Summary
Hier beschrijven we een protocol dat beschrijft hoe menselijke ovariële follikels kunnen worden geïsoleerd uit bevroren ontdooid corticale weefsel om genexpressieanalyses uit te voeren.
Abstract
De eierstok is een heterogeen orgaan dat bestaat uit verschillende celtypen. Om de moleculaire mechanismen te bestuderen die optreden tijdens folliculogenese, kan de lokalisatie van eiwitten en genexpressie worden uitgevoerd op vast weefsel. Om de genexpressieniveaus in een menselijke follikel goed te kunnen beoordelen, moet deze complexe en delicate structuur echter worden geïsoleerd. Daarom is een aangepast protocol ontwikkeld dat eerder door het laboratorium van Woodruff is beschreven om follikels (de eicel en de granulosacellen) te scheiden van hun omgeving. Het eierstokschorsweefsel wordt eerst handmatig verwerkt om kleine fragmenten te verkrijgen met behulp van twee hulpmiddelen: een weefselsnijder en een weefselhakselaar. Het weefsel wordt vervolgens enzymatisch verteerd met 0,2% collagenase en 0,02% DNase gedurende ten minste 40 minuten. Deze verteringsstap wordt uitgevoerd bij 37 °C en 5% CO2 en gaat gepaard met mechanisch pipetteren van het medium om de 10 min. Na incubatie worden de geïsoleerde follikels handmatig verzameld met behulp van een gekalibreerde microcapillaire pipet onder microscoopvergroting. Als er nog follikels aanwezig zijn in de stukjes weefsel, wordt de procedure voltooid met handmatige microdissectie. De follikels worden verzameld op ijs in een kweekmedium en worden tweemaal gespoeld in druppeltjes fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Deze verteringsprocedure moet zorgvuldig worden gecontroleerd om verslechtering van de follikel te voorkomen. Zodra de structuur van de follikels aangetast lijkt te zijn of na maximaal 90 min, wordt de reactie gestopt met een 4 °C blokkerende oplossing die 10% foetaal runderserum bevat. Een minimum van 20 geïsoleerde follikels (kleiner dan 75 μm) moet worden verzameld om een voldoende hoeveelheid totaal RNA te verkrijgen na RNA-extractie voor real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Na extractie bereikt de kwantificering van totaal RNA uit 20 follikels een gemiddelde waarde van 5 ng/μL. Het totale RNA wordt vervolgens achteraf getranscribeerd in cDNA en de genen van belang worden verder geanalyseerd met behulp van RT-qPCR.
Introduction
De eierstok is een complex orgaan dat bestaat uit functionele en structurele eenheden, waaronder de follikels in de cortex en het stroma. Folliculogenese, het proces van follikelactivering, groei en rijping van een primordiale rusttoestand naar een volwassen follikel die kan worden bevrucht en om de vroege embryonale ontwikkeling te ondersteunen, wordt op grote schaal bestudeerd in onderzoek1. Het ontrafelen van de mechanismen die dit fenomeen veroorzaken, zou de vruchtbaarheidszorg voor vrouwenkunnen verbeteren 2. Analyses op vast menselijk weefsel maken de beoordeling van eiwitexpressie en genlokalisatie binnen de functionele eenheden van de eierstokmogelijk 3,4. Er zijn echter specifieke technieken nodig om de follikels te dissociëren van de omliggende cortex om de genexpressieniveaus in de ovariële follikels nauwkeurig te beoordelen. Daarom werd in een eerdere studie een follikelisolatietechniek ontwikkeld om analyses van genexpressie rechtstreeks vanuit de functionele eenheid van de eierstok5 mogelijk te maken. Er zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, zoals enzymatische spijsvertering en / of mechanische isolatie, evenals laservangstmicrodissectie, die follikelisolatie in eenstuk weefsel 6,7,8,9 mogelijk maken. Follikelisolatie wordt veel gebruikt, hetzij met menselijk of dierlijk eierstokweefsel, om de genexpressieprofielen van follikels in alle stadia van ontwikkeling te evalueren10,11,12. Een optimale isolatieprocedure moet echter rekening houden met de fragiele structuur van de follikel in de dichte cortex en moet daarom met zorg worden uitgevoerd om schade te voorkomen7. Dit manuscript beschrijft een procedure, aangepast van een protocol beschreven door Woodruff's laboratorium, om menselijke follikels te isoleren uit bevroren ontdooide ovariële cortex om genexpressieanalyses uit te voeren13.
De eerste stap van ovariële follikelisolatie van bevroren menselijk weefsel is de ontdooiingsprocedure. Dit proces wordt uitgevoerd op basis van het klinische protocol dat wordt gebruikt voor het enten van gecryopreserveerd ovariumweefsel, zoals eerder beschreven14,15. Het proces is gericht op het verwijderen van de cryoprotectieve middelen door de ovariële cortex te spoelen in afnemende concentraties van het medium. Vervolgens wordt het weefsel gefragmenteerd voordat enzymatische en mechanische isolatie plaatsvindt om de follikels op te halen. Follikels in verschillende stadia kunnen worden onderscheiden met behulp van een stereomicroscoop met hoge vergroting en optica van goede kwaliteit om de interessante te isoleren. Elke geïsoleerde follikel wordt gemeten met behulp van een liniaal geïntegreerd in de microscoop, en de follikels kunnen worden samengevoegd volgens hun ontwikkelingsstadium: primordiale follikels (30 μm), primaire follikels (60 μm), secundaire follikels (120-200 μm) en antrale follikels (>200 μm)16. Verdere classificatie kan worden uitgevoerd volgens de morfologie van de follikels: primordiale follikels hebben één laag afgeplatte granulosacellen (GC's), primaire follikels hebben één laag kubusvormige GC's, secundaire follikels hebben ten minste twee lagen kuboïdale GC's en de aanwezigheid van een holte tussen de GC's kenmerkt het antrale stadium. Wanneer follikels van belang worden geselecteerd, wordt RNA-extractie uitgevoerd. De hoeveelheid en kwaliteit van RNA worden geëvalueerd voorafgaand aan de real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) (figuur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit project werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Erasme Ziekenhuis (Brussel, België). De patiënt die in dit protocol was opgenomen, onderging cryopreservatie van ovariumweefsel (OTC) voor vruchtbaarheidsbehoud vóór blootstelling aan chemotherapie in 2000. De patiënte tekende schriftelijke toestemming om haar resterende ingevroren weefsel aan het einde van de bewaartermijn te doneren aan onderzoek.
1. Ontdooien van gecryopreserveerd eierstokweefsel
- Maak een plaat met 6 putten met vijf ontdooioplossingen. De eerste put bevat 5 ml cryoprotectantoplossing bestaande uit Leibovitz-15-medium, 0,1 mol/l sucrose, 1,5 mol/l dimethylsulfoxide (DMSO) en 1% humaan serumalbumine (HSA). De volgende putjes bevatten 5 ml Leibovitz-15 medium met afnemende concentraties cryoprotectant: 1 mol/L, 0,5 mol/L en 2 x 0 mol/L DMSO.
OPMERKING: De cryoprotectantoplossing kan verschillen volgens het protocol dat in de vruchtbaarheidskliniek wordt gebruikt. - Verwijder een injectieflacon met een ovariële corticale fragment uit vloeibare stikstof in overeenstemming met de veiligheidsregels (cryogene handschoenen, beschermende bril en gesloten schoenen) en houd de buis gedurende 30 s op kamertemperatuur (RT).
- Week de injectieflacon gedurende 2 minuten in dubbel gedestilleerd water bij RT met zachte agitatie voordat u de injectieflacon onder een verticale kap opent en direct overbrengt in de eerste put van de 6-putplaat (op ijs).
- Breng het fragment achtereenvolgens over in elk putje van de 6-putplaat, waarbij elk een afnemende concentratie cryoprotectant bevat in 5 ml Leibovitz-15-medium. Roer het weefsel in elk medium voorzichtig gedurende 5 minuten (op ijs).
2. Follikelisolatie
OPMERKING: Alle experimenten worden uitgevoerd met RNase-vrije materialen en onder een verticale kap.
- Breng het ontdooide weefsel over in een 2 mm gerasterde petrischaal gevuld met 10 ml dissectiemedium (Leibovitz-15 medium, natriumpyruvaat [2 mmol / L], L-glutamine [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicilline G [30 μg / ml] en streptomycine [50 μg / ml]). Pas indien nodig de grootte van het weefsel aan met een scalpel.
OPMERKING: Afhankelijk van het klinische protocol kan de grootte van het bevroren weefsel variëren van 8 mm x 4 mm x 1 mm tot 4 mm x 2 mm x 1 mm. Voor dit protocol zijn twee stroken van 4 mm x 2 mm x 1 mm gebruikt. - Stapel de drie stukken van de weefselsnijder op, plaats het fragment tussen de twee blokken en snijd het fragment in tweeën met een mes, glijdend door de blokken om twee fragmenten van 0,5 mm dikte te verkrijgen.
- Gebruik de tissue chopper om het fragment te snijden en kleinere stukjes te verkrijgen. Snijd indien nodig de resterende stukjes handmatig met een scalpel totdat het weefsel volledig is verbrijzeld.
- Breng het gefragmenteerde weefsel over in een gerasterde petrischaal gevuld met 7 ml verteringsmedium (kweekmedium [McCoy's 5A-medium, 3 mmol / L glutamine, 0,1% HSA, 30 μg / ml penicilline G, 50 μg / ml streptomycine, 2,5 μg / ml transferrine, 4 ng / ml selenium en 50 μg / ml ascorbinezuur] aangevuld met 0,2% collagenase en 0,02% DNase).
- Zet de schaal in de couveuse bij 5% CO2 en 37 °C. Haal elke 10 minuten de petrischaal uit de couveuse en spoel het weefsel door op en neer te pipetteren met een pipet van 1 ml.
- Na 45 minuten incubatie in het verteringsmedium, plaatst u de schaal onder een stereomicroscoop met een vergrotingsbereik van 5x-6,3x en haalt u de follikels op met behulp van een microcapillaire pipet. Selecteer de follikels van belang en isoleer ze door ze op te zuigen met een mondpipet.
OPMERKING: Pipetteren in de mond moet zorgvuldig worden uitgevoerd om het verlies van materiaal in de pijp en verontreiniging te voorkomen. - Als de follikels vast blijven zitten in een stuk cortex, isoleer ze dan mechanisch met twee spuiten van 27 G door de cortex af te scheuren met de punt van de spuiten om follikels uit het stroma vrij te maken.
OPMERKING: Raak de follikels niet aan met de spuiten om beschadiging ervan te voorkomen. - Breng de follikels met het microcapillair over in een 4-wellige plaat met druppels van 15 μL van het gekalibreerde kweekmedium bedekt met 500 μL oliecultuur (1 tot 10 follikels per druppel). Deze stap handhaaft de levensvatbaarheid van de follikel tijdens het verzamelproces. Spoel aan het einde van de procedure de follikels tweemaal gedurende 5 s telkens in twee druppels 15 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bedekt met 500 μL oliecultuur (op ijs).
- Verzamel 20 follikels met een minimale hoeveelheid PBS met behulp van de mondpipet (maximaal 10 μL) in een lege buis en houd de buis op ijs.
OPMERKING: Voor RNA-stabiliteit is het cruciaal om stap 2.8 en stap 2.9 op ijs uit te voeren. Ongeveer 20 follikels (<75 μm) zijn nodig om voldoende RNA te hebben voor standaard RT-qPCR (SYBR Green). - Na maximaal 90 minuten incubatie in het verteringsmedium stopt u de enzymatische reactie door in de petrischaal een overmaat aan koude (4 °C) blokkerende oplossing (7,5 ml) toe te voegen, bestaande uit kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS).
OPMERKING: De blokkerende oplossing kan worden toegevoegd zodra de experimentator follikels op de plaat ziet plakken of beschadigde follikels (asymmetrische vorm of donkerder gekleurde follikels). Het wordt geadviseerd om follikelisolatie uit te voeren binnen een maximale periode van 2,5 uur om folliculaire schade te voorkomen en om RNA-extractie onmiddellijk na isolatie uit te voeren.
3. RNA-extractie
OPMERKING: RNA-extractie wordt uitgevoerd volgens de instructies die bij een RNA-extractiekit worden geleverd door de elutievolumes aan te passen.
- Suspensie van de geïsoleerde follikels door 100 μL van de lysisoplossing die bij de RNA-extractiekit wordt geleverd, toe te voegen aan de buis met de follikels onder een chemische kap en vortex met een hoge snelheid (2.500 tpm / min) om de structuur van de follikels te breken. Voeg 50 μL ethanol (100%) toe aan de buis en draai kort met een hoge snelheid.
OPMERKING: Aangezien de lysisbuffer 2-mercaptoethanol en thiocyaninezuur bevat, moet deze stap met voorzichtigheid worden uitgevoerd onder een chemische kap. - Breng het totale volume van de buis (ongeveer 160 μL) over naar een microfilterpatroon bestaande uit een kolom en een opvangbuis en centrifugeer deze gedurende 10 s bij 16,363 x g bij 4 °C. Was de kolom met 180 μL wasoplossing 1, meegeleverd met de kit, en centrifugeer de buis gedurende 10 s bij 16,363 x g bij 4 °C.
- Voeg 180 μL wasoplossing 2/3, meegeleverd met de kit, toe aan de kolom en centrifugeer gedurende 10 s bij 16,363 x g bij 4 °C. Voer deze stap twee keer uit. Centrifugeer de buis nog een laatste keer gedurende 1 minuut om het filter te drogen en plaats een nieuwe opvangbuis onder de patroon.
- Voer de elutie van de nucleïnezuren uit in twee stappen:
- Voeg eerst 8 μL warme elutieoplossing (75 °C) toe aan het filter, wacht 1 minuut bij RT en centrifugeer gedurende 30 s bij 16,363 x g bij 4 °C.
- Herhaal deze stap met 7 μL elutieoplossing.
OPMERKING: De buis met de geëlueerde nucleïnezuren moet op ijs worden bewaard. Om DNA-besmetting te voorkomen, wordt een aanvullende stap van DNA-degradatie sterk aanbevolen- stap 3.5.
- Incubeer de buis met 2 IE DNase en 1x DNase buffer gedurende 20 min bij 37 °C. Blokkeer de enzymatische activiteit met 1/10 DNase inactivatiereagens gedurende 2 min bij RT.
- Centrifugeer de buis gedurende 1,5 minuut bij 16,363 x g bij 4 °C. Verzamel ten slotte de suspensie die het RNA bevat en breng deze over naar een nieuwe buis.
- Beoordeel de hoeveelheid RNA in het monster met behulp van een spectrofotometer (NanoDrop 2000-software > Nucleic Acid > RNA). Gebruik 1 μL elutieoplossing als blanco en meet de RNA-hoeveelheid geëxtraheerd uit geïsoleerde follikels met 1 μL oplossing.
- Controleer de 260/280-verhouding op RNA-zuiverheid (ongeveer 2,0). Bewaar het monster bij −80 °C of schrijf het direct achteraf om RT-qPCR uit te voeren.
OPMERKING: Om de RNA-integriteit te beoordelen, kan het monster worden verwerkt met een geautomatiseerd elektroforesesysteem met hoge resolutie voor of na het invriezen bij −80 °C. In dit werk werd, na retrotranscriptie, RT-qPCR uitgevoerd met de volgende cyclus:
Houd fase vast met 20 s bij 50 °C en 10 min bij 95 °C
40 PCR-cycli met 15 s bij 95 °C en 1 min bij 60 °C
Smeltcurvefase met 15 s bij 95 °C, 1 min bij 60 °C, 30 s bij 95 °C en 15 s bij 60 °C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van deze isolatieprocedure kan de experimentator follikels uit de stromale omgeving halen om specifieke genexpressieanalyses uit te voeren. Op basis van de grootte en morfologie van de follikels is het mogelijk om de verschillende stadia van folliculogenese te onderscheiden. De experimentator kan follikels van belang selecteren op basis van hun grootte met behulp van een aangepaste microcapillaire pipet. Door een microcapillair van maximaal 75 μm te gebruiken, is het mogelijk om primordiale en primaire follikels te onderscheiden van secundaire, antrale en volwassen follikels. Bovendien kan de experimentator het follikelstadium bevestigen volgens de follikelmorfologie. Bij het bestuderen van follikelactivatie worden rustige en primaire follikels geselecteerd en zijn ongeveer 20 follikels nodig om een RNA-concentratie van ongeveer 5 ng / μL te bereiken.
Twee gehomogeniseerde ovariumfragmenten (4 mm x 2 mm x 1 mm) van dezelfde patiënt werden verwerkt om follikels te isoleren met behulp van dit protocol (figuur 2). Na een isolatieprocedure van 1,5 uur werden twee populaties follikels opgehaald volgens de ontwikkelingsstadia om de RNA-hoeveelheid te vergelijken en de relevantie van follikelselectie te benadrukken: 20 follikels van <75 μm (buis 1) en 15 follikels van <200 μm (buis 2). Vervolgens werd RNA-extractie uitgevoerd en werd 4,8 ng/μL totaal RNA uit buis 1 en 10,5 ng/μL totaal RNA uit buis 2 verkregen met behulp van een spectrofotometer voor kwantificering (tabel 1). Met behulp van dit microvolumespectrofotometersysteem werd ook de 260/280-verhouding gemeten om de RNA-zuiverheid te beoordelen. Deze verhouding weerspiegelt de potentiële besmetting door eiwitten of andere reagentia tijdens de extractie en moet dicht bij 2,0 liggen voor RNA-monsters. De 260/280-verhoudingen waren respectievelijk 1,89 en 1,74 in buis 1 en buis 2, wat de zuiverheid van de monsters valideerde (tabel 1). De RNA-kwaliteit werd vervolgens geverifieerd door de monsters te verwerken met geautomatiseerde elektroforese met hoge resolutie. Volgens deze procedure werd het RNA-integriteitsgetal (RIN) geschat. De RIN-waarde, van 1 (afgebroken) tot 10 (intact), weerspiegelt het niveau van afbraak van RNA in een monster. De RIN-waarden waren respectievelijk 7,1 en 7,9 in buis 1 en buis 2, wat de kwaliteit van het RNA uit onze monsters valideerde (tabel 1). Om een RT-qPCR uit te voeren, werd het totale volume geëxtraheerd RNA eerst retrotranscribeerd in cDNA. Vervolgens werd 1,25 ng cDNA per put toegevoegd op een 96-well plaat, met primers voor huishouding en doelgenen (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase [HPRT], Kit Ligand [KL], en Growth Differentiation Factor 9 [GDF9]) en SYBR Green master mix17,18. Na het uitvoeren van een standaardcyclus op een real-time PCR-systeem waren de verkregen cyclusdrempels (Ct) 30,87 (buis 1) en 29,56 (buis 2) voor HPRT, 33,5 (buis 1) en 31,77 (buis 2) voor KL, en 30,71 (buis 1) en 30,57 (buis 2) voor GDF9 (tabel 1).
Figuur 1: Schematische weergave van de methode voor het beoordelen van RNA-extractie uit geïsoleerde menselijke ovariële follikels. In dit manuscript worden drie stappen beschreven: weefselontdooiing, de isolatieprocedure, inclusief mechanische en enzymatische verwerking, en RNA-extractie uit de follikels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Verzamelde follikels volgens het isolatieprotocol. (A) Ontdooid corticale weefsel. (B) De weefselsnijder en (C) weefselhakselaar die worden gebruikt om het weefsel te fragmenteren. (D-E) Beelden van opgehaalde geïsoleerde follikels waargenomen met een stereomicroscoop met een 10x oculair en een breed zoombereik (1x-6,3x); Vergrotingsinstellingen van 50x-63x werden gebruikt voor de identificatie van primordiale en primaire follikels. Scalebars: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Buis | Aantal follikels | Follikels grootte (μm) | RNA-concentratie (ng/μL) | 260/280 verhouding | RNA-integriteitsnummer (RIN) | Hprt Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabel 1: Zuiverheid, RIN en cyclusdrempels van twee gehomogeniseerde ovariumfragmenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cryopreservatie van eierstokweefsel is een veelbelovende aanpak voor het behoud van de vruchtbaarheid van kankerpatiënten. In de kliniek wordt ontdooid corticale weefsel na remissie terug in de patiënt geënt, waardoor de ovariële functie en vruchtbaarheid kunnen worden hervat19,20. Naast klinisch gebruik kunnen resterende ovariumfragmenten ook worden gedoneerd voor onderzoek aan het einde van de opslagperiode om de mechanismen te bestuderen die folliculogenese reguleren. Bovendien is dit weefsel bijzonder nuttig voor het ontwikkelen van alternatieven voor enten wanneer dit niet haalbaar is, zoals in vitro kweeksystemen of kunstmatige eierstokken. Variaties zowel binnen als tussen patiënten beperken echter de haalbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimenten en de interpretatie van de resultaten. Inderdaad, de folliculaire dichtheid neemt dramatisch af met de leeftijd en de follikels zijn niet gelijk verdeeld over fragmenten21. Omdat het aantal beschikbare fragmenten beperkt is, moet menselijk weefsel worden gebruikt met geavanceerde technieken. Een breed scala aan technieken zoals immunohistochemie en immunofluorescentie, evenals in situ hybridisatie, kan worden uitgevoerd op vast weefsel om eiwit- en genlokalisatie te beoordelen 3,18. Om de moleculaire mechanismen te bestuderen die folliculogenese reguleren binnen de functionele eenheden van de eierstok in verschillende stadia van ontwikkeling, is de isolatie van follikels vereist.
Verschillende studies hebben effectieve methoden onderzocht om follikels te scheiden van het omliggende weefsel bij menselijke en diersoorten22. Het aantal opgehaalde follikels en de kwaliteit van RNA na extractie kunnen variëren afhankelijk van de gebruikte technieken. Om follikelactivatie (d.w.z. primordiale en primaire follikels) te bestuderen, zijn ten minste 20 gepoolde follikels nodig om standaard RT-qPCR uit te voeren. Door gebruik te maken van alternatieve methoden zoals RNA of cDNA amplificatie of geneste PCR is het mogelijk om met minder follikelste werken 23,24.
De dichte aard van de ovariële cortex maakt follikelisolatie uitdagend, wat heeft geleid tot het gebruik van methoden met een combinatie van enzymatische en mechanische isolatie25. Er kunnen verschillende soorten enzymen worden gebruikt, zoals collagenase en DNase26. Studies hebben echter follikelschade gemeld na enzymatische spijsvertering, wat van invloed is op de verdere in vitro ontwikkeling27,28. Om de follikelintegriteit te behouden, gebruiken verschillende teams momenteel aangepaste enzymatische verteringsprotocollen of voeren ze alleen mechanische isolatie uit voor daaropvolgende folliculaire cultuur 25,29,30,31. Dit manuscript rapporteert een eenvoudige en efficiënte methode om geïsoleerde follikels te verkrijgen voor kwantitatieve PCR-analyse. Niettemin vereisen alle experimenten een leercurve voordat ze optimale resultaten bereiken.
Voor fundamentele onderzoeksdoeleinden werd een herziening van een eerder protocol ontwikkeld om een grote hoeveelheid follikels op te halen zonder hun integriteit aan te tasten13. De verwerking voor genexpressie-analyse wordt direct na isolatie uitgevoerd om de RNA-kwaliteit te optimaliseren. Het is ook cruciaal om langdurige spijsvertering te voorkomen om het risico op het selecteren van gedegenereerde follikels te beperken. De verteringsstap blijft dus cruciaal in dit protocol. Drie punten vereisen specifieke aandacht: (1) het spoelen van het weefsel tijdens de enzymatische reactie om de 10 minuten om een homogene enzymwerking te bieden; (2) de controle van de follikelintegriteit door tijdens de procedure gezonde follikels te selecteren en de reactie met blokkerende oplossing te stoppen zodra schade wordt waargenomen; (3) de aanpassing van de collagenaseconcentratie, aangezien de weefselstijfheid van patiënt tot patiënt kan variëren naargelang de leeftijd. De concentratie van collagenase kan in sommige gevallen worden verlaagd (tot 0,12%) om schade te voorkomen (d.w.z. bij prepuberale patiënten)32.
In het laatste deel van dit protocol werd RNA-extractie uit geïsoleerde follikels uitgevoerd volgens aangepaste instructies. Dit maakt een breed scala aan experimenten mogelijk, zoals RT-qPCR of RNA-sequencing, die fundamentele informatie bieden over verschillende cellulaire processen die specifiek zijn voor eicel- en granulosacellen. Er zijn tal van protocollen en kits beschikbaar om RNA uit weefsel te extraheren. We hebben hier een efficiënte techniek gemeld die in ons laboratorium wordt gebruikt en die de extractie van een voldoende hoeveelheid RNA mogelijk maakt om genexpressieanalyses door RT-qPCR uit te voeren. Hoewel directe RNA-extractie ten zeerste wordt aanbevolen na follikelisolatie om de RNA-integriteit te behouden, is het ook mogelijk om de geïsoleerde follikels in te vriezen bij −80 °C als de extractie niet dezelfde dag kan worden uitgevoerd. De RNA-hoeveelheid kan variëren afhankelijk van de grootte van de follikels en groeiende follikels kunnen de analyse verstoren als ze worden samengevoegd met de rustige follikels. Selectie op basis van grootte is uiterst relevant, afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek, vooral voor de eerste stap van folliculogenese. Het onderscheid tussen primordiale en primaire follikels op basis van alleen grootte blijft echter een uitdaging in termen van het goed beoordelen van primordiale follikelgenexpressieniveaus. De selectie van primordiale en primaire follikels kan worden uitgevoerd op basis van hun morfologie, maar het onderscheid tussen hen met een stereomicroscoop bij een vergroting van 63x is moeilijk.
Kortom, de experimentator moet zich bewust zijn van de uitdagingen van follikelisolatie en hiermee rekening houden bij het analyseren van de resultaten. Er moet rekening worden gehouden met belangrijke parameters, zoals (1) intra-/inter-variaties in follikeldichtheid tussen patiënten; (2) follikelintegriteit tijdens follikelisolatie; (3) differentiatie tussen verschillende follikelsstadia; en (4) RNA-stabiliteit en -integriteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Excellence of Science (EOS) beurs (ID: 30443682). I.D. is associate researcher bij het Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
