentateur peut récupérer des follicules de l’environnement stromal pour effectuer des analyses d’expression génique spécifiques. En fonction de la taille et de la morphologie des follicules, il est possible de différencier les différentes étapes de la folliculogenèse. L’expérimentateur peut sélectionner les follicules d’intérêt en fonction de leur taille à l’aide d’une pipette microcapillaire adaptée. En utilisant un microcapillaire de 75 μm maximum, il est possible de distinguer les follicules primordiaux et primaires des follicules secondaires, antraux et matures. De plus, l’expérimentateur peut confirmer le stade du follicule en fonction de la morphologie du follicule. Lors de l’étude de l’activation des follicules, les follicules quiescents et primaires sont sélectionnés, et environ 20 follicules sont nécessaires pour atteindre une concentration d’ARN d’environ 5 ng / μL.
Deux fragments ovariens homogénéisés (4 mm x 2 mm x 1 mm) de la même patiente ont été traités pour isoler les follicules en utilisant ce protocole (Figure 2). Après une procédure d’isolement de 1,5 h, deux populations de follicules ont été prélevées selon les stades de développement pour comparer la quantité d’ARN et mettre en évidence la pertinence de la sélection des follicules : 20 follicules de <75 μm (tube 1) et 15 follicules de <200 μm (tube 2). Ensuite, une extraction de l’ARN a été effectuée, et 4,8 ng / μL d’ARN total du tube 1 et 10,5 ng / μL d’ARN total du tube 2 ont été obtenus à l’aide d’un spectrophotomètre pour la quantification (tableau 1). À l’aide de ce système de spectrophotomètre à microvolume, le rapport 260/280 a également été mesuré pour évaluer la pureté de l’ARN. Ce rapport reflète la contamination potentielle par les protéines ou d’autres réactifs lors de l’extraction et doit être proche de 2,0 pour les échantillons d’ARN. Les rapports 260/280 étaient de 1,89 et 1,74 dans les tubes 1 et 2, respectivement, validant la pureté des échantillons (tableau 1). La qualité de l’ARN a ensuite été vérifiée en traitant les échantillons avec une électrophorèse automatisée à haute résolution. À la suite de cette procédure, le nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) a été estimé. La valeur du RIN, de 1 (dégradé) à 10 (intact), reflète le niveau de dégradation de l’ARN dans un échantillon. Les valeurs RIN étaient respectivement de 7,1 et 7,9 dans les tubes 1 et 2, validant la qualité de l’ARN de nos échantillons (tableau 1). Pour effectuer une RT-qPCR, le volume total d’ARN extrait a d’abord été rétrotranscrit en ADNc. Ensuite, 1,25 ng d’ADNc a été ajouté par puits sur une plaque de 96 puits, avec des amorces pour l’entretien ménager et les gènes cibles (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase [HPRT], Kit Ligand [KL], et facteur de différenciation de croissance 9 [GDF9]) et SYBR Green master mix17,18. Après exécution d’un cycle standard sur un système de PCR en temps réel, les seuils de cycle (Ct) obtenus étaient de 30,87 (tube 1) et 29,56 (tube 2) pour HPRT, 33,5 (tube 1) et 31,77 (tube 2) pour KL, et 30,71 (tube 1) et 30,57 (tube 2) pour GDF9 (Tableau 1).
Figure 1 : Représentation schématique de la méthode d’évaluation de l’extraction de l’ARN à partir de follicules ovariens humains isolés. Trois étapes sont décrites dans ce manuscrit : la décongélation des tissus, la procédure d’isolement, y compris le traitement mécanique et enzymatique, et l’extraction de l’ARN des follicules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Follicules prélevés suivant le protocole d’isolement. (A) Tissu cortical décongelé. (B) La trancheuse à tissus et (C) le hachoir à tissus utilisé pour fragmenter le tissu. (D-E) Images de follicules isolés récupérés observées avec un stéréomicroscope avec un oculaire 10x et une large plage de zoom (1x-6,3x); Des paramètres de grossissement de 50x-63x ont été utilisés pour l’identification des follicules primordiaux et primaires. Barres d’échelle: 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Tube | Nombre de follicules | Taille des follicules (μm) | Concentration d’ARN (ng/μL) | Rapport 260/280 | Numéro d’intégrité de l’ARN (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | < 200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tableau 1 : Seuils de pureté, RIN et cycle de deux fragments ovariens homogénéisés.
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Discussion
La cryoconservation du tissu ovarien est une approche prometteuse pour préserver la fertilité des patientes atteintes de cancer. En clinique, le tissu cortical décongelé est greffé à la patiente après la rémission, permettant la reprise de la fonction ovarienne et de la fertilité19,20. Outre l’utilisation clinique, des fragments ovariens résiduels peuvent également être donnés pour la recherche à la fin de la période de stockage afin d’étudier les mécanismes de régulation de la folliculogenèse. De plus, ce tissu est particulièrement utile pour développer des alternatives à la greffe lorsque cela n’est pas faisable, comme les systèmes de culture in vitro ou les ovaires artificiels. Cependant, les variations à la fois au sein des patients et entre eux limitent la faisabilité et la reproductibilité des expériences et l’interprétation des résultats. En effet, la densité folliculaire diminue considérablement avec l’âge, et les follicules ne sont pas répartis également entre les fragments21. Comme le nombre de fragments disponibles est limité, les tissus humains doivent être utilisés avec des techniques de pointe. Un large éventail de techniques telles que l’immunohistochimie et l’immunofluorescence, ainsi que l’hybridation in situ, peuvent être réalisées sur des tissus fixes pour évaluer la localisation des protéines et des gènes 3,18. Pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la follicululogenèse dans les unités fonctionnelles de l’ovaire à différents stades de développement, l’isolement des follicules est nécessaire.
Plusieurs études ont exploré des méthodes efficaces pour séparer les follicules des tissus environnants chez les espèces humaines et animales22. Le nombre de follicules prélevés et la qualité de l’ARN après extraction peuvent varier selon les techniques utilisées. Pour étudier l’activation des follicules (c’est-à-dire les follicules primordiaux et primaires), au moins 20 follicules combinés sont nécessaires pour effectuer la RT-qPCR standard. En utilisant des méthodes alternatives telles que l’amplification de l’ARN ou de l’ADNc ou la PCR imbriquée, il est possible de travailler avec moins de follicules23,24.
La nature dense du cortex ovarien rend l’isolation des follicules difficile, ce qui a conduit à l’utilisation de méthodes impliquant une combinaison d’isolation enzymatique et mécanique25. Différents types d’enzymes peuvent être utilisés, tels que la collagénase et la DNase26. Cependant, des études ont rapporté des dommages aux follicules après la digestion enzymatique, ce qui a eu un impact sur le développement in vitro 27,28. Pour maintenir l’intégrité des follicules, plusieurs équipes utilisent actuellement des protocoles de digestion enzymatique adaptés ou n’effectuent que des isolements mécaniques pour la culture folliculaire ultérieure 25,29,30,31. Ce manuscrit rapporte une méthode simple et efficace pour obtenir des follicules isolés pour l’analyse quantitative par PCR. Néanmoins, toutes les expériences nécessitent une courbe d’apprentissage avant d’atteindre des résultats optimaux.
À des fins de recherche fondamentale, une révision d’un protocole précédent a été élaborée pour récupérer une grande quantité de follicules sans affecter leur intégrité13. Le traitement pour l’analyse de l’expression génique est directement effectué après l’isolement afin d’optimiser la qualité de l’ARN. Il est également crucial d’éviter une digestion prolongée afin de limiter le risque de sélection de follicules dégénérés. Ainsi, l’étape de digestion reste cruciale dans ce protocole. Trois points nécessitent une attention particulière : (1) le rinçage du tissu pendant la réaction enzymatique toutes les 10 minutes pour assurer une action enzymatique homogène ; 2° le contrôle de l’intégrité du follicule par la sélection de follicules sains au cours de l’intervention et l’arrêt de la réaction avec une solution bloquante dès que des dommages sont observés; (3) l’adaptation de la concentration en collagénase, car la rigidité tissulaire peut varier d’un patient à l’autre en fonction de l’âge. La concentration de collagénase peut être diminuée (à 0,12 %) dans certains cas pour prévenir les dommages (c.-à-d. chez les patients prépubères)32.
Dans la dernière partie de ce protocole, l’extraction de l’ARN à partir de follicules isolés a été réalisée en suivant des instructions adaptées. Cela permet un large éventail d’expériences, telles que le séquençage RT-qPCR ou ARN, fournissant des informations fondamentales sur divers processus cellulaires spécifiques aux cellules ovocytaires et granulosa. De nombreux protocoles et kits sont disponibles pour extraire l’ARN des tissus. Nous avons rapporté ici une technique efficace utilisée dans notre laboratoire qui permet l’extraction d’une quantité suffisante d’ARN pour effectuer des analyses d’expression génique par RT-qPCR. Bien que l’extraction directe d’ARN soit fortement recommandée après l’isolement du follicule pour maintenir l’intégrité de l’ARN, il est également possible de congeler les follicules isolés à -80 °C si l’extraction ne peut être effectuée le jour même. La quantité d’ARN peut varier en fonction de la taille des follicules, et les follicules en croissance peuvent interférer avec l’analyse s’ils sont regroupés avec les follicules quiescents. La sélection basée sur la taille est extrêmement pertinente, en fonction des objectifs de l’étude, en particulier pour la première étape de la folliculogenèse. Cependant, la différenciation entre les follicules primordiaux et primaires basée uniquement sur la taille reste difficile en termes d’évaluation correcte des niveaux d’expression des gènes du follicule primordial. La sélection des follicules primordiaux et primaires peut être effectuée en fonction de leur morphologie, mais la discrimination entre eux avec un stéréomicroscope à un grossissement de 63x est difficile.
En conclusion, l’expérimentateur doit être conscient des défis de l’isolation des follicules et en tenir compte lors de l’analyse des résultats. Des paramètres importants doivent être pris en compte, tels que (1) les intra/intervariations de la densité des follicules entre les patients; (2) intégrité du follicule pendant l’isolement du follicule; (3) différenciation entre les différents stades des follicules; et (4) la stabilité et l’intégrité de l’ARN.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention d’excellence scientifique (EOS) (ID: 30443682). I.D. est chercheur associé au Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
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