Summary
Her beskriver vi en protokol, der skitserer, hvordan man isolerer humane ovariefollikler fra frosset-optøet kortikalt væv for at udføre genekspressionsanalyser.
Abstract
Æggestokken er et heterogent organ sammensat af forskellige celletyper. For at studere de molekylære mekanismer, der forekommer under follikulogenese, kan lokaliseringen af proteiner og genekspression udføres på fast væv. For korrekt at vurdere genekspressionsniveauer i en menneskelig follikel skal denne komplekse og sarte struktur isoleres. Derfor er en tilpasset protokol, der tidligere er beskrevet af Woodruffs laboratorium, blevet udviklet til at adskille follikler (oocyt- og granulosacellerne) fra deres omgivende miljø. Det kortikale væv i æggestokkene behandles først manuelt for at opnå små fragmenter ved hjælp af to værktøjer: en vævsskærer og en vævshelikopter. Vævet fordøjes derefter enzymatisk med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase i mindst 40 min. Dette fordøjelsestrin udføres ved 37 °C og 5 % CO2 og ledsages af mekanisk pipettering af substratet hvert 10. minut. Efter inkubation opsamles de isolerede follikler manuelt ved hjælp af en kalibreret mikrokapillærpipette under mikroskopforstørrelse. Hvis follikler stadig er til stede i vævsstykkerne, afsluttes proceduren med manuel mikrodissektion. Folliklerne opsamles på is i et dyrkningsmedium og skylles to gange i dråber fosfatbufret saltopløsning. Denne fordøjelsesprocedure skal kontrolleres omhyggeligt for at undgå follikelforringelse. Så snart folliklernes struktur synes at være kompromitteret eller efter højst 90 minutter, stoppes reaktionen med en 4 °C-blokerende opløsning indeholdende 10 % føtalt bovint serum. Der skal indsamles mindst 20 isolerede follikler (størrelse under 75 μm) for at opnå en tilstrækkelig mængde total RNA efter RNA-ekstraktion til kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR). Efter ekstraktion når kvantificeringen af total RNA fra 20 follikler en middelværdi på 5 ng/μL. Det samlede RNA retrotranskriberes derefter til cDNA, og generne af interesse analyseres yderligere ved hjælp af RT-qPCR.
Introduction
Æggestokken er et komplekst organ sammensat af funktionelle og strukturelle enheder, herunder folliklerne i cortex og stroma. Follikulogenese, processen med follikelaktivering, vækst og modning fra en primordial hvilende tilstand til en moden follikel, der kan befrugtes og understøtte tidlig embryonal udvikling, undersøges bredt i forskning1. At optrævle de mekanismer, der driver dette fænomen, kan forbedre fertilitetsplejen for kvinder2. Analyser af fast humant væv gør det muligt at vurdere proteinekspression og genlokalisering inden for ovariens funktionelle enheder 3,4. Imidlertid er specifikke teknikker nødvendige for at adskille folliklerne fra den omgivende cortex for nøjagtigt at vurdere genekspressionsniveauer inden for æggestokkene. Derfor blev der i en tidligere undersøgelse udviklet en follikelisoleringsteknik for at muliggøre analyser af genekspression direkte fra den funktionelle enhed i æggestokken5. Forskellige tilgange er blevet udviklet, såsom enzymatisk fordøjelse og / eller mekanisk isolering samt laserfangstmikrodissektion, der tillader follikelisolering i et stykke væv 6,7,8,9. Follikelisolering anvendes i vid udstrækning, enten med humant eller animalsk ovarievæv, til at evaluere folliklernes genekspressionsprofiler på alle udviklingsstadier10,11,12. En optimal isolationsprocedure bør dog tage højde for follikelens skrøbelige struktur i den tætte cortex og bør derfor udføres med omhu for at undgå skader7. Dette manuskript beskriver en procedure, tilpasset fra en protokol beskrevet af Woodruffs laboratorium, til at isolere humane follikler fra frosne-optøede ovariebark for at udføre genekspressionsanalyser13.
Det første trin i ovariefollikelisolering fra frosset humant væv er optøningsproceduren. Denne proces udføres på grundlag af den kliniske protokol, der anvendes til podning af kryopræserveret ovarievæv, som tidligere beskrevet14,15. Processen sigter mod at fjerne de kryoprotektive midler ved at skylle æggestokkens cortex i faldende koncentrationer af mediet. Derefter fragmenteres vævet før enzymatisk og mekanisk isolering for at hente folliklerne. Follikler på forskellige stadier kan skelnes ved hjælp af et stereomikroskop med høj forstørrelse og optik af god kvalitet for at isolere dem af interesse. Hver isoleret follikel måles ved hjælp af en lineal integreret i mikroskopet, og folliklerne kan samles i henhold til deres udviklingsstadium: primordiale follikler (30 μm), primære follikler (60 μm), sekundære follikler (120-200 μm) og antrale follikler (>200 μm)16. Yderligere klassificering kan udføres i henhold til folliklernes morfologi: primordiale follikler har et lag fladede granulosaceller (GC'er), primære follikler har et lag kuboide GC'er, sekundære follikler har mindst to lag kuboide GC'er, og tilstedeværelsen af et hulrum blandt GC'erne karakteriserer antralstadiet. Når follikler af interesse vælges, udføres RNA-ekstraktion. RNA-mængden og -kvaliteten evalueres forud for kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid (RT-qPCR) (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette projekt blev godkendt af Erasme Hospitals etiske udvalg (Bruxelles, Belgien). Patienten inkluderet i denne protokol gennemgik kryopræservering af ovarievæv (OTC) til fertilitetsbevarelse før kemoterapieksponering i 2000. Patienten underskrev informeret skriftligt samtykke til at donere sit resterende frosne væv til forskning i slutningen af opbevaringsperioden.
1. Optøning af kryopræserveret ovarievæv
- Forbered en 6-brønds plade indeholdende fem optøningsopløsninger. Den første brønd indeholder 5 ml kryoprotektiv opløsning sammensat af Leibovitz-15 medium, 0,1 mol / L saccharose, 1,5 mol / L dimethylsulfoxid (DMSO) og 1% humant serumalbumin (HSA). De næste brønde indeholder 5 ml Leibovitz-15 medium med faldende koncentrationer af kryoprotektant: 1 mol / L, 0,5 mol / L og 2 x 0 mol / L DMSO.
BEMÆRK: Kryoprotektiv opløsning kan variere afhængigt af den protokol, der anvendes i fertilitetsklinikken. - Fjern et hætteglas, der indeholder et kortikalt fragment fra æggestokkene, fra flydende nitrogen i overensstemmelse med sikkerhedsreglerne (kryogene handsker, beskyttelsesbriller og lukkede sko), og opbevar tuben ved stuetemperatur (RT) i 30 sekunder.
- Læg hætteglasset i blød i dobbeltdestilleret vand i 2 minutter ved RT under forsigtig omrøring, før hætteglasset åbnes under en lodret hætte og overføres direkte til det første hul på 6-brøndspladen (på is).
- Fragmentet overføres successivt til hvert hul i 6-brøndpladen, hvor hver indeholder faldende koncentrationer af kryoprotektormiddel i 5 ml Leibovitz-15-medium. Omrør forsigtigt vævet i hvert medium i 5 minutter (på is).
2. Follikelisolering
BEMÆRK: Alle eksperimenter udføres med RNase-frie materialer og under en lodret hætte.
- Det optøede væv overføres til en 2 mm ristet petriskål fyldt med 10 ml dissektionsmedium (Leibovitz-15 medium, natriumpyruvat [2 mmol / L], L-glutamin [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicillin G [30 μg / ml] og streptomycin [50 μg / ml]). Juster vævets størrelse med en skalpel, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: Afhængigt af den kliniske protokol kan størrelsen af det frosne væv variere fra 8 mm x 4 mm x 1 mm til 4 mm x 2 mm x 1 mm. Til denne protokol blev der anvendt to strimler på 4 mm x 2 mm x 1 mm. - Bunke de tre stykker af vævsskæreren op, læg fragmentet mellem de to blokke, og skær fragmentet i halve ved hjælp af et blad, glid gennem blokkene for at opnå to fragmenter med en tykkelse på 0,5 mm.
- Brug vævshakkeren til at skære fragmentet og få mindre stykker. Skær om nødvendigt de resterende stykker manuelt med en skalpel, indtil vævet er helt knust.
- Overfør det fragmenterede væv til en ristet petriskål fyldt med 7 ml fordøjelsesmedium (dyrkningsmedium [McCoys 5A medium, 3 mmol / L glutamin, 0,1% HSA, 30 μg / ml penicillin G, 50 μg / ml streptomycin, 2,5 μg / ml transferrin, 4 ng / ml selen og 50 μg / ml ascorbinsyre] suppleret med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase).
- Sæt skålen i inkubatoren ved 5% CO2 og 37 ° C. Hvert 10. minut tages petriskålen ud af inkubatoren, og vævet skylles ved pipettering op og ned med en 1 ml pipette.
- Efter 45 minutters inkubation i fordøjelsesmediet anbringes skålen under et stereomikroskop med et forstørrelsesområde på 5x-6,3x, og folliklerne hentes ud ved hjælp af en mikrokapillærpipette. Vælg de relevante follikler, og isoler dem ved at suge dem op med en mundpipette.
BEMÆRK: Mundpipettering skal udføres omhyggeligt for at undgå tab af materiale i røret og forurening. - Hvis folliklerne forbliver fast i et stykke cortex, skal du isolere dem mekanisk med to 27 G sprøjter ved at rive cortex af med spidsen af sprøjterne for at frigive follikler fra stroma.
BEMÆRK: Rør ikke ved folliklerne med sprøjterne for at undgå at beskadige dem. - Folliklerne overføres med mikrokapillærrøret i en 4-brønds plade, der indeholder dråber på 15 μL af det kalibrerede dyrkningsmedium dækket af 500 μL oliekultur (1 til 10 follikler pr. dråbe). Dette trin opretholder follikelens levedygtighed under indsamlingsprocessen. Ved afslutningen af proceduren skylles folliklerne to gange i 5 s hver gang i to dråber 15 μL fosfatbufret saltopløsning (PBS) dækket af 500 μL oliekultur (på is).
- 20 follikler med en minimal mængde PBS opsamles ved hjælp af mundpipetten (maks. 10 μL) i et tomt rør, og røret opbevares på is.
BEMÆRK: For RNA-stabilitet er det afgørende at udføre trin 2.8 og trin 2.9 på is. Omkring 20 follikler (<75 μm) er nødvendige for at have nok RNA til standard RT-qPCR (SYBR Green). - Efter maksimalt 90 minutters inkubation i fordøjelsesmediet standses den enzymatiske reaktion ved tilsætning til petriskålen af et overskud af kold (4 °C) blokerende opløsning (7,5 ml) bestående af dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).
BEMÆRK: Den blokerende opløsning kan tilsættes, så snart eksperimentatoren observerer follikler, der klæber på pladen eller beskadigede follikler (asymmetrisk form eller mørkere farvede follikler). Det anbefales at udføre follikelisolering inden for en maksimal periode på 2,5 timer for at undgå follikulær skade og udføre RNA-ekstraktion umiddelbart efter isolering.
3. RNA-ekstraktion
BEMÆRK: RNA-ekstraktion udføres efter instruktionerne, der følger med et RNA-ekstraktionssæt ved at tilpasse elueringsvolumenerne.
- De isolerede follikler suspenderes ved at tilsætte 100 μL af lysisopløsningen, der leveres med RNA-ekstraktionssættet, til røret, der indeholder folliklerne under en kemisk hætte, og hvirvel med høj hastighed (2.500 omdr./min.) for at bryde folliklernes struktur. Tilsæt 50 μL ethanol (100%) til røret, og kort hvirvel ved høj hastighed.
BEMÆRK: Da lysisbufferen indeholder 2-mercaptoethanol og thiocyansyre, skal dette trin udføres med forsigtighed under en kemisk hætte. - Det samlede rumfang af glasset (ca. 160 μl) overføres til en mikrofilterpatronenhed bestående af en søjle og et opsamlingsrør, og der centrifugeres i 10 s ved 16,363 x g ved 4 °C. Kolonnen vaskes med 180 μL vaskeopløsning 1, der følger med sættet, og centrifugeres glasset i 10 s ved 16,363 x g ved 4 °C.
- Der tilsættes 180 μL vaskeopløsning 2/3, der følger med sættet, til kolonnen og centrifugeres i 10 s ved 16,363 x g ved 4 °C. Udfør dette trin to gange. Centrifuger slangen en sidste gang i 1 minut for at tørre filteret, og anbring et nyt opsamlingsrør under cylinderampullen.
- Udfør elueringen af nukleinsyrerne i to trin:
- Først tilsættes 8 μL varm elueringsopløsning (75 °C) til filteret, vent i 1 min ved RT, og centrifuger i 30 s ved 16,363 x g ved 4 °C.
- Dette trin gentages med 7 μL elueringsopløsning.
BEMÆRK: Røret indeholdende de eluerede nukleinsyrer skal opbevares på is. For at undgå DNA-kontaminering anbefales et supplerende trin med DNA-nedbrydning stærkt - trin 3.5.
- Inkuber glasset med 2 IE DNase og 1x DNase-buffer i 20 minutter ved 37 °C. Bloker den enzymatiske aktivitet med 1/10 DNase-inaktiveringsreagens i 2 minutter ved RT.
- Centrifuger glasset i 1,5 min ved 16.363 x g ved 4 °C. Til sidst samles suspensionen indeholdende RNA'et og overføres til et nyt rør.
- Vurder mængden af RNA til stede i prøven ved hjælp af et spektrofotometer (NanoDrop 2000 software > nukleinsyre > RNA). Brug 1 μL elueringsopløsning som blindprøve, og mål RNA-mængden ekstraheret fra isolerede follikler med 1 μL opløsning.
- Kontroller forholdet 260/280 for RNA-renhed (ca. 2,0). Opbevar prøven ved -80 °C, eller retrotransskriber den direkte for at udføre RT-qPCR.
BEMÆRK: For at vurdere RNA-integriteten kan prøven behandles med et automatiseret elektroforesesystem med høj opløsning før eller efter frysning ved -80 °C. I dette arbejde, efter retrotranskription, blev RT-qPCR udført med følgende cyklus:
Hold scenen med 20 s ved 50 °C og 10 min ved 95 °C
40 PCR-cyklusser med 15 s ved 95 °C og 1 min ved 60 °C
Smeltekurvetrin med 15 s ved 95 °C, 1 min ved 60 °C, 30 s ved 95 °C og 15 s ved 60 °C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne isolationsprocedure kan eksperimentatoren hente follikler fra det stromale miljø for at udføre specifikke genekspressionsanalyser. Baseret på folliklernes størrelse og morfologi er det muligt at differentiere de forskellige stadier af follikulogenese. Eksperimentatoren kan vælge follikler af interesse i henhold til deres størrelse ved hjælp af en tilpasset mikrokapillærpipette. Ved at anvende en mikrokapillær på maksimalt 75 μm er det muligt at skelne primordiale og primære follikler fra sekundære, antrale og modne follikler. Desuden kan eksperimentatoren bekræfte follikelstadiet i henhold til follikelmorfologien. Ved undersøgelse af follikelaktivering vælges hvilende og primære follikler, og ca. 20 follikler er nødvendige for at nå en RNA-koncentration på omkring 5 ng / μL.
To homogeniserede ovariefragmenter (4 mm x 2 mm x 1 mm) fra samme patient blev behandlet for at isolere follikler ved hjælp af denne protokol (figur 2). Efter en isolationsprocedure på 1,5 timer blev to populationer af follikler udtaget i henhold til udviklingsstadierne for at sammenligne RNA-mængden og fremhæve relevansen af follikelselektion: 20 follikler på <75 μm (rør 1) og 15 follikler på <200 μm (rør 2). Derefter blev RNA-ekstraktion udført, og 4,8 ng / μL total RNA fra rør 1 og 10,5 ng / μL total RNA fra rør 2 blev opnået under anvendelse af et spektrofotometer til kvantificering (tabel 1). Ved hjælp af dette mikrovolumenspektrofotometersystem blev forholdet 260/280 også målt for at vurdere RNA-renheden. Dette forhold afspejler den potentielle kontaminering med protein eller andre reagenser under ekstraktion og skal være tæt på 2,0 for RNA-prøver. Forholdet 260/280 var henholdsvis 1,89 og 1,74 i rør 1 og rør 2, hvilket validerede prøvernes renhed (tabel 1). RNA-kvaliteten blev derefter verificeret ved at behandle prøverne med automatiseret elektroforese med høj opløsning. Efter denne procedure blev RNA-integritetsnummeret (RIN) estimeret. RIN-værdien, fra 1 (nedbrudt) til 10 (intakt), afspejler niveauet for nedbrydning af RNA i en prøve. RIN-værdierne var henholdsvis 7,1 og 7,9 i rør 1 og rør 2, hvilket validerede kvaliteten af RNA'et fra vores prøver (tabel 1). For at udføre en RT-qPCR blev det samlede volumen af ekstraheret RNA først retrotransskriberet til cDNA. Derefter blev der tilsat 1,25 ng cDNA pr. brønd på en 96-brønds plade med primere til husholdning og målgener (hypoxanthin-guaninphosphoribosyltransferase [HPRT], Kit Ligand [KL] og vækstdifferentieringsfaktor 9 [GDF9]) og SYBR Green mastermix17,18. Efter at have kørt en standardcyklus på et PCR-system i realtid var cyklustærsklerne (Ct) opnået 30,87 (rør 1) og 29,56 (rør 2) for HPRT, 33,5 (rør 1) og 31,77 (rør 2) for KL og 30,71 (rør 1) og 30,57 (rør 2) for GDF9 (tabel 1).
Figur 1: Skematisk gengivelse af metoden til vurdering af RNA-ekstraktion fra isolerede humane ovariefollikler. Tre trin er beskrevet i dette manuskript: vævsoptøning, isolationsproceduren, herunder mekanisk og enzymatisk behandling, og RNA-ekstraktion fra folliklerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Indsamlede follikler efter isolationsprotokollen. (A) Optøet kortikalt væv. B) Vævsskæreren og C-vævskhopperen, der anvendes til at fragmentere vævet. (D-E) Billeder af hentede isolerede follikler observeret med et stereomikroskop med et 10x okular og et bredt zoomområde (1x-6.3x); Forstørrelsesindstillinger på 50x-63x blev anvendt til identifikation af primære og primære follikler. Skalastænger: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Rør | Antal follikler | Folliklernes størrelse (μm) | RNA-koncentration (ng/μL) | 260/280 forhold | RNA-integritetstal (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabel 1: Renheds-, RIN- og cyklustærskler for to homogeniserede ovariefragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryopræservering af ovarievæv er en lovende tilgang til bevarelse af kræftpatienters fertilitet. I klinikken podes optøet kortikalt væv tilbage i patienten efter remission, hvilket muliggør genoptagelse af ovariefunktion og fertilitet19,20. Udover klinisk brug kan resterende ovariefragmenter også doneres til forskning i slutningen af opbevaringsperioden for at studere de mekanismer, der regulerer follikulogenese. Desuden er dette væv særligt nyttigt til udvikling af alternativer til podning, når det ikke er muligt, såsom in vitro-dyrkningssystemer eller kunstige æggestokke. Variationer både inden for og mellem patienter begrænser imidlertid forsøgenes gennemførlighed og reproducerbarhed og fortolkningen af resultaterne. Faktisk falder follikeltætheden dramatisk med alderen, og follikler er ikke ligeligt fordelt mellem fragmenter21. Da antallet af tilgængelige fragmenter er begrænset, skal humant væv anvendes med avancerede teknikker. En bred vifte af teknikker såsom immunhistokemi og immunofluorescens samt in situ hybridisering kan udføres på fast væv for at vurdere protein og genlokalisering 3,18. For at studere de molekylære mekanismer, der regulerer follikulogenese inden for de funktionelle enheder i æggestokken på forskellige udviklingsstadier, kræves isolering af follikler.
Flere undersøgelser har undersøgt effektive metoder til at adskille follikler fra det omgivende væv hos mennesker og dyr22. Antallet af udtagne follikler og kvaliteten af RNA efter ekstraktion kan variere afhængigt af de anvendte teknikker. For at studere follikelaktivering (dvs. primordiale og primære follikler) er der behov for mindst 20 poolede follikler for at udføre standard RT-qPCR. Ved at anvende alternative metoder som RNA- eller cDNA-amplifikation eller indlejret PCR er det muligt at arbejde med færre follikler23,24.
Den tætte natur af æggestokkens cortex gør follikelisolering udfordrende, hvilket har ført til anvendelse af metoder, der involverer en kombination af enzymatisk og mekanisk isolering25. Forskellige typer enzymer kan anvendes, såsom collagenase og DNase26. Undersøgelser har imidlertid rapporteret follikelskader efter enzymatisk fordøjelse, hvilket påvirker yderligere in vitro-udvikling 27,28. For at opretholde follikelintegriteten bruger flere hold i øjeblikket tilpassede enzymatiske fordøjelsesprotokoller eller udfører kun mekanisk isolering til efterfølgende follikulær kultur 25,29,30,31. Dette manuskript rapporterer en enkel og effektiv metode til opnåelse af isolerede follikler til kvantitativ PCR-analyse. Ikke desto mindre kræver alle eksperimenter en indlæringskurve, før de når optimale resultater.
Til grundforskningsformål blev der udviklet en revision af en tidligere protokol for at udvinde en stor mængde follikler uden at påvirke deres integritet13. Behandlingen til genekspressionsanalyse udføres direkte efter isolering for at optimere RNA-kvaliteten. Det er også afgørende at undgå langvarig fordøjelse for at begrænse risikoen for at vælge degenererede follikler. Således forbliver fordøjelsestrinnet afgørende i denne protokol. Tre punkter kræver særlig opmærksomhed: (1) skylning af vævet under den enzymatiske reaktion hvert 10. minut for at tilvejebringe homogen enzymvirkning; 2) kontrol af follikelintegriteten ved at udvælge sunde follikler under proceduren og standse reaktionen med blokerende opløsning, så snart der er observeret skade (3) tilpasning af kollagenasekoncentrationen, da vævsstivhed kan variere mellem patienter alt efter alder. Koncentrationen af kollagenase kan nedsættes (til 0,12 %) i nogle tilfælde for at forhindre skader (dvs. hos præpubertale patienter)32.
I den sidste del af denne protokol blev RNA-ekstraktion fra isolerede follikler udført efter tilpassede instruktioner. Dette tillader en bred vifte af eksperimenter, såsom RT-qPCR eller RNA-sekventering, der giver grundlæggende information om forskellige cellulære processer, der er specifikke for oocyt- og granulosaceller. Talrige protokoller og kits er tilgængelige for at ekstrahere RNA fra væv. Vi har her rapporteret om en effektiv teknik, der anvendes i vores laboratorium, der tillader ekstraktion af en tilstrækkelig mængde RNA til at udføre genekspressionsanalyser ved RT-qPCR. Mens direkte RNA-ekstraktion anbefales stærkt efter follikelisolering for at opretholde RNA-integritet, er det også muligt at fryse de isolerede follikler ved -80 ° C, hvis ekstraktionen ikke kan udføres samme dag. RNA-mængden kan variere afhængigt af folliklernes størrelse, og voksende follikler kan interferere med analysen, hvis de samles med de hvilende follikler. Udvælgelse baseret på størrelse er yderst relevant afhængigt af undersøgelsens mål, især for det første trin i follikulogenese. Differentieringen mellem primære og primære follikler, der udelukkende er baseret på størrelse, er imidlertid fortsat en udfordring med hensyn til korrekt vurdering af primordial follikelgenekspressionsniveauer. Udvælgelsen af primordiale og primære follikler kan udføres baseret på deres morfologi, men diskriminationen mellem dem med et stereomikroskop ved en forstørrelse på 63x er vanskelig.
Afslutningsvis skal eksperimentatoren være opmærksom på udfordringerne ved follikelisolering og tage dem i betragtning ved analyse af resultaterne. Vigtige parametre skal tages i betragtning, såsom (1) intra/inter-variationer i follikeltæthed mellem patienter; (2) follikelintegritet under follikelisolering (3) differentiering mellem forskellige follikelstadier; og (4) RNA-stabilitet og integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af et Excellence of Science (EOS) tilskud (ID: 30443682). I.D. er associeret forsker ved Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
