Summary
यहां, हम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए जमे हुए-पिघले हुए कॉर्टिकल ऊतक से मानव डिम्बग्रंथि के रोम को अलग करने के तरीके को रेखांकित करने वाले प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
Abstract
अंडाशय एक विषम अंग है जो विभिन्न कोशिका प्रकारों से बना है। कूपिकोजेनेसिस के दौरान होने वाले आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, प्रोटीन और जीन अभिव्यक्ति का स्थानीयकरण निश्चित ऊतक पर किया जा सकता है। हालांकि, मानव कूप में जीन अभिव्यक्ति के स्तर का ठीक से आकलन करने के लिए, इस जटिल और नाजुक संरचना को अलग किया जाना चाहिए। इसलिए, वुड्रफ की प्रयोगशाला द्वारा पहले वर्णित एक अनुकूलित प्रोटोकॉल को उनके आसपास के वातावरण से रोम (अंडाणु और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं) को अलग करने के लिए विकसित किया गया है। डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल ऊतक को पहले दो उपकरणों का उपयोग करके छोटे टुकड़े प्राप्त करने के लिए मैन्युअल रूप से संसाधित किया जाता है: एक ऊतक स्लाइसर और एक ऊतक चॉपर। ऊतक को तब कम से कम 40 मिनट के लिए 0.2% कोलेजनेस और 0.02% डीनेस के साथ एंजाइमेटिक रूप से पचाया जाता है। यह पाचन चरण 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर किया जाता है और हर 10 मिनट में माध्यम की यांत्रिक पाइपिंग के साथ होता है। इनक्यूबेशन बाद, पृथक रोम को माइक्रोस्कोप आवर्धन के तहत कैलिब्रेटेड माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करके मैन्युअल रूप से एकत्र किया जाता है। यदि रोम अभी भी ऊतक के टुकड़ों में मौजूद हैं, तो प्रक्रिया मैन्युअल माइक्रोडिसेक्शन के साथ पूरी होती है। रोम को एक कल्चर माध्यम में बर्फ पर एकत्र किया जाता है और फॉस्फेट-बफर्ड खारा घोल की बूंदों में दो बार धोया जाता है। कूप बिगड़ने से बचने के लिए इस पाचन प्रक्रिया को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। जैसे ही रोम की संरचना से समझौता किया जाता है या अधिकतम 90 मिनट के बाद, प्रतिक्रिया को 4 डिग्री सेल्सियस ब्लॉकिंग समाधान के साथ रोक दिया जाता है जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम होता है। वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) के लिए आरएनए निष्कर्षण के बाद कुल आरएनए की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 20 पृथक रोम (75 μm से कम आकार) एकत्र किए जाने चाहिए। निष्कर्षण के बाद, 20 रोम से कुल आरएनए का परिमाणीकरण 5 एनजी / μL के औसत मूल्य तक पहुंच जाता है। कुल आरएनए को तब सीडीएनए में रेट्रोट्रांसक्रिप्ट किया जाता है, और आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके रुचि के जीन का विश्लेषण किया जाता है।
Introduction
अंडाशय एक जटिल अंग है जो कार्यात्मक और संरचनात्मक इकाइयों से बना है, जिसमें कॉर्टेक्स और स्ट्रोमा के भीतर रोम शामिल हैं। फॉलिकुलोजेनेसिस, एक आदिम अवस्था से एक परिपक्व कूप तक कूप सक्रियण, विकास और परिपक्वता की प्रक्रिया जो निषेचित होने और प्रारंभिक भ्रूण के विकास का समर्थन करने में सक्षम है, अनुसंधान1 में व्यापक रूप से अध्ययन किया गया है। इस घटना को चलाने वाले तंत्र को उजागर करने से महिलाओं के लिए प्रजनन देखभाल में सुधार हो सकताहै। निश्चित मानव ऊतक पर विश्लेषण अंडाशय 3,4 की कार्यात्मक इकाइयों के भीतर प्रोटीन अभिव्यक्ति और जीन स्थानीयकरण के मूल्यांकन की अनुमति देता है। हालांकि, डिम्बग्रंथि के रोम के भीतर जीन अभिव्यक्ति के स्तर का सही आकलन करने के लिए आसपास के कॉर्टेक्स से रोम को अलग करने के लिए विशिष्ट तकनीकों की आवश्यकता होती है। इसलिए, पिछले अध्ययन में, अंडाशय5 की कार्यात्मक इकाई से सीधे जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए एक कूप अलगाव तकनीक विकसित की गई थी। विभिन्न दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जैसे कि एंजाइमेटिक पाचन और / या यांत्रिक अलगाव, साथ ही लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन, जो ऊतक 6,7,8,9 के टुकड़े के भीतर कूप अलगाव की अनुमति देता है। विकास के सभी चरणों में रोम के जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का मूल्यांकन करने के लिए, मानव या पशु डिम्बग्रंथि ऊतक के साथ कूप अलगाव का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। हालांकि, एक इष्टतम अलगाव प्रक्रिया को घने कॉर्टेक्स के भीतर कूप की नाजुक संरचना को ध्यान में रखना चाहिए और इसलिए, किसीभी क्षति से बचने के लिए देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। यह पांडुलिपि एक प्रक्रिया का वर्णन करती है, जिसे वुड्रफ की प्रयोगशाला द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल से अनुकूलित किया गया है, ताकि जीनअभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए जमे हुए-पिघले हुए डिम्बग्रंथि प्रांतस्था से मानव रोम को अलग किया जा सके।
जमे हुए मानव ऊतक से डिम्बग्रंथि कूप अलगाव का पहला चरण पिघलने की प्रक्रिया है। यह प्रक्रिया क्रायोसंरक्षित डिम्बग्रंथि ऊतक के ग्राफ्टिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले नैदानिक प्रोटोकॉल के आधार पर की जाती है, जैसा कि पहले वर्णित14,15 था। इस प्रक्रिया का उद्देश्य माध्यम की घटती सांद्रता में डिम्बग्रंथि प्रांतस्था को धोकर क्रायोप्रोटेक्टेंट एजेंटों को हटाना है। फिर, रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक और यांत्रिक अलगाव से पहले ऊतक खंडित हो जाता है। विभिन्न चरणों में रोम को उच्च आवर्धन और अच्छी गुणवत्ता वाले प्रकाशिकी के साथ स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके अलग किया जा सकता है ताकि रुचि के लोगों को अलग किया जा सके। प्रत्येक पृथक कूप को माइक्रोस्कोप में एकीकृत एक शासक का उपयोग करके मापा जाता है, और रोम को उनके विकास चरण के अनुसार पूल किया जा सकता है: आदिम रोम (30 μm), प्राथमिक रोम (60 μm), द्वितीयक रोम (120-200 μm), और एंट्रल फॉलिकल्स (>200 μm)16। रोम की आकृति विज्ञान के अनुसार आगे का वर्गीकरण किया जा सकता है: आदिम रोम में चपटा ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (जीसी) की एक परत होती है, प्राथमिक रोम में घनाकार जीसी की एक परत होती है, द्वितीयक रोम में घनाभ जीसी की कम से कम दो परतें होती हैं, और जीसी के बीच एक गुहा की उपस्थिति एंट्रल चरण की विशेषता है। जब रुचि के रोम का चयन किया जाता है, तो आरएनए निष्कर्षण किया जाता है। आरएनए मात्रा और गुणवत्ता का मूल्यांकन वास्तविक समय मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर) (चित्रा 1) से पहले किया जाता है।
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Protocol
इस परियोजना को इरास्मे अस्पताल नैतिक समिति (ब्रुसेल्स, बेल्जियम) द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में शामिल रोगी को 2000 में कीमोथेरेपी एक्सपोजर से पहले प्रजनन संरक्षण के लिए डिम्बग्रंथि ऊतक क्रायोप्रिजर्वेशन (ओटीसी) से गुजरना पड़ा। रोगी ने भंडारण अवधि के अंत में अनुसंधान के लिए अपने अवशिष्ट जमे हुए ऊतक को दान करने के लिए सूचित लिखित सहमति पर हस्ताक्षर किए।
1. क्रायोसंरक्षित डिम्बग्रंथि ऊतक का पिघलना
- एक 6-अच्छी प्लेट तैयार करें जिसमें पांच पिघलने वाले घोल हों। पहले कुएं में 5 मिलीलीटर क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान होता है जो लीबोविट्ज़ -15 मध्यम, 0.1 मोल / एल सुक्रोज, 1.5 मोल / एल डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ), और 1% मानव सीरम एल्बुमिन (एचएसए) से बना होता है। अगले कुओं में क्रायोप्रोटेक्टेंट की घटती सांद्रता के साथ 5 एमएल लीबोविट्ज़ -15 माध्यम होता है: 1 मोल / एल, 0.5 मोल / एल, और 2 x 0 मोल / एल डीएमएसओ।
नोट: क्रायोप्रोटेक्टेंट समाधान प्रजनन क्लिनिक में उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के अनुसार भिन्न हो सकता है। - सुरक्षा नियमों (क्रायोजेनिक दस्ताने, सुरक्षात्मक चश्मे, और बंद जूते) के अनुपालन में तरल नाइट्रोजन से डिम्बग्रंथि कॉर्टिकल टुकड़े वाली शीशी को हटा दें, और ट्यूब को 30 सेकंड के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर रखें।
- शीशी को ऊर्ध्वाधर हुड के नीचे खोलने से पहले आरटी में 2 मिनट के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी में भिगोदें और सीधे इसे 6-वेल प्लेट (बर्फ पर) के पहले कुएं में स्थानांतरित करें।
- टुकड़े को क्रमिक रूप से 6-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें, जिसमें प्रत्येक में 5 एमएल लीबोविट्ज़ -15 माध्यम में क्रायोप्रोटेक्टेंट की घटती सांद्रता होती है। धीरे-धीरे प्रत्येक माध्यम में ऊतक को 5 मिनट (बर्फ पर) के लिए हिलाएं।
2. कूप अलगाव
नोट: सभी प्रयोग RNase-मुक्त सामग्री का उपयोग करके और एक ऊर्ध्वाधर हुड के तहत आयोजित किए जाते हैं।
- पिघले हुए ऊतक को 10 मिलीलीटर विच्छेदन माध्यम (लीबोविट्ज़ -15 मध्यम, सोडियम पाइरूवेट [2 mmol / L], एल-ग्लूटामाइन [2 mmol / L], HSA [0.3%), पेनिसिलिन G [30 μg / mL], और स्ट्रेप्टोमाइसिन [50 μg / mL] से भरे 2 मिमी ग्रिडेड पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। यदि आवश्यक हो तो स्केलपेल के साथ ऊतक के आकार को समायोजित करें।
नोट: नैदानिक प्रोटोकॉल के आधार पर, जमे हुए ऊतक का आकार 8 मिमी x 4 मिमी x 1 मिमी से 4 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी तक भिन्न हो सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, 4 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी की दो स्ट्रिप्स का उपयोग किया गया था। - ऊतक स्लाइसर के तीन टुकड़ों को ढेर करें, टुकड़े को दो ब्लॉकों के बीच रखें, और ब्लेड का उपयोग करके टुकड़े को आधा काट लें, 0.5 मिमी मोटाई के दो टुकड़े प्राप्त करने के लिए ब्लॉकों के माध्यम से स्लाइड करें।
- टुकड़े को काटने और छोटे टुकड़े प्राप्त करने के लिए ऊतक चॉपर का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो शेष टुकड़ों को स्केलपेल के साथ मैन्युअल रूप से काट लें जब तक कि ऊतक पूरी तरह से बिखर न जाए।
- खंडित ऊतक को 7 मिलीलीटर पाचन माध्यम (कल्चर माध्यम [मैककॉय के 5 ए माध्यम, 3 mmol / L ग्लूटामाइन, 0.1% HSA, 30 μg / mL पेनिसिलिन G, 50 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2.5 μg / mL ट्रांसफरिन, 4 ng / mL सेलेनियम, और 50 μg / mL एस्कॉर्बिक एसिड] से भरे एक ग्रिडेड पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
- पकवान को इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। हर 10 मिनट में, पेट्री डिश को इनक्यूबेटर से बाहर निकालें, और 1 एमएल पिपेट के साथ ऊपर और नीचे पाइप करके ऊतक को फ्लश करें।
- पाचन माध्यम में 45 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, पकवान को 5x-6.3x की आवर्धन सीमा के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे रखें, और एक माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करके रोम को पुनः प्राप्त करें। रुचि के रोम का चयन करें, और उन्हें मुंह के पिपेट के साथ चूसकर अलग करें।
नोट: पाइप में सामग्री के नुकसान और संदूषण से बचने के लिए मुंह की पाइपिंग सावधानी से की जानी चाहिए। - यदि रोम कॉर्टेक्स के एक टुकड़े में फंस जाते हैं, तो स्ट्रोमा से रोम को छोड़ने के लिए सिरिंज की नोक के साथ कॉर्टेक्स को चीरकर उन्हें दो 27 जी सिरिंज के साथ यांत्रिक रूप से अलग करें।
नोट: उन्हें नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए सिरिंज के साथ रोम को न छुएं। - 500 μL तेल संस्कृति (1 से 10 रोम प्रति बूंद) द्वारा कवर किए गए कैलिब्रेटेड कल्चर माध्यम के 15 μL की बूंदों वाले 4-वेल प्लेट में माइक्रोकेशिका के साथ रोम को स्थानांतरित करें। यह चरण संग्रह प्रक्रिया के दौरान कूप व्यवहार्यता को बनाए रखता है। प्रक्रिया के अंत में, रोम को 500 μL तेल संस्कृति (बर्फ पर) द्वारा कवर किए गए फॉस्फेट-बफर्ड खारा घोल (पीबीएस) के 15 μL की दो बूंदों में हर बार 5 सेकंड के लिए दो बार कुल्ला करें।
- एक खाली ट्यूब में मुंह के पिपेट (अधिकतम 10 μL) का उपयोग करके पीबीएस की न्यूनतम मात्रा के साथ 20 रोम एकत्र करें, और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
नोट: आरएनए स्थिरता के लिए, बर्फ पर चरण 2.8 और चरण 2.9 करना महत्वपूर्ण है। मानक आरटी-क्यूपीसीआर (एसवाईबीआर ग्रीन) के लिए पर्याप्त आरएनए होने के लिए लगभग 20 रोम (<75 μm) की आवश्यकता होती है। - पाचन माध्यम में अधिकतम 90 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, पेट्री डिश में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक कल्चर माध्यम से बने ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) अवरोधक समाधान (7.5 एमएल) की अधिकता जोड़कर एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया को रोकें।
नोट: ब्लॉकिंग समाधान को जोड़ा जा सकता है जैसे ही प्रयोगकर्ता प्लेट या क्षतिग्रस्त रोम (असममित आकार या गहरे रंग के रोम) पर चिपके हुए रोम देखता है। कूपिक क्षति से बचने और अलगाव के तुरंत बाद आरएनए निष्कर्षण करने के लिए अधिकतम 2.5 घंटे की अवधि के भीतर कूप अलगाव करने की सलाह दी जाती है।
3. आरएनए निष्कर्षण
नोट: आरएनए निष्कर्षण क्षालन मात्रा को अनुकूलित करके आरएनए निष्कर्षण किट के साथ प्रदान किए गए निर्देशों का पालन करके किया जाता है।
- एक रासायनिक हुड के तहत रोम युक्त ट्यूब में आरएनए निष्कर्षण किट के साथ प्रदान किए गए लाइसिस समाधान के 100 μL को जोड़कर पृथक रोम को निलंबित करें, और रोम की संरचना को तोड़ने के लिए उच्च गति (2,500 आरपीएम / मिनट) पर भंवर। ट्यूब में इथेनॉल (100%) के 50 μL जोड़ें, और संक्षेप में उच्च गति पर भंवर।
नोट: चूंकि लाइसिस बफर में 2-मर्कैप्टोएथेनॉल और थायोसायनिक एसिड होता है, इसलिए इस चरण को रासायनिक हुड के तहत सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। - ट्यूब की कुल मात्रा (लगभग 160 μL) को एक माइक्रोफिल्टर कारतूस असेंबली में स्थानांतरित करें जिसमें एक कॉलम और एक संग्रह ट्यूब शामिल है, और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,363 x g पर 10 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। किट के साथ प्रदान किए गए 180 μL वॉश सॉल्यूशन 1 के साथ कॉलम धोएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,363 x g पर 10 सेकंड के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें।
- 180 μL वॉश समाधान 2/3, किट के साथ प्रदान किया गया, कॉलम में जोड़ें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,363 x g पर 10 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। इस चरण को दो बार करें। फिल्टर को सूखने के लिए 1 मिनट के लिए ट्यूब को आखिरी बार सेंट्रीफ्यूज करें, और कारतूस के नीचे एक नई संग्रह ट्यूब रखें।
- दो चरणों में न्यूक्लिक एसिड के क्षालन का प्रदर्शन करें:
- सबसे पहले, फिल्टर में 8 μL गर्म क्षालन समाधान (75 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें, आरटी पर 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,363 x g पर 30 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
- इस चरण को 7 μL क्षालन समाधान के साथ दोहराएं।
नोट: ल्यूटेड न्यूक्लिक एसिड युक्त ट्यूब को बर्फ पर रखा जाना चाहिए। डीएनए संदूषण से बचने के लिए, डीएनए क्षरण का एक पूरक चरण अत्यधिक अनुशंसित है- चरण 3.5।
- ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 2 IU DNase और 1x DNase बफर के साथ इनक्यूबेट करें। आरटी पर 2 मिनट के लिए 1/10 DNase निष्क्रियता अभिकर्मक के साथ एंजाइमेटिक गतिविधि को अवरुद्ध करें।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,363 x g पर 1.5 मिनट के लिए ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। अंत में, आरएनए युक्त निलंबन एकत्र करें, और इसे एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (नैनोड्रॉप 2000 सॉफ्टवेयर > न्यूक्लिक एसिड > आरएनए) का उपयोग करके नमूने में मौजूद आरएनए की मात्रा का आकलन करें। एक रिक्त स्थान के रूप में क्षालन समाधान के 1 μL का उपयोग करें, और 1 μL घोल के साथ पृथक रोम से निकाले गए आरएनए मात्रा को मापें।
- आरएनए शुद्धता (लगभग 2.0) के लिए 260/280 अनुपात की जांच करें। नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, या आरटी-क्यूपीसीआर करने के लिए इसे सीधे रेट्रोट्रांसक्राइब करें।
नोट: आरएनए अखंडता का आकलन करने के लिए, नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर ठंड से पहले या बाद में उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्वचालित वैद्युतकणसंचलन प्रणाली के साथ संसाधित किया जा सकता है। इस काम में, रेट्रोट्रांसक्रिप्शन के बाद, आरटी-क्यूपीसीआर को निम्नलिखित चक्र के साथ किया गया था:
50 डिग्री सेल्सियस पर 20 सेकंड और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के साथ मंच पकड़ो
95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड और 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के साथ 40 पीसीआर चक्र
95 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड, 60 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड और 60 डिग्री सेल्सियस पर 15 सेकंड के साथ पिघला हुआ वक्र चरण
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Representative Results
इस अलगाव प्रक्रिया का उपयोग करके, प्रयोगकर्ता विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए स्ट्रोमल वातावरण से रोम को पुनः प्राप्त कर सकता है। रोम के आकार और आकृति विज्ञान के आधार पर, फॉलिकुलोजेनेसिस के विभिन्न चरणों को अलग करना संभव है। प्रयोगकर्ता एक अनुकूलित माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करके अपने आकार के अनुसार रुचि के रोम का चयन कर सकता है। अधिकतम 75 μm के माइक्रोकेशिका का उपयोग करके, द्वितीयक, सूक्ष्म और परिपक्व रोम से आदिम और प्राथमिक रोम को भेदभाव करना संभव है। इसके अलावा, प्रयोगकर्ता कूप आकृति विज्ञान के अनुसार कूप चरण की पुष्टि कर सकता है। कूप सक्रियण का अध्ययन करते समय, क्विसेंट और प्राथमिक रोम का चयन किया जाता है, और लगभग 5 एनजी / μL की आरएनए एकाग्रता तक पहुंचने के लिए लगभग 20 रोम की आवश्यकता होती है।
एक ही रोगी से दो होमोजिनाइज्ड डिम्बग्रंथि के टुकड़े (4 मिमी x 2 मिमी x 1 मिमी) को इस प्रोटोकॉल (चित्रा 2) का उपयोग करके रोम को अलग करने के लिए संसाधित किया गया था। 1.5 घंटे की अलगाव प्रक्रिया के बाद, आरएनए मात्रा की तुलना करने और कूप चयन की प्रासंगिकता को उजागर करने के लिए विकास के चरणों के अनुसार रोम की दो आबादी को पुनः प्राप्त किया गया: <75 μm (ट्यूब 1) के 20 रोम और <200 μm (ट्यूब 2) के 15 रोम। फिर, आरएनए निष्कर्षण किया गया था, और ट्यूब 1 से 4.8 एनजी / μL कुल आरएनए और ट्यूब 2 से 10.5 एनजी / μL कुल आरएनए परिमाणीकरण के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके प्राप्त किया गया था (तालिका 1)। इस माइक्रोवॉल्यूम स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्रणाली का उपयोग करके, आरएनए शुद्धता का आकलन करने के लिए 260/280 अनुपात को भी मापा गया था। यह अनुपात निष्कर्षण के दौरान प्रोटीन या अन्य अभिकर्मकों द्वारा संभावित संदूषण को दर्शाता है और आरएनए नमूनों के लिए 2.0 के करीब होना चाहिए। नमूने की शुद्धता को मान्य करते हुए ट्यूब 1 और ट्यूब 2 में 260/280 अनुपात क्रमशः 1.89 और 1.74 थे (तालिका 1)। आरएनए गुणवत्ता को तब उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्वचालित वैद्युतकणसंचलन के साथ नमूनों को संसाधित करके सत्यापित किया गया था। इस प्रक्रिया के बाद, आरएनए अखंडता संख्या (आरआईएन) का अनुमान लगाया गया था। 1 (अवक्रमित) से 10 (बरकरार) तक आरआईएन मान, एक नमूने में आरएनए के क्षरण के स्तर को दर्शाता है। हमारे नमूनों से आरएनए की गुणवत्ता को मान्य करते हुए, ट्यूब 1 और ट्यूब 2 में आरआईएन मान क्रमशः 7.1 और 7.9 थे। आरटी-क्यूपीसीआर करने के लिए, निकाले गए आरएनए की कुल मात्रा को पहले सीडीएनए में रेट्रोट्रांसक्रिप्ट किया गया था। फिर, 96-वेल प्लेट पर प्रति कुएं 1.25 एनजी सीडीएनए जोड़ा गया, जिसमें हाउसकीपिंग और लक्ष्य जीन (हाइपोक्सैन्थिन-गुआनिन फॉस्फोराइबोसिलट्रांसफेरेज़ [एचपीआरटी], किट लिगैंड [केएल], और ग्रोथ भेदभाव फैक्टर 9 [जीडीएफ 9]) और एसवाईबीआर ग्रीन मास्टर मिक्स17,18 के लिए प्राइमर थे। वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली पर एक मानक चक्र चलाने के बाद, प्राप्त चक्र थ्रेसहोल्ड (सीटी) एचपीआरटी के लिए 30.87 (ट्यूब 1) और 29.56 (ट्यूब 2), केएल के लिए 33.5 (ट्यूब 1) और 31.77 (ट्यूब 2) और जीडीएफ 9 के लिए 30.71 (ट्यूब 1) और 30.57 (ट्यूब 2) थे (तालिका 1)।
चित्रा 1: पृथक मानव डिम्बग्रंथि के रोम से आरएनए निष्कर्षण का आकलन करने के लिए विधि का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। इस पांडुलिपि में तीन चरणों का वर्णन किया गया है: ऊतक पिघलना, अलगाव प्रक्रिया, जिसमें यांत्रिक और एंजाइमेटिक प्रसंस्करण शामिल है, और रोम से आरएनए निष्कर्षण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: अलगाव प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एकत्र किए गए रोम। (ए) पिघला हुआ कॉर्टिकल ऊतक। (बी) ऊतक स्लाइसर और (सी) ऊतक चॉपर का उपयोग ऊतक को टुकड़े करने के लिए किया जाता है। (D-E) पुनः प्राप्त पृथक रोम की छवियों को 10x आईपीस और एक विस्तृत ज़ूम रेंज (1x-6.3x) के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ देखा गया; आदिम और प्राथमिक रोम की पहचान के लिए 50x-63x की आवर्धन सेटिंग्स का उपयोग किया गया था। स्केलबार: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| नली | रोम की संख्या | रोम का आकार (μm) | आरएनए एकाग्रता (एनजी / | 260/280 अनुपात | आरएनए अखंडता संख्या (RIN) | HPRT सीटी | केरल सीटी | GDF9 सीटी | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
तालिका 1: दो समरूप डिम्बग्रंथि के टुकड़ों की शुद्धता, आरआईएन और चक्र सीमा।
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Discussion
डिम्बग्रंथि के ऊतकों का क्रायोप्रिजर्वेशन कैंसर रोगियों की प्रजनन क्षमता को संरक्षित करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है। क्लिनिक में, पिघले हुए कॉर्टिकल ऊतक को छूट के बाद रोगी में वापस ग्राफ्ट किया जाता है, जिससे डिम्बग्रंथि समारोह और प्रजनन क्षमता19,20 को फिर से शुरू करने की अनुमति मिलती है। नैदानिक उपयोग के अलावा, अवशिष्ट डिम्बग्रंथि के टुकड़े भी फॉलिकुलोजेनेसिस को विनियमित करने वाले तंत्र का अध्ययन करने के लिए भंडारण अवधि के अंत में अनुसंधान के लिए दान किए जा सकते हैं। इसके अलावा, यह ऊतक ग्राफ्टिंग के विकल्प विकसित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है जब यह संभव नहीं है, जैसे कि इन विट्रो कल्चर सिस्टम या कृत्रिम अंडाशय। हालांकि, रोगियों के भीतर और बीच दोनों भिन्नताएं प्रयोगों की व्यवहार्यता और प्रजनन क्षमता और परिणामों की व्याख्या को सीमित करती हैं। दरअसल, कूपिक घनत्व नाटकीय रूप से उम्र के साथ कम हो जाता है, और रोम को टुकड़ों के बीच समान रूप से वितरित नहीं किया जाताहै। चूंकि उपलब्ध टुकड़ों की संख्या सीमित है, इसलिए मानव ऊतक को अत्याधुनिक तकनीकों के साथ उपयोग करने की आवश्यकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस जैसी तकनीकों की एक विस्तृत श्रृंखला, साथ ही सीटू संकरण में, प्रोटीन और जीन स्थानीयकरणका आकलन करने के लिए निश्चित ऊतक पर प्रदर्शन किया जा सकता है। विकास के विभिन्न चरणों में अंडाशय की कार्यात्मक इकाइयों के भीतर फॉलिकुलोजेनेसिस को विनियमित करने वाले आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए, रोम के अलगाव की आवश्यकता होती है।
कई अध्ययनों ने मानव और पशु प्रजातियों में आसपास के ऊतक से रोम को अलग करने के प्रभावी तरीकों का पता लगायाहै। प्राप्त रोम की संख्या और निष्कर्षण के बाद आरएनए की गुणवत्ता उपयोग की जाने वाली तकनीकों के अनुसार भिन्न हो सकती है। कूप सक्रियण (यानी, आदिम और प्राथमिक रोम) का अध्ययन करने के लिए, मानक आरटी-क्यूपीसीआर करने के लिए कम से कम 20 पूल किए गए रोम की आवश्यकता होती है। आरएनए या सीडीएनए प्रवर्धन या नेस्टेड पीसीआर जैसे वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करके, कम रोम23,24 के साथ काम करना संभव है।
डिम्बग्रंथि प्रांतस्था की घनी प्रकृति कूप अलगाव को चुनौतीपूर्ण बनाती है, जिसके कारण एंजाइमेटिक और यांत्रिक अलगाव25 के संयोजन से जुड़े तरीकों का उपयोग किया गया है। विभिन्न प्रकार के एंजाइमों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि कोलेजनेस और डीनेस26। हालांकि, अध्ययनों ने एंजाइमेटिक पाचन के बाद कूप क्षति की सूचना दी है, जो आगे इन विट्रो विकास27,28 को प्रभावित करता है। कूप अखंडता को बनाए रखने के लिए, कई टीमें वर्तमान में अनुकूलित एंजाइमेटिक पाचन प्रोटोकॉल का उपयोग कर रही हैं या बाद में कूपिक संस्कृति 25,29,30,31 के लिए केवल यांत्रिक अलगाव कर रही हैं। यह पांडुलिपि मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण के लिए पृथक रोम प्राप्त करने के लिए एक सरल और कुशल विधि की रिपोर्ट करती है। फिर भी, सभी प्रयोगों को इष्टतम परिणामों तक पहुंचने से पहले सीखने की अवस्था की आवश्यकता होती है।
मौलिक अनुसंधान उद्देश्यों के लिए,उनकी अखंडता को प्रभावित किए बिना बड़ी मात्रा में रोम को पुनः प्राप्त करने के लिए पिछले प्रोटोकॉल का एक संशोधन विकसित किया गया था। आरएनए गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण सीधे अलगाव के बाद किया जाता है। विकृत रोम के चयन के जोखिम को सीमित करने के लिए लंबे समय तक पाचन से बचना भी महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में पाचन चरण महत्वपूर्ण रहता है। तीन बिंदुओं पर विशिष्ट ध्यान देने की आवश्यकता होती है: (1) सजातीय एंजाइम कार्रवाई प्रदान करने के लिए हर 10 मिनट में एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया के दौरान ऊतक की निस्तब्धता; (2) प्रक्रिया के दौरान स्वस्थ रोम का चयन करके कूप अखंडता का नियंत्रण और क्षति देखते ही अवरुद्ध समाधान के साथ प्रतिक्रिया को रोकना; (3) कोलेजनेस एकाग्रता का अनुकूलन, क्योंकि ऊतक कठोरता उम्र के अनुसार रोगियों के बीच भिन्न हो सकती है। क्षति को रोकने के लिए कुछ मामलों में कोलेजनेस की एकाग्रता (0.12% तक) कम हो सकती है (यानी, प्रीपुबर्टल रोगियों में)32।
इस प्रोटोकॉल के अंतिम भाग में, पृथक रोम से आरएनए निष्कर्षण अनुकूलित निर्देशों का पालन करते हुए किया गया था। यह आरटी-क्यूपीसीआर या आरएनए अनुक्रमण जैसे प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला की अनुमति देता है, जो अंडाणु और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के लिए विशिष्ट विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं पर मौलिक जानकारी प्रदान करता है। ऊतक से आरएनए निकालने के लिए कई प्रोटोकॉल और किट उपलब्ध हैं। हमने यहां हमारी प्रयोगशाला में उपयोग की जाने वाली एक कुशल तकनीक की सूचना दी है जो आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए पर्याप्त मात्रा में आरएनए के निष्कर्षण की अनुमति देती है। जबकि आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए कूप अलगाव के बाद प्रत्यक्ष आरएनए निष्कर्षण की अत्यधिक सिफारिश की जाती है, यदि निष्कर्षण उसी दिन नहीं किया जा सकता है तो -80 डिग्री सेल्सियस पर पृथक रोम को फ्रीज करना भी संभव है। आरएनए की मात्रा रोम के आकार के अनुसार भिन्न हो सकती है, और बढ़ते रोम विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकते हैं यदि क्विसेंट रोम के साथ पूल किया जाता है। आकार के आधार पर चयन बेहद प्रासंगिक है, अध्ययन के उद्देश्यों के आधार पर, विशेष रूप से फॉलिकुलोजेनेसिस के पहले चरण के लिए। हालांकि, केवल आकार के आधार पर आदिम और प्राथमिक रोम के बीच भेदभाव आदिम कूप जीन अभिव्यक्ति स्तरों का ठीक से आकलन करने के मामले में चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। आदिम और प्राथमिक रोम का चयन उनकी आकृति विज्ञान के आधार पर किया जा सकता है, लेकिन 63x के आवर्धन पर स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के साथ उनके बीच भेदभाव मुश्किल है।
अंत में, प्रयोगकर्ता को कूप अलगाव की चुनौतियों के बारे में पता होना चाहिए और परिणामों का विश्लेषण करते समय उन्हें ध्यान में रखना चाहिए। महत्वपूर्ण मापदंडों पर विचार किया जाना चाहिए, जैसे कि (1) रोगियों के बीच कूप घनत्व में अंतर / अंतर-भिन्नताएं; (2) कूप अलगाव के दौरान कूप अखंडता; (3) विभिन्न रोम चरणों के बीच भेदभाव; और (4) आरएनए स्थिरता और अखंडता।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को विज्ञान की उत्कृष्टता (ईओएस) अनुदान (आईडी: 30443682) द्वारा समर्थित किया गया था। आईडी फोंड्स नेशनल डे ला रेचरचे साइंटिफिक डी बेल्जिक (एफएनआरएस) में एक सहयोगी शोधकर्ता हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
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