Summary
هنا ، نصف بروتوكولا يحدد كيفية عزل بصيلات المبيض البشرية عن الأنسجة القشرية المذابة المجمدة لإجراء تحليلات التعبير الجيني.
Abstract
المبيض هو عضو غير متجانس يتكون من أنواع مختلفة من الخلايا. لدراسة الآليات الجزيئية التي تحدث أثناء تكوين الجريب ، يمكن إجراء توطين البروتينات والتعبير الجيني على الأنسجة الثابتة. ومع ذلك ، لتقييم مستويات التعبير الجيني بشكل صحيح في جريب بشري ، يجب عزل هذا الهيكل المعقد والدقيق. ومن ثم ، تم تطوير بروتوكول معدل سبق وصفه من قبل مختبر وودروف لفصل البصيلات (البويضة والخلايا الحبيبية) عن البيئة المحيطة بها. تتم معالجة الأنسجة القشرية المبيضية يدويا أولا للحصول على شظايا صغيرة باستخدام أداتين: قطاعة الأنسجة ومفرمة الأنسجة. ثم يتم هضم الأنسجة إنزيميا مع 0.2 ٪ كولاجيناز و 0.02 ٪ DNase لمدة 40 دقيقة على الأقل. يتم تنفيذ خطوة الهضم هذه عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ويرافقها ماصة ميكانيكية للوسط كل 10 دقائق. بعد الحضانة ، يتم جمع البصيلات المعزولة يدويا باستخدام ماصة شعرية دقيقة معايرة تحت تكبير المجهر. إذا كانت البصيلات لا تزال موجودة في قطع الأنسجة ، يتم الانتهاء من الإجراء بالتشريح المجهري اليدوي. يتم جمع البصيلات على الجليد في وسط استزراع ويتم شطفها مرتين في قطرات من محلول ملحي مخزن بالفوسفات. يجب التحكم في عملية الهضم هذه بعناية لتجنب تدهور الجريب. بمجرد أن يبدو أن بنية البصيلات معرضة للخطر أو بعد 90 دقيقة كحد أقصى ، يتم إيقاف التفاعل بمحلول مانع 4 درجات مئوية يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني. يجب جمع ما لا يقل عن 20 جريبا معزولا (بحجم أقل من 75 ميكرومتر) للحصول على كمية كافية من إجمالي الحمض النووي الريبي بعد استخراج الحمض النووي الريبي لتفاعل البلمرة الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR). بعد الاستخراج ، يصل القياس الكمي للحمض النووي الريبي الكلي من 20 بصيلة إلى قيمة متوسطة تبلغ 5 نانوغرام / ميكرولتر. ثم يتم نسخ الحمض النووي الريبي الكلي إلى cDNA ، ويتم تحليل الجينات ذات الأهمية باستخدام RT-qPCR.
Introduction
المبيض هو عضو معقد يتكون من وحدات وظيفية وهيكلية ، بما في ذلك البصيلات داخل القشرة والسدى. تمت دراسة الجريب ، وهي عملية تنشيط الجريب والنمو والنضج من حالة هادئة بدائية إلى جريب ناضج قادر على الإخصاب ودعم التطور الجنيني المبكر ، على نطاق واسع في البحث1. يمكن أن يؤدي كشف الآليات التي تقود هذه الظاهرة إلى تحسين رعاية الخصوبة للنساء2. تسمح التحليلات على الأنسجة البشرية الثابتة بتقييم التعبير البروتيني وتوطين الجينات داخل الوحدات الوظيفية للمبيض 3,4. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى تقنيات محددة لفصل البصيلات عن القشرة المحيطة لتقييم مستويات التعبير الجيني بدقة داخل بصيلات المبيض. ومن ثم ، في دراسة سابقة ، تم تطوير تقنية عزل الجريب للسماح بتحليل التعبير الجيني مباشرة من الوحدة الوظيفية للمبيض5. تم تطوير طرق مختلفة ، مثل الهضم الأنزيمي و / أو العزل الميكانيكي ، بالإضافة إلى التشريح المجهري لالتقاط الليزر ، والذي يسمح بعزل الجريب داخل قطعة من الأنسجة6،7،8،9. يستخدم عزل الجريب على نطاق واسع ، إما مع أنسجة المبيض البشرية أو الحيوانية ، لتقييم ملامح التعبير الجيني للجريبات في جميع مراحل التطور10،11،12. ومع ذلك ، يجب أن يأخذ إجراء العزل الأمثل في الاعتبار البنية الهشة للجريب داخل القشرة الكثيفة ، وبالتالي ، يجب إجراؤه بعناية لتجنب أي ضرر7. تصف هذه المخطوطة إجراء، مقتبسا من بروتوكول وصفه مختبر وودروف، لعزل البصيلات البشرية عن قشرة المبيض المذابة المجمدة من أجل إجراء تحليلات التعبير الجيني13.
الخطوة الأولى لعزل جريب المبيض من الأنسجة البشرية المجمدة هي إجراء الذوبان. يتم تنفيذ هذه العملية بناء على البروتوكول السريري المستخدم لتطعيم أنسجة المبيض المحفوظة بالتبريد ، كما هو موضح سابقا14،15. تهدف العملية إلى إزالة العوامل الواقية من البرودة عن طريق شطف قشرة المبيض بتركيزات متناقصة من الوسط. ثم يتم تفتيت الأنسجة قبل العزل الأنزيمي والميكانيكي لاسترداد البصيلات. يمكن تمييز البصيلات في مراحل مختلفة باستخدام مجهر مجسم ذو تكبير عالي وبصريات عالية الجودة من أجل عزل تلك ذات الأهمية. يتم قياس كل جريب معزول باستخدام مسطرة مدمجة في المجهر ، ويمكن تجميع البصيلات وفقا لمرحلة نموها: بصيلات بدائية (30 ميكرومتر) ، بصيلات أولية (60 ميكرومتر) ، بصيلات ثانوية (120-200 ميكرومتر) ، وجريبات غارية (>200 ميكرومتر) 16. يمكن إجراء مزيد من التصنيف وفقا لمورفولوجيا البصيلات: تحتوي البصيلات البدائية على طبقة واحدة من الخلايا الحبيبية المسطحة (GCs) ، وتحتوي البصيلات الأولية على طبقة واحدة من GCs المكعبة ، وتحتوي البصيلات الثانوية على طبقتين على الأقل من GCs المكعبة ، ووجود تجويف بين GCs يميز المرحلة الغارية. عندما يتم اختيار بصيلات الاهتمام ، يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي. يتم تقييم كمية وجودة الحمض النووي الريبي قبل تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (RT-qPCR) (الشكل 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذا المشروع من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى Erasme (بروكسل ، بلجيكا). خضعت المريضة المشمولة بهذا البروتوكول لحفظ أنسجة المبيض بالتبريد (OTC) للحفاظ على الخصوبة قبل التعرض للعلاج الكيميائي في عام 2000. وقعت المريضة موافقة خطية مستنيرة للتبرع بأنسجتها المجمدة المتبقية للبحث في نهاية فترة التخزين.
1. ذوبان أنسجة المبيض المحفوظة بالتبريد
- تحضير لوحة 6 آبار تحتوي على خمسة حلول ذوبان. يحتوي البئر الأول على 5 مل من محلول الحماية من التبريد يتكون من وسط Leibovitz-15 ، و 0.1 مول / لتر سكروز ، و 1.5 مول / لتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 1٪ ألبومين مصل بشري (HSA). تحتوي الآبار التالية على 5 مل من وسط Leibovitz-15 مع تركيزات متناقصة من المواد الواقية من التبريد: 1 مول / لتر ، 0.5 مول / لتر ، و 2 × 0 مول / لتر DMSO.
ملاحظة: يمكن أن يختلف محلول الحماية من التبريد وفقا للبروتوكول المستخدم في عيادة الخصوبة. - قم بإزالة قارورة تحتوي على جزء قشري مبيض من النيتروجين السائل وفقا لقواعد السلامة (القفازات المبردة والنظارات الواقية والأحذية المغلقة) ، واحتفظ بالأنبوب في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 ثانية.
- نقع القارورة في الماء المقطر المزدوج لمدة 2 دقيقة في RT مع تحريض لطيف قبل فتح القارورة تحت غطاء عمودي ونقلها مباشرة إلى البئر الأول من لوحة 6 آبار (على الجليد).
- نقل الشظية على التوالي إلى كل بئر من الصفيحة المكونة من 6 آبار ، حيث يحتوي كل منها على تركيزات متناقصة من المواد الواقية من التبريد في 5 مل من وسط Leibovitz-15. حرك الأنسجة برفق في كل وسط لمدة 5 دقائق (على الثلج).
2. عزل الجريب
ملاحظة: يتم إجراء جميع التجارب باستخدام مواد خالية من RNase وتحت غطاء رأسي.
- انقل الأنسجة المذابة إلى طبق بتري شبكي 2 مم مملوء ب 10 مل من وسط التشريح (وسط ليبوفيتز -15 ، بيروفات الصوديوم [2 مليمول / لتر] ، إل-جلوتامين [2 مليمول / لتر] ، HSA [0.3٪] ، بنسلين G [30 ميكروغرام / مل] ، وستربتومايسين [50 ميكروغرام / مل]). اضبط حجم الأنسجة بمشرط إذا لزم الأمر.
ملاحظة: اعتمادا على البروتوكول السريري ، يمكن أن يختلف حجم الأنسجة المجمدة من 8 مم × 4 مم × 1 مم إلى 4 مم × 2 مم × 1 مم. لهذا البروتوكول ، تم استخدام شريطين من 4 مم × 2 مم × 1 مم. - قم بتكديس القطع الثلاث من قطاعة الأنسجة ، وضع الجزء بين الكتلتين ، وقطع الجزء إلى نصفين باستخدام شفرة ، وانزلق عبر الكتل للحصول على شظيتين بسمك 0.5 مم.
- استخدم مفرمة الأنسجة لقطع الجزء والحصول على قطع أصغر. إذا لزم الأمر ، قم بقص القطع المتبقية يدويا بمشرط حتى يتم تحطيم الأنسجة تماما.
- انقل الأنسجة المجزأة إلى طبق بتري شبكي مملوء ب 7 مل من وسط الهضم (وسط استزراع [وسط McCoy's 5A ، 3 مليمول / لتر جلوتامين ، 0.1٪ HSA ، 30 ميكروغرام / مل بنسلين G ، 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، 2.5 ميكروغرام / مل ترانسفيرين ، 4 نانوغرام / مل سيلينيوم ، و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك] مكمل ب 0.2٪ كولاجيناز و 0.02٪ DNase).
- ضع الطبق في الحاضنة عند 5٪ CO2 و 37 درجة مئوية. كل 10 دقائق ، أخرج طبق بتري من الحاضنة ، واغسل الأنسجة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 1 مل.
- بعد 45 دقيقة من الحضانة في وسط الهضم ، ضع الطبق تحت مجهر مجسم مع نطاق تكبير من 5x-6.3x ، واسترجاع البصيلات باستخدام ماصة شعرية دقيقة. حدد بصيلات الاهتمام ، واعزلها عن طريق امتصاصها باستخدام ماصة الفم.
ملاحظة: يجب إجراء سحب الفم بعناية لتجنب فقدان المواد في الأنبوب والتلوث. - إذا ظلت البصيلات عالقة في قطعة من القشرة ، فقم بعزلها ميكانيكيا باستخدام حقنتين 27 جم عن طريق تمزيق القشرة بطرف المحاقن لتحرير البصيلات من السدى.
ملاحظة: لا تلمس البصيلات مع المحاقن لتجنب إتلافها. - نقل البصيلات مع الشعيرات الدموية الدقيقة في لوحة 4 آبار تحتوي على قطرات من 15 ميكرولتر من وسط الاستزراع المعاير المغطى ب 500 ميكرولتر من ثقافة الزيت (1 إلى 10 بصيلات لكل قطرة). تحافظ هذه الخطوة على صلاحية الجريب أثناء عملية التجميع. في نهاية الإجراء ، شطف البصيلات مرتين لمدة 5 ثوان في كل مرة في قطرتين من 15 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مغطى ب 500 ميكرولتر من ثقافة الزيت (على الجليد).
- اجمع 20 بصيلة بأقل كمية من PBS باستخدام ماصة الفم (بحد أقصى 10 ميكرولتر) في أنبوب فارغ ، واحتفظ بالأنبوب على الجليد.
ملاحظة: من أجل استقرار الحمض النووي الريبي ، من الضروري تنفيذ الخطوة 2.8 والخطوة 2.9 على الجليد. هناك حاجة إلى حوالي 20 جريبا (<75 ميكرومتر) للحصول على ما يكفي من الحمض النووي الريبي ل RT-qPCR القياسي (SYBR Green). - بعد 90 دقيقة كحد أقصى من الحضانة في وسط الهضم ، أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة فائض من محلول مانع بارد (4 درجات مئوية) (7.5 مل) إلى طبق بتري يتكون من وسط مزرعة مكمل بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS).
ملاحظة: يمكن إضافة محلول الحجب بمجرد أن يلاحظ المجرب وجود بصيلات ملتصقة على اللوحة أو بصيلات تالفة (شكل غير متماثل أو بصيلات داكنة اللون). ينصح بإجراء عزل البصيلات خلال فترة أقصاها 2.5 ساعة لتجنب تلف البصيلات وإجراء استخراج الحمض النووي الريبي مباشرة بعد العزل.
3. استخراج الحمض النووي الريبي
ملاحظة: يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي باتباع الإرشادات المرفقة مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي عن طريق تكييف أحجام الشطف.
- قم بتعليق البصيلات المعزولة عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول التحلل المزود مع مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي إلى الأنبوب الذي يحتوي على البصيلات تحت غطاء كيميائي ، ودوامة بسرعة عالية (2500 دورة في الدقيقة / دقيقة) لكسر بنية البصيلات. أضف 50 ميكرولتر من الإيثانول (100٪) إلى الأنبوب ، ودوامة لفترة وجيزة بسرعة عالية.
ملاحظة: نظرا لأن محلول التحلل يحتوي على 2-mercaptoethanol وحمض الثيوسيانيك ، يجب تنفيذ هذه الخطوة بحذر تحت غطاء كيميائي. - نقل الحجم الكلي للأنبوب (حوالي 160 ميكرولتر) إلى مجموعة خرطوشة ميكروفلتر تتكون من عمود وأنبوب تجميع ، وطرده لمدة 10 ثوان عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل العمود ب 180 ميكرولتر من محلول الغسيل 1 ، المزود بالمجموعة ، وطرد مركزي الأنبوب لمدة 10 ثوان عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية.
- أضف 180 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 ، المرفق مع المجموعة ، إلى العمود ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 ثوان عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية. نفذ هذه الخطوة مرتين. جهاز طرد مركزي الأنبوب مرة أخيرة لمدة 1 دقيقة لتجفيف الفلتر ، ووضع أنبوب تجميع جديد تحت الخرطوشة.
- قم بإجراء شطف الأحماض النووية في خطوتين:
- أولا ، أضف 8 ميكرولتر من محلول الشطف الدافئ (75 درجة مئوية) إلى المرشح ، وانتظر لمدة 1 دقيقة في RT ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية.
- كرر هذه الخطوة مع 7 ميكرولتر من محلول الشطف.
ملاحظة: يجب أن يبقى الأنبوب الذي يحتوي على الأحماض النووية المستخلصة على الجليد. لتجنب تلوث الحمض النووي ، يوصى بشدة بخطوة تكميلية لتدهور الحمض النووي - الخطوة 3.5.
- احتضان الأنبوب مع 2 وحدة دولية DNase و 1x DNase عازلة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. منع النشاط الأنزيمي مع كاشف تعطيل 1/10 DNase لمدة 2 دقيقة في RT.
- جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة 1.5 دقيقة عند 16363 × جم عند 4 درجات مئوية. أخيرا ، اجمع التعليق الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي ، وانقله إلى أنبوب جديد.
- تقييم كمية الحمض النووي الريبي الموجودة في العينة باستخدام مقياس الطيف الضوئي (برنامج NanoDrop 2000 > الحمض النووي > RNA). استخدم 1 ميكرولتر من محلول الشطف كفراغ ، وقم بقياس كمية الحمض النووي الريبي المستخرجة من البصيلات المعزولة باستخدام 1 ميكرولتر من المحلول.
- تحقق من نسبة 260/280 لنقاء الحمض النووي الريبي (حوالي 2.0). قم بتخزين العينة في درجة حرارة -80 درجة مئوية، أو قم بنسخها مباشرة لإجراء RT-qPCR.
ملاحظة: لتقييم سلامة الحمض النووي الريبي ، يمكن معالجة العينة باستخدام نظام كهربائي آلي عالي الدقة قبل أو بعد التجميد عند -80 درجة مئوية. في هذا العمل ، بعد النسخ العكسي ، تم إجراء RT-qPCR بالدورة التالية:
عقد المرحلة مع 20 ثانية عند 50 درجة مئوية و 10 دقائق عند 95 درجة مئوية
40 دورة PCR مع 15 ثانية عند 95 درجة مئوية و 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية
مرحلة منحنى الذوبان مع 15 ثانية عند 95 درجة مئوية ، 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، 30 ثانية عند 95 درجة مئوية ، و 15 ثانية عند 60 درجة مئوية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام إجراء العزل هذا ، يمكن للمجرب استرداد البصيلات من البيئة اللحمية لإجراء تحليلات محددة للتعبير الجيني. بناء على حجم ومورفولوجيا البصيلات ، من الممكن التمييز بين المراحل المختلفة لتكوين الجريبات. يمكن للمجرب اختيار بصيلات ذات أهمية وفقا لحجمها باستخدام ماصة شعرية دقيقة مكيفة. باستخدام الشعيرات الدموية الدقيقة بحد أقصى 75 ميكرومتر ، من الممكن التمييز بين البصيلات البدائية والأولية من البصيلات الثانوية والغارية والناضجة. علاوة على ذلك ، يمكن للمجرب تأكيد مرحلة الجريب وفقا لمورفولوجيا الجريب. عند دراسة تنشيط الجريب ، يتم اختيار البصيلات الهادئة والأولية ، وهناك حاجة إلى ما يقرب من 20 جريبا للوصول إلى تركيز الحمض النووي الريبي حوالي 5 نانوغرام / ميكرولتر.
تمت معالجة شظيتين من المبيض المتجانس (4 مم × 2 مم × 1 مم) من نفس المريض لعزل البصيلات باستخدام هذا البروتوكول (الشكل 2). بعد إجراء عزل لمدة 1.5 ساعة ، تم استرداد مجموعتين من البصيلات وفقا لمراحل النمو لمقارنة كمية الحمض النووي الريبي وتسليط الضوء على أهمية اختيار الجريب: 20 جريبا من <75 ميكرومتر (الأنبوب 1) و 15 جريبا من <200 ميكرومتر (الأنبوب 2). بعد ذلك ، تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي ، وتم الحصول على 4.8 نانوغرام / ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي من الأنبوب 1 و 10.5 نانوغرام / ميكرولتر من إجمالي الحمض النووي الريبي من الأنبوب 2 باستخدام مقياس الطيف الضوئي للقياس الكمي (الجدول 1). باستخدام نظام مقياس الطيف الضوئي الدقيق هذا ، تم أيضا قياس نسبة 260/280 لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي. تعكس هذه النسبة التلوث المحتمل بالبروتين أو الكواشف الأخرى أثناء الاستخراج ويجب أن تكون قريبة من 2.0 لعينات الحمض النووي الريبي. كانت نسب 260/280 1.89 و 1.74 في الأنبوب 1 والأنبوب 2 ، على التوالي ، مما يؤكد نقاء العينات (الجدول 1). ثم تم التحقق من جودة الحمض النووي الريبي عن طريق معالجة العينات باستخدام رحلان كهربائي آلي عالي الدقة. باتباع هذا الإجراء ، تم تقدير رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN). تعكس قيمة RIN ، من 1 (متدهورة) إلى 10 (سليمة) ، مستوى تدهور الحمض النووي الريبي في العينة. كانت قيم RIN 7.1 و 7.9 في الأنبوب 1 والأنبوب 2 ، على التوالي ، للتحقق من جودة الحمض النووي الريبي من عيناتنا (الجدول 1). لإجراء RT-qPCR ، تم نسخ الحجم الإجمالي للحمض النووي الريبي المستخرج أولا إلى cDNA. بعد ذلك ، تمت إضافة 1.25 نانوغرام من cDNA لكل بئر على صفيحة 96 بئرا ، مع بادئات للتدبير المنزلي والجينات المستهدفة (هيبوكسانثين-جوانين فوسفوريبوسيل ترانسفيراز [HPRT] ، Kit Ligand [KL] ، وعامل تمايز النمو 9 [GDF9]) ومزيج SYBR Green الرئيسي17,18. بعد تشغيل دورة قياسية على نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، كانت عتبات الدورة (Ct) التي تم الحصول عليها 30.87 (الأنبوب 1) و 29.56 (الأنبوب 2) ل HPRT و 33.5 (الأنبوب 1) و 31.77 (الأنبوب 2) ل KL ، و 30.71 (الأنبوب 1) و 30.57 (الأنبوب 2) ل GDF9 (الجدول 1).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لطريقة تقييم استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) من جريبات المبيض البشرية المعزولة. تم وصف ثلاث خطوات في هذه المخطوطة: إذابة الأنسجة ، وإجراء العزل ، بما في ذلك المعالجة الميكانيكية والأنزيمية ، واستخراج الحمض النووي الريبي من البصيلات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجريبات المجمعة باتباع بروتوكول العزل. أ: ذوبان الجليد القشري. ب: قطاعة الأنسجة، و(ج) مفرمة الأنسجة المستخدمة لتفتيت الأنسجة. (د-هاء) صور البصيلات المعزولة المسترجعة التي لوحظت باستخدام مجهر مجسم مع عدسة 10x ونطاق تكبير واسع (1x-6.3x) ؛ تم استخدام إعدادات التكبير من 50x-63x لتحديد البصيلات البدائية والأولية. المقاييس: 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أنبوب | عدد البصيلات | حجم البصيلات (ميكرومتر) | تركيز الحمض النووي الريبي (نانوغرام / ميكرولتر) | نسبة 260/280 | رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) | هبرت سي تي | كوالا لمبور سي تي | جي دي إف 9 سي تي | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
الجدول 1: النقاء ، RIN ، وعتبات الدورة لشظيتين مبيض متجانستين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعد الحفظ بالتبريد لأنسجة المبيض نهجا واعدا للحفاظ على خصوبة مرضى السرطان. في العيادة ، يتم تطعيم الأنسجة القشرية المذابة مرة أخرى في المريض بعد مغفرة ، مما يسمح باستئناف وظيفة المبيض والخصوبة19,20. إلى جانب الاستخدام السريري ، يمكن أيضا التبرع بشظايا المبيض المتبقية للبحث في نهاية فترة التخزين لدراسة الآليات التي تنظم تكوين الجريبات. علاوة على ذلك ، فإن هذا النسيج مفيد بشكل خاص لتطوير بدائل للتطعيم عندما لا يكون ذلك ممكنا ، مثل أنظمة الزراعة في المختبر أو المبايض الاصطناعية. ومع ذلك ، فإن الاختلافات داخل المرضى وفيما بينهم تحد من جدوى التجارب وإمكانية استنساخها وتفسير النتائج. في الواقع ، تنخفض الكثافة المسامية بشكل كبير مع تقدم العمر ، ولا يتم توزيع البصيلات بالتساوي بين الشظايا21. نظرا لأن عدد الأجزاء المتاحة محدود ، يجب استخدام الأنسجة البشرية بتقنيات متطورة. يمكن إجراء مجموعة واسعة من التقنيات مثل الكيمياء الهيستولوجية المناعية والتألق المناعي ، وكذلك التهجين في الموقع ، على الأنسجة الثابتة لتقييم توطين البروتين والجينات 3,18. لدراسة الآليات الجزيئية التي تنظم تكوين الجريبات داخل الوحدات الوظيفية للمبيض في مراحل مختلفة من التطور ، يلزم عزل البصيلات.
استكشفت العديد من الدراسات طرقا فعالة لفصل البصيلات عن الأنسجة المحيطة في الأنواع البشرية والحيوانية22. قد يختلف عدد البصيلات المسترجعة وجودة الحمض النووي الريبي بعد الاستخراج وفقا للتقنيات المستخدمة. لدراسة تنشيط البصيلات (أي البصيلات البدائية والأولية) ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 20 جريبا مجمعا لإجراء RT-qPCR القياسي. باستخدام طرق بديلة مثل تضخيم الحمض النووي الريبي أو cDNA أو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل ، من الممكن العمل مع عدد أقل من البصيلات23,24.
تجعل الطبيعة الكثيفة لقشرة المبيض عزل الجريب أمرا صعبا ، مما أدى إلى استخدام طرق تتضمن مزيجا من العزل الأنزيمي والميكانيكي25. يمكن استخدام أنواع مختلفة من الإنزيمات ، مثل كولاجيناز و DNase26. ومع ذلك ، فقد أبلغت الدراسات عن تلف الجريب بعد الهضم الأنزيمي ، مما أثر بشكل أكبر في التطور المختبري 27,28. للحفاظ على سلامة الجريب ، تستخدم العديد من الفرق حاليا بروتوكولات الهضم الأنزيمي المكيفة أو إجراء عزل ميكانيكي فقط للزرع الجريبي اللاحق25،29،30،31. تقدم هذه المخطوطة طريقة بسيطة وفعالة للحصول على بصيلات معزولة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. ومع ذلك ، تتطلب جميع التجارب منحنى تعليمي قبل الوصول إلى النتائج المثلى.
لأغراض البحث الأساسية ، تم تطوير مراجعة لبروتوكول سابق لاسترداد كمية كبيرة من البصيلات دون التأثير على سلامتها13. تتم معالجة تحليل التعبير الجيني مباشرة بعد العزل لتحسين جودة الحمض النووي الريبي. من الضروري أيضا تجنب الهضم لفترات طويلة من أجل الحد من خطر اختيار بصيلات متدهورة. وبالتالي ، تظل خطوة الهضم حاسمة في هذا البروتوكول. ثلاث نقاط تتطلب اهتماما خاصا: (1) احمرار الأنسجة أثناء التفاعل الأنزيمي كل 10 دقائق لتوفير عمل إنزيم متجانس. (2) التحكم في سلامة الجريب عن طريق اختيار بصيلات صحية أثناء الإجراء وإيقاف التفاعل بمحلول مانع بمجرد ملاحظة الضرر ؛ (3) تكييف تركيز كولاجيناز ، حيث قد يختلف تصلب الأنسجة بين المرضى حسب العمر. يمكن تقليل تركيز كولاجيناز (إلى 0.12٪) في بعض الحالات لمنع الضرر (أي في المرضى قبل البلوغ)32.
في الجزء الأخير من هذا البروتوكول ، تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي من بصيلات معزولة باتباع التعليمات المكيفة. يتيح ذلك مجموعة واسعة من التجارب ، مثل RT-qPCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي ، مما يوفر معلومات أساسية عن العمليات الخلوية المختلفة الخاصة بالخلايا البيضية والحبيبية. تتوفر العديد من البروتوكولات والمجموعات لاستخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة. لقد أبلغنا هنا عن تقنية فعالة مستخدمة في مختبرنا تسمح باستخراج كمية كافية من الحمض النووي الريبي لإجراء تحليلات التعبير الجيني بواسطة RT-qPCR. بينما يوصى بشدة باستخراج الحمض النووي الريبي المباشر بعد عزل الجريب للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي ، فمن الممكن أيضا تجميد البصيلات المعزولة عند -80 درجة مئوية إذا تعذر إجراء الاستخراج في نفس اليوم. قد تختلف كمية الحمض النووي الريبي وفقا لحجم البصيلات ، وقد تتداخل البصيلات النامية مع التحليل إذا تم تجميعها مع البصيلات الهادئة. الاختيار على أساس الحجم مهم للغاية ، اعتمادا على أهداف الدراسة ، خاصة بالنسبة للخطوة الأولى من تكوين الجريبات. ومع ذلك ، فإن التمايز بين البصيلات البدائية والأولية بناء على الحجم فقط لا يزال يمثل تحديا من حيث التقييم الصحيح لمستويات التعبير الجيني للجريب البدائي. يمكن إجراء اختيار البصيلات البدائية والأولية بناء على مورفولوجيتها ، ولكن التمييز بينها باستخدام مجهر مجسم عند تكبير 63x أمر صعب.
في الختام ، يجب أن يكون المجرب على دراية بتحديات عزل الجريب وأخذها في الاعتبار عند تحليل النتائج. يجب مراعاة المعلمات المهمة ، مثل (1) الاختلافات داخل / بين كثافة الجريب بين المرضى. (2) سلامة الجريب أثناء عزل الجريب ؛ (3) التمايز بين مراحل البصيلات المختلفة ؛ و (4) استقرار وسلامة الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة التميز العلمي (EOS) (ID: 30443682). دكتوراه باحثة مشاركة في الصندوق الوطني للبحوث العلمية البلجيكية (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
