Summary
Qui, descriviamo un protocollo che delinea come isolare i follicoli ovarici umani dal tessuto corticale congelato-scongelato per eseguire analisi di espressione genica.
Abstract
L'ovaio è un organo eterogeneo composto da diversi tipi di cellule. Per studiare i meccanismi molecolari che si verificano durante la follicologenesi, la localizzazione delle proteine e l'espressione genica possono essere eseguite su tessuto fisso. Tuttavia, per valutare correttamente i livelli di espressione genica in un follicolo umano, questa struttura complessa e delicata deve essere isolata. Quindi, un protocollo adattato precedentemente descritto dal laboratorio di Woodruff è stato sviluppato per separare i follicoli (l'ovocita e le cellule della granulosa) dal loro ambiente circostante. Il tessuto corticale ovarico viene prima lavorato manualmente per ottenere piccoli frammenti utilizzando due strumenti: un'affettatrice di tessuto e un tritatutto. Il tessuto viene quindi digerito enzimaticamente con lo 0,2% di collagenasi e lo 0,02% di DNasi per almeno 40 minuti. Questa fase di digestione viene eseguita a 37 °C e al 5% di CO2 ed è accompagnata da pipettaggio meccanico del mezzo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione, i follicoli isolati vengono raccolti manualmente utilizzando una pipetta microcapillare calibrata al microscopio. Se i follicoli sono ancora presenti nei pezzi di tessuto, la procedura viene completata con la microdissezione manuale. I follicoli vengono raccolti su ghiaccio in un terreno di coltura e vengono risciacquati due volte in goccioline di soluzione salina tamponata con fosfato. Questa procedura di digestione deve essere attentamente controllata per evitare il deterioramento del follicolo. Non appena la struttura dei follicoli appare compromessa o dopo un massimo di 90 minuti, la reazione viene interrotta con una soluzione bloccante a 4 °C contenente siero bovino fetale al 10%. Un minimo di 20 follicoli isolati (di dimensioni inferiori a 75 μm) devono essere raccolti per ottenere una quantità adeguata di RNA totale dopo l'estrazione dell'RNA per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Dopo l'estrazione, la quantificazione dell'RNA totale da 20 follicoli raggiunge un valore medio di 5 ng/μL. L'RNA totale viene quindi retrotrascritto in cDNA e i geni di interesse vengono ulteriormente analizzati utilizzando RT-qPCR.
Introduction
L'ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all'interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca1. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne2. Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l'espressione proteica e la localizzazione genica all'interno delle unità funzionali dell'ovaio 3,4. Tuttavia, sono necessarie tecniche specifiche per dissociare i follicoli dalla corteccia circostante per valutare con precisione i livelli di espressione genica all'interno dei follicoli ovarici. Quindi, in uno studio precedente, è stata sviluppata una tecnica di isolamento del follicolo per consentire analisi dell'espressione genica direttamente dall'unità funzionale dell'ovaio5. Sono stati sviluppati diversi approcci, come la digestione enzimatica e/o l'isolamento meccanico, così come la microdissezione a cattura laser, che consente l'isolamento del follicolo all'interno di un pezzo di tessuto 6,7,8,9. L'isolamento del follicolo è ampiamente utilizzato, sia con tessuto ovarico umano che animale, per valutare i profili di espressione genica dei follicoli in tutte le fasi dello sviluppo10,11,12. Tuttavia, una procedura di isolamento ottimale dovrebbe tenere conto della fragile struttura del follicolo all'interno della corteccia densa e, pertanto, dovrebbe essere eseguita con cura per evitare danni7. Questo manoscritto descrive una procedura, adattata da un protocollo descritto dal laboratorio di Woodruff, per isolare i follicoli umani dalla corteccia ovarica congelata e scongelata al fine di eseguire analisi di espressione genica13.
Il primo passo dell'isolamento del follicolo ovarico dal tessuto umano congelato è la procedura di scongelamento. Questo processo viene eseguito sulla base del protocollo clinico utilizzato per l'innesto di tessuto ovarico crioconservato, come precedentemente descritto14,15. Il processo mira a rimuovere gli agenti crioprotettori risciacquando la corteccia ovarica in concentrazioni decrescenti del mezzo. Quindi, il tessuto viene frammentato prima dell'isolamento enzimatico e meccanico per recuperare i follicoli. I follicoli in diversi stadi possono essere distinti utilizzando uno stereomicroscopio ad alto ingrandimento e ottica di buona qualità per isolare quelli di interesse. Ogni follicolo isolato viene misurato utilizzando un righello integrato nel microscopio e i follicoli possono essere raggruppati in base al loro stadio di sviluppo: follicoli primordiali (30 μm), follicoli primari (60 μm), follicoli secondari (120-200 μm) e follicoli antrali (>200 μm)16. Un'ulteriore classificazione può essere eseguita in base alla morfologia dei follicoli: i follicoli primordiali hanno uno strato di cellule granulari appiattite (GC), i follicoli primari hanno uno strato di GC cuboidali, i follicoli secondari hanno almeno due strati di GC cuboidali e la presenza di una cavità tra i GC caratterizza lo stadio antrale. Quando vengono selezionati i follicoli di interesse, viene eseguita l'estrazione dell'RNA. La quantità e la qualità dell'RNA vengono valutate prima della reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) (Figura 1).
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Protocol
Questo progetto è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Erasme (Bruxelles, Belgio). La paziente inclusa in questo protocollo è stata sottoposta a crioconservazione del tessuto ovarico (OTC) per la conservazione della fertilità prima dell'esposizione alla chemioterapia nel 2000. La paziente ha firmato il consenso scritto informato a donare il suo tessuto congelato residuo alla ricerca alla fine del periodo di conservazione.
1. Scongelamento del tessuto ovarico crioconservato
- Preparare una piastra a 6 pozzetti contenente cinque soluzioni di scongelamento. Il primo pozzetto contiene 5 ml di soluzione crioprotettiva composta da terreno Leibovitz-15, 0,1 mol/L di saccarosio, 1,5 mol/L di dimetil solfossido (DMSO) e 1% di albumina sierica umana (HSA). I pozzetti successivi contengono 5 ml di terreno Leibovitz-15 con concentrazioni decrescenti di crioprotettore: 1 mol/L, 0,5 mol/L e 2 x 0 mol/L DMSO.
NOTA: La soluzione crioprotettiva può differire in base al protocollo utilizzato nella clinica della fertilità. - Rimuovere un flaconcino contenente un frammento corticale ovarico dall'azoto liquido nel rispetto delle norme di sicurezza (guanti criogenici, occhiali protettivi e scarpe chiuse) e mantenere il tubo a temperatura ambiente (RT) per 30 s.
- Immergere il flaconcino in acqua bidistillata per 2 minuti a RT agitando delicatamente prima di aprire il flaconcino sotto un cappuccio verticale e trasferirlo direttamente nel primo pozzetto della piastra a 6 pozzetti (su ghiaccio).
- Trasferire il frammento successivamente in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti, ciascuno contenente concentrazioni decrescenti di crioprotettore in 5 ml di terreno Leibovitz-15. Agitare delicatamente il tessuto in ogni mezzo per 5 minuti (su ghiaccio).
2. Isolamento del follicolo
NOTA: Tutti gli esperimenti sono condotti utilizzando materiali privi di RNasi e sotto un cappuccio verticale.
- Trasferire il tessuto scongelato in una piastra di Petri grigliata di 2 mm riempita con 10 ml di mezzo di dissezione (terreno Leibovitz-15, piruvato di sodio [2 mmol / L], L-glutammina [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicillina G [30 μg / ml] e streptomicina [50 μg / ml]). Regolare le dimensioni del tessuto con un bisturi, se necessario.
NOTA: A seconda del protocollo clinico, la dimensione del tessuto congelato può variare da 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Per questo protocollo, sono state utilizzate due strisce di 4 mm x 2 mm x 1 mm. - Impilare i tre pezzi dell'affettatrice di tessuto, mettere il frammento tra i due blocchi e tagliare il frammento a metà usando una lama, facendo scorrere tra i blocchi per ottenere due frammenti di 0,5 mm di spessore.
- Utilizzare il trinciatutto per tagliare il frammento e ottenere pezzi più piccoli. Se necessario, tagliare manualmente i pezzi rimanenti con un bisturi fino a quando il tessuto non è completamente frantumato.
- Trasferire il tessuto frammentato in una piastra di Petri a griglia riempita con 7 ml di terreno di digestione (terreno di coltura [terreno di coltura McCoy's 5A, 3 mmol / L glutammina, 0,1% HSA, 30 μg / mL penicillina G, 50 μg / mL streptomicina, 2,5 μg / mL transferrina, 4 ng / mL selenio e 50 μg / mL di acido ascorbico] integrati con 0,2% collagenasi e 0,02% DNasi).
- Mettere il piatto nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C. Ogni 10 minuti, estrarre la capsula di Petri dall'incubatrice e lavare il tessuto pipettando su e giù con una pipetta da 1 ml.
- Dopo 45 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, posizionare il piatto sotto uno stereomicroscopio con un intervallo di ingrandimento di 5x-6,3x e recuperare i follicoli utilizzando una pipetta microcapillare. Selezionare i follicoli di interesse e isolarli aspirandoli con una pipetta orale.
NOTA: il pipettaggio della bocca deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita di materiale nel tubo e la contaminazione. - Se i follicoli rimangono bloccati in un pezzo di corteccia, isolarli meccanicamente con due siringhe da 27 G strappando la corteccia con la punta delle siringhe per rilasciare i follicoli dallo stroma.
NOTA: Non toccare i follicoli con le siringhe per evitare di danneggiarli. - Trasferire i follicoli con il microcapillare in una piastra a 4 pozzetti contenente gocce di 15 μL del terreno di coltura calibrato coperto da 500 μL di coltura oleosa (da 1 a 10 follicoli per goccia). Questa fase mantiene la vitalità del follicolo durante il processo di raccolta. Alla fine della procedura, sciacquare i follicoli due volte per 5 s ogni volta in due gocce di 15 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) coperta da 500 μL di coltura oleosa (su ghiaccio).
- Raccogliere 20 follicoli con una quantità minima di PBS utilizzando la pipetta orale (massimo 10 μL) in un tubo vuoto e mantenere il tubo sul ghiaccio.
NOTA: Per la stabilità dell'RNA, è fondamentale eseguire il passo 2.8 e il passo 2.9 sul ghiaccio. Sono necessari circa 20 follicoli (<75 μm) per avere abbastanza RNA per RT-qPCR standard (SYBR Green). - Dopo un massimo di 90 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo nella capsula di Petri un eccesso di soluzione bloccante fredda (4 °C) (7,5 ml) composta da terreno di coltura integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%.
NOTA: La soluzione bloccante può essere aggiunta non appena lo sperimentatore osserva follicoli attaccati alla piastra o follicoli danneggiati (forma asimmetrica o follicoli di colore più scuro). Si consiglia di eseguire l'isolamento del follicolo entro un periodo massimo di 2,5 ore per evitare danni follicolari e di eseguire l'estrazione dell'RNA immediatamente dopo l'isolamento.
3. Estrazione dell'RNA
NOTA: L'estrazione dell'RNA viene eseguita seguendo le istruzioni fornite con un kit di estrazione dell'RNA adattando i volumi di eluizione.
- Sospendere i follicoli isolati aggiungendo 100 μL della soluzione di lisi fornita con il kit di estrazione dell'RNA al tubo contenente i follicoli sotto un cappuccio chimico e vortice ad alta velocità (2.500 giri / min) per rompere la struttura dei follicoli. Aggiungere 50 μL di etanolo (100%) al tubo e brevemente vortice ad alta velocità.
NOTA: Poiché il tampone di lisi contiene 2-mercaptoetanolo e acido tiocianico, questo passaggio deve essere eseguito con cautela sotto una cappa chimica. - Trasferire il volume totale del tubo (circa 160 μL) in un gruppo di cartucce di microfiltro comprendente una colonna e un tubo di raccolta e centrifugarlo per 10 s a 16.363 x g a 4 °C. Lavare la colonna con 180 μL di soluzione di lavaggio 1, fornita con il kit, e centrifugare il tubo per 10 s a 16.363 x g a 4 °C.
- Aggiungere 180 μL di soluzione di lavaggio 2/3, fornita con il kit, alla colonna e centrifugare per 10 s a 16.363 x g a 4 °C. Eseguire questo passaggio due volte. Centrifugare il tubo un'ultima volta per 1 minuto per asciugare il filtro e posizionare un nuovo tubo di raccolta sotto la cartuccia.
- Eseguire l'eluizione degli acidi nucleici in due fasi:
- In primo luogo, aggiungere 8 μL di soluzione di eluizione calda (75 °C) al filtro, attendere 1 minuto a RT e centrifugare per 30 s a 16,363 x g a 4 °C.
- Ripetere questo passaggio con 7 μL di soluzione di eluizione.
NOTA: Il tubo contenente gli acidi nucleici eluiti deve essere tenuto su ghiaccio. Per evitare la contaminazione del DNA, una fase supplementare di degradazione del DNA è altamente raccomandata: passo 3.5.
- Incubare la provetta con 2 UI DNasi e 1x tampone DNasi per 20 minuti a 37 °C. Bloccare l'attività enzimatica con il reagente di inattivazione della DNasi 1/10 per 2 minuti a RT.
- Centrifugare il tubo per 1,5 minuti a 16,363 x g a 4 °C. Infine, raccogliere la sospensione contenente l'RNA e trasferirla in un nuovo tubo.
- Valutare la quantità di RNA presente nel campione utilizzando uno spettrofotometro (software NanoDrop 2000 > Nucleic Acid > RNA). Utilizzare 1 μL di soluzione di eluizione come bianco e misurare la quantità di RNA estratta dai follicoli isolati con 1 μL di soluzione.
- Controllare il rapporto 260/280 per la purezza dell'RNA (circa 2,0). Conservare il campione a -80 °C o retrotrascriverlo direttamente per eseguire RT-qPCR.
NOTA: Per valutare l'integrità dell'RNA, il campione può essere elaborato con un sistema di elettroforesi automatizzato ad alta risoluzione prima o dopo il congelamento a -80 °C. In questo lavoro, dopo la retrotrascrizione, RT-qPCR è stato eseguito con il seguente ciclo:
Tenere il palco con 20 s a 50 °C e 10 min a 95 °C
40 cicli di PCR con 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C
Stadio della curva di fusione con 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C e 15 s a 60 °C
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Representative Results
Utilizzando questa procedura di isolamento, lo sperimentatore può recuperare i follicoli dall'ambiente stromale per eseguire specifiche analisi di espressione genica. In base alle dimensioni e alla morfologia dei follicoli, è possibile differenziare i diversi stadi della follicologenesi. Lo sperimentatore può selezionare i follicoli di interesse in base alle loro dimensioni utilizzando una pipetta microcapillare adattata. Utilizzando un microcapillare di massimo 75 μm, è possibile discriminare i follicoli primordiali e primari dai follicoli secondari, antrali e maturi. Inoltre, lo sperimentatore può confermare lo stadio del follicolo in base alla morfologia del follicolo. Quando si studia l'attivazione dei follicoli, vengono selezionati i follicoli quiescenti e primari e sono necessari approssimativamente 20 follicoli per raggiungere una concentrazione di RNA di circa 5 ng / μL.
Due frammenti ovarici omogeneizzati (4 mm x 2 mm x 1 mm) della stessa paziente sono stati elaborati per isolare i follicoli utilizzando questo protocollo (Figura 2). Dopo una procedura di isolamento di 1,5 ore, due popolazioni di follicoli sono state recuperate in base agli stadi di sviluppo per confrontare la quantità di RNA e per evidenziare la rilevanza della selezione dei follicoli: 20 follicoli di <75 μm (tubo 1) e 15 follicoli di <200 μm (tubo 2). Quindi, è stata eseguita l'estrazione dell'RNA e sono stati ottenuti 4,8 ng / μL di RNA totale dal tubo 1 e 10,5 ng / μL di RNA totale dal tubo 2 utilizzando uno spettrofotometro per la quantificazione (Tabella 1). Utilizzando questo sistema di spettrofotometro a microvolumi, è stato misurato anche il rapporto 260/280 per valutare la purezza dell'RNA. Questo rapporto riflette la potenziale contaminazione da proteine o altri reagenti durante l'estrazione e deve essere vicino a 2,0 per i campioni di RNA. I rapporti 260/280 erano 1,89 e 1,74 rispettivamente nel tubo 1 e nel tubo 2, convalidando la purezza dei campioni (Tabella 1). La qualità dell'RNA è stata quindi verificata elaborando i campioni con elettroforesi automatizzata ad alta risoluzione. A seguito di questa procedura, è stato stimato il numero di integrità dell'RNA (RIN). Il valore RIN, da 1 (degradato) a 10 (intatto), riflette il livello di degradazione dell'RNA in un campione. I valori RIN erano 7,1 e 7,9 rispettivamente nella provetta 1 e nella provetta 2, convalidando la qualità dell'RNA dai nostri campioni (Tabella 1). Per eseguire una RT-qPCR, il volume totale di RNA estratto è stato prima retrotrascritto in cDNA. Quindi, 1,25 ng di cDNA sono stati aggiunti per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti, con primer per la pulizia e geni bersaglio (Hypoxanthine-guanina fosforibosiltransferasi [HPRT], Kit Ligand [KL] e Growth Differentiation Factor 9 [GDF9]) e SYBR Green master mix17,18. Dopo aver eseguito un ciclo standard su un sistema real-time PCR, le soglie di ciclo (Ct) ottenute sono state 30,87 (tubo 1) e 29,56 (tubo 2) per HPRT, 33,5 (tubo 1) e 31,77 (tubo 2) per KL, e 30,71 (tubo 1) e 30,57 (tubo 2) per GDF9 (Tabella 1).
Figura 1: Rappresentazione schematica del metodo per valutare l'estrazione di RNA da follicoli ovarici umani isolati. In questo manoscritto sono descritte tre fasi: lo scongelamento dei tessuti, la procedura di isolamento, compresa l'elaborazione meccanica ed enzimatica, e l'estrazione dell'RNA dai follicoli. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Follicoli raccolti seguendo il protocollo di isolamento. (A) Tessuto corticale scongelato. (B) L'affettatrice di tessuti e (C) il tritatutto utilizzato per frammentare il tessuto. (D-E) Immagini di follicoli isolati recuperati osservati con uno stereomicroscopio con un oculare 10x e un'ampia gamma di zoom (1x-6,3x); Le impostazioni di ingrandimento di 50x-63x sono state utilizzate per l'identificazione dei follicoli primordiali e primari. Scalebar: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Tubo | Numero di follicoli | Dimensione dei follicoli (μm) | Concentrazione di RNA (ng/μL) | Rapporto 260/280 | RNA Integrity Number (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabella 1: Soglie di purezza, RIN e ciclo di due frammenti ovarici omogeneizzati.
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Discussion
La crioconservazione del tessuto ovarico è un approccio promettente per preservare la fertilità delle pazienti oncologiche. In clinica, il tessuto corticale scongelato viene innestato nuovamente nella paziente dopo la remissione, consentendo la ripresa della funzione ovarica e della fertilità19,20. Oltre all'uso clinico, frammenti ovarici residui possono anche essere donati per la ricerca alla fine del periodo di conservazione per studiare i meccanismi che regolano la follicologenesi. Inoltre, questo tessuto è particolarmente utile per sviluppare alternative all'innesto quando non è fattibile, come sistemi di coltura in vitro o ovaie artificiali. Tuttavia, le variazioni sia all'interno che tra i pazienti limitano la fattibilità e la riproducibilità degli esperimenti e l'interpretazione dei risultati. In effetti, la densità follicolare diminuisce drasticamente con l'età e i follicoli non sono equamente distribuiti tra i frammenti21. Poiché il numero di frammenti disponibili è limitato, il tessuto umano deve essere utilizzato con tecniche all'avanguardia. Una vasta gamma di tecniche come l'immunoistochimica e l'immunofluorescenza, così come l'ibridazione in situ, possono essere eseguite su tessuto fisso per valutare la localizzazione di proteine e geni 3,18. Per studiare i meccanismi molecolari che regolano la follicologenesi all'interno delle unità funzionali dell'ovaio nelle diverse fasi di sviluppo, è necessario l'isolamento dei follicoli.
Diversi studi hanno esplorato metodi efficaci per separare i follicoli dal tessuto circostante nelle specie umane e animali22. Il numero di follicoli recuperati e la qualità dell'RNA dopo l'estrazione possono variare a seconda delle tecniche utilizzate. Per studiare l'attivazione dei follicoli (cioè follicoli primordiali e primari), sono necessari almeno 20 follicoli aggregati per eseguire la RT-qPCR standard. Utilizzando metodi alternativi come l'amplificazione dell'RNA o del cDNA o la PCR nidificata, è possibile lavorare con un minor numero di follicoli23,24.
La natura densa della corteccia ovarica rende difficile l'isolamento del follicolo, che ha portato all'uso di metodi che comportano una combinazione di isolamento enzimatico e meccanico25. Possono essere utilizzati diversi tipi di enzimi, come la collagenasi e la DNasi26. Tuttavia, gli studi hanno riportato danni al follicolo a seguito della digestione enzimatica, con un ulteriore impatto sullo sviluppo in vitro 27,28. Per mantenere l'integrità del follicolo, diverse équipe stanno attualmente utilizzando protocolli di digestione enzimatica adattati o eseguendo solo l'isolamento meccanico per la successiva coltura follicolare 25,29,30,31. Questo manoscritto riporta un metodo semplice ed efficiente per ottenere follicoli isolati per l'analisi PCR quantitativa. Tuttavia, tutti gli esperimenti richiedono una curva di apprendimento prima di raggiungere risultati ottimali.
Per scopi di ricerca fondamentale, è stata sviluppata una revisione di un protocollo precedente per recuperare una grande quantità di follicoli senza comprometterne l'integrità13. L'elaborazione per l'analisi dell'espressione genica viene eseguita direttamente dopo l'isolamento per ottimizzare la qualità dell'RNA. È inoltre fondamentale evitare una digestione prolungata per limitare il rischio di selezionare follicoli degenerati. Pertanto, la fase di digestione rimane cruciale in questo protocollo. Tre punti richiedono un'attenzione specifica: (1) il lavaggio del tessuto durante la reazione enzimatica ogni 10 minuti per fornire un'azione enzimatica omogenea; (2) il controllo dell'integrità del follicolo selezionando follicoli sani durante la procedura e interrompendo la reazione con soluzione bloccante non appena si osserva un danno; (3) l'adattamento della concentrazione di collagenasi, poiché la rigidità tissutale può variare tra i pazienti in base all'età. La concentrazione di collagenasi può essere ridotta (allo 0,12%) in alcuni casi per prevenire danni (cioè nei pazienti in età prepuberale)32.
Nell'ultima parte di questo protocollo, l'estrazione dell'RNA da follicoli isolati è stata eseguita seguendo istruzioni adattate. Ciò consente una vasta gamma di esperimenti, come RT-qPCR o sequenziamento dell'RNA, fornendo informazioni fondamentali su vari processi cellulari specifici per le cellule di ovociti e granulosa. Sono disponibili numerosi protocolli e kit per estrarre l'RNA dai tessuti. Abbiamo riportato qui una tecnica efficiente utilizzata nel nostro laboratorio che consente l'estrazione di una quantità sufficiente di RNA per eseguire analisi di espressione genica mediante RT-qPCR. Mentre l'estrazione diretta dell'RNA è altamente raccomandata dopo l'isolamento del follicolo per mantenere l'integrità dell'RNA, è anche possibile congelare i follicoli isolati a -80 °C se l'estrazione non può essere eseguita lo stesso giorno. La quantità di RNA può variare in base alle dimensioni dei follicoli e i follicoli in crescita possono interferire con l'analisi se raggruppati con i follicoli quiescenti. La selezione in base alle dimensioni è estremamente rilevante, a seconda degli obiettivi dello studio, in particolare per la prima fase della follicologenesi. Tuttavia, la differenziazione tra follicoli primordiali e primari basata solo sulle dimensioni rimane difficile in termini di corretta valutazione dei livelli di espressione genica del follicolo primordiale. La selezione dei follicoli primordiali e primari può essere eseguita in base alla loro morfologia, ma la discriminazione tra loro con uno stereomicroscopio con un ingrandimento di 63x è difficile.
In conclusione, lo sperimentatore deve essere consapevole delle sfide dell'isolamento del follicolo e tenerne conto quando analizza i risultati. Devono essere considerati parametri importanti, come (1) intra/inter-variazioni nella densità del follicolo tra i pazienti; (2) integrità del follicolo durante l'isolamento del follicolo; (3) differenziazione tra i diversi stadi dei follicoli; e (4) stabilità e integrità dell'RNA.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. è ricercatore associato presso il Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
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