Summary
Aqui, descrevemos um protocolo que descreve como isolar folículos ovarianos humanos de tecido cortical congelado e descongelado para realizar análises de expressão gênica.
Abstract
O ovário é um órgão heterogêneo composto por diferentes tipos celulares. Para estudar os mecanismos moleculares que ocorrem durante a foliculogênese, a localização de proteínas e a expressão gênica podem ser realizadas no tecido fixo. No entanto, para avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica em um folículo humano, essa estrutura complexa e delicada deve ser isolada. Assim, um protocolo adaptado descrito anteriormente pelo laboratório de Woodruff foi desenvolvido para separar os folículos (o ovócito e as células da granulosa) de seu ambiente circundante. O tecido cortical ovariano é primeiramente processado manualmente para obter pequenos fragmentos usando duas ferramentas: um fatiador de tecido e um picador de tecido. O tecido é então digerido enzimaticamente com colagenase a 0,2% e DNase a 0,02% por pelo menos 40 min. Esta etapa de digestão é realizada a 37 °C e 5% CO2 e é acompanhada por pipetagem mecânica do meio a cada 10 min. Após a incubação, os folículos isolados são coletados manualmente usando uma pipeta microcapilar calibrada sob magnificação microscópica. Se os folículos ainda estiverem presentes nos pedaços de tecido, o procedimento é completado com microdissecção manual. Os folículos são coletados em gelo em meio de cultura e duas vezes enxaguados em gotículas de solução salina tamponada com fosfato. Este procedimento de digestão deve ser cuidadosamente controlado para evitar a deterioração dos folículos. Assim que a estrutura dos folículos parece estar comprometida ou após um máximo de 90 minutos, a reação é interrompida com uma solução de bloqueio a 4 °C contendo 10% de soro fetal bovino. Um mínimo de 20 folículos isolados (tamanho inferior a 75 μm) deve ser coletado para obter uma quantidade adequada de RNA total após a extração de RNA para reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Após a extração, a quantificação do RNA total de 20 folículos atinge um valor médio de 5 ng/μL. O RNA total é então retrotranscrito em cDNA, e os genes de interesse são posteriormente analisados usando RT-qPCR.
Introduction
O ovário é um órgão complexo composto por unidades funcionais e estruturais, incluindo os folículos dentro do córtex e o estroma. A foliculogênese, processo de ativação, crescimento e maturação dos folículos de um estado quiescente primordial para um folículo maduro capaz de ser fecundado e suportar o desenvolvimento embrionário inicial, é amplamente estudada empesquisa1. Desvendar os mecanismos que impulsionam esse fenômeno poderia melhorar o cuidado da fertilidade para as mulheres2. Análises em tecido humano fixado permitem avaliar a expressão proteica e a localização gênica dentro das unidades funcionais do ovário 3,4. No entanto, técnicas específicas são necessárias para dissociar os folículos do córtex circundante para avaliar com precisão os níveis de expressão gênica dentro dos folículos ovarianos. Assim, em estudo anterior, uma técnica de isolamento de folículos foi desenvolvida para permitir a análise da expressão gênica diretamente da unidade funcional doovário5. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidas, como digestão enzimática e/ou isolamento mecânico, bem como microdissecção por captura a laser, que permitem o isolamento do folículo dentro de um pedaço de tecido 6,7,8,9. O isolamento de folículos é amplamente utilizado, seja com tecido ovariano humano ou animal, para avaliar o perfil de expressão gênica de folículos em todas as fases do desenvolvimento10,11,12. No entanto, um procedimento de isolamento ideal deve levar em conta a frágil estrutura do folículo dentro do córtex denso e, portanto, deve ser realizado com cuidado para evitar qualquer dano7. Este manuscrito descreve um procedimento, adaptado de um protocolo descrito pelo laboratório de Woodruff, para isolar folículos humanos do córtex ovariano congelado descongelado para realizar análises de expressão gênica13.
O primeiro passo do isolamento do folículo ovariano do tecido humano congelado é o procedimento de descongelamento. Esse processo é realizado com base no protocolo clínico utilizado para a enxertia de tecido ovariano criopreservado, conforme descrito anteriormente14,15. O processo visa remover os agentes crioprotetores enxaguando o córtex ovariano em concentrações decrescentes do meio. Em seguida, o tecido é fragmentado antes do isolamento enzimático e mecânico para recuperação dos folículos. Folículos em diferentes estágios podem ser distinguidos usando um estereomicroscópio com alta magnificação e óptica de boa qualidade, a fim de isolar os de interesse. Cada folículo isolado é medido usando uma régua integrada ao microscópio, e os folículos podem ser agrupados de acordo com seu estágio de desenvolvimento: folículos primordiais (30 μm), folículos primários (60 μm), folículos secundários (120-200 μm) e folículos antrais (>200 μm)16. Uma classificação posterior pode ser realizada de acordo com a morfologia dos folículos: os folículos primordiais têm uma camada de células da granulosa (GCs) achatadas, os folículos primários têm uma camada de GCs cuboidais, os folículos secundários têm pelo menos duas camadas de GCs cuboidais e a presença de uma cavidade entre os GCs caracteriza o estágio antral. Quando os folículos de interesse são selecionados, a extração de RNA é realizada. A quantidade e a qualidade do RNA são avaliadas antes da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (RT-qPCR) (Figura 1).
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Protocol
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Erasme (Bruxelas, Bélgica). A paciente incluída neste protocolo foi submetida à criopreservação de tecido ovariano (COT) para preservação da fertilidade antes da exposição à quimioterapia em 2000. A paciente assinou o termo de consentimento livre e esclarecido para doação de seu tecido residual congelado para pesquisa ao final do período de armazenamento.
1. Descongelamento do tecido ovariano criopreservado
- Prepare uma placa de 6 poços contendo cinco soluções de descongelamento. O primeiro poço contém 5 mL de solução crioprotetora composta de meio Leibovitz-15, sacarose 0,1 mol/L, dimetilsulfóxido (DMSO) 1,5 mol/L e albumina sérica humana (HSA) a 1%. Os poços seguintes contêm 5 mL de meio Leibovitz-15 com concentrações decrescentes de crioprotetor: 1 mol/L, 0,5 mol/L e 2 x 0 mol/L DMSO.
NOTA: A solução crioprotetora pode diferir de acordo com o protocolo utilizado na clínica de fertilidade. - Remova um frasco para injetáveis contendo um fragmento cortical ovariano de azoto líquido em conformidade com as regras de segurança (luvas criogénicas, óculos de proteção e sapatos fechados) e mantenha o tubo à temperatura ambiente (TR) durante 30 s.
- Mergulhe o frasco para injetáveis em água bidestilada durante 2 minutos em RT com agitação suave antes de abrir o frasco para injetáveis sob um capuz vertical e transferi-lo diretamente para o primeiro poço da placa de 6 poços (sobre gelo).
- Transfira o fragmento sucessivamente para cada poço da placa de 6 poços, com cada um contendo concentrações decrescentes de crioprotetor em 5 mL de meio Leibovitz-15. Agitar suavemente o tecido em cada meio por 5 min (sobre gelo).
2. Isolamento dos folículos
NOTA: Todos os experimentos são conduzidos usando materiais livres de RNase e sob uma capa vertical.
- Transferir o tecido descongelado para uma placa de Petri quadriculada de 2 mm preenchida com 10 mL de meio de dissecção (meio Leibovitz-15, piruvato de sódio [2 mmol/L], L-glutamina [2 mmol/L], HSA [0,3%], penicilina G [30 μg/mL] e estreptomicina [50 μg/mL]). Ajuste o tamanho do tecido com um bisturi, se necessário.
OBS: Dependendo do protocolo clínico, o tamanho do tecido congelado pode variar de 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Para esse protocolo, foram utilizadas duas tiras de 4 mm x 2 mm x 1 mm. - Empilhar os três pedaços do fatiador de tecido, colocar o fragmento entre os dois blocos e cortar o fragmento ao meio usando uma lâmina, deslizando através dos blocos para obter dois fragmentos de 0,5 mm de espessura.
- Use o cortador de tecido para cortar o fragmento e obter pedaços menores. Se necessário, corte as peças restantes manualmente com um bisturi até que o tecido esteja totalmente quebrado.
- Transferir o tecido fragmentado para uma placa de Petri quadriculada preenchida com 7 mL de meio de digestão (meio de cultura [meio McCoy's 5A, 3 mmol/L de glutamina, 0,1% HSA, 30 μg/mL de penicilina G, 50 μg/mL de estreptomicina, 2,5 μg/mL de transferrina, 4 ng/mL de selênio e 50 μg/mL de ácido ascórbico] suplementado com 0,2% de colagenase e 0,02% de DNase).
- Coloque o prato na incubadora a 5% CO2 e 37 °C. A cada 10 min, retire a placa de Petri da incubadora e lave o tecido pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL.
- Após 45 min de incubação no meio de digestão, colocar a placa sob um estereomicroscópio com amplitude de 5x-6,3x e recuperar os folículos usando uma pipeta microcapilar. Selecione os folículos de interesse e isole-os sugando-os com uma pipeta bucal.
OBS: A pipetagem bucal deve ser realizada com cuidado para evitar a perda de material na tubulação e contaminação. - Se os folículos permanecerem presos em um pedaço do córtex, isole-os mecanicamente com duas seringas de 27 G, arrancando o córtex com a ponta das seringas para liberar os folículos do estroma.
NOTA: Não toque nos folículos com as seringas para evitar danificá-los. - Transferir os folículos com o microcapilar em uma placa de 4 poços contendo gotas de 15 μL do meio de cultura calibrado coberto por 500 μL de cultura de óleo (1 a 10 folículos por gota). Essa etapa mantém a viabilidade do folículo durante o processo de coleta. No final do procedimento, lave os folículos duas vezes por 5 s cada vez em duas gotas de 15 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) cobertas por 500 μL de cultura de óleo (sobre gelo).
- Coletar 20 folículos com uma quantidade mínima de PBS usando a pipeta bucal (máximo de 10 μL) em um tubo vazio e manter o tubo sobre gelo.
NOTA: Para a estabilidade do RNA, é crucial executar a etapa 2.8 e a etapa 2.9 no gelo. Cerca de 20 folículos (<75 μm) são necessários para ter RNA suficiente para RT-qPCR padrão (SYBR Green). - Após um máximo de 90 min de incubação no meio de digestão, interromper a reação enzimática adicionando à placa de Petri um excesso de solução bloqueadora fria (4 °C) (7,5 mL) composta de meio de cultura suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB).
NOTA: A solução de bloqueio pode ser adicionada assim que o experimentador observar folículos grudados na placa ou folículos danificados (forma assimétrica ou folículos de cor mais escura). Recomenda-se realizar o isolamento do folículo dentro de um período máximo de 2,5 h para evitar danos foliculares e realizar a extração de RNA imediatamente após o isolamento.
3. Extração de RNA
NOTA: A extração de RNA é realizada seguindo as instruções fornecidas com um kit de extração de RNA, adaptando os volumes de eluição.
- Suspender os folículos isolados adicionando 100 μL da solução de lise fornecida com o kit de extração de RNA ao tubo contendo os folículos sob uma capa química e vórtice em alta velocidade (2.500 rpm/min) para quebrar a estrutura dos folículos. Adicionar 50 μL de etanol (100%) ao tubo e agitar brevemente a alta velocidade.
NOTA: Como o tampão de lise contém 2-mercaptoetanol e ácido tiocianico, esta etapa deve ser executada com cautela sob um capuz químico. - Transferir o volume total do tubo (aproximadamente 160 μL) para um conjunto de cartucho de microfiltro composto por uma coluna e um tubo de recolha e centrifugar-o durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Lavar a coluna com 180 μL da solução de lavagem 1, fornecida com o kit, e centrifugar o tubo durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C.
- Adicionar 180 μL de solução de lavagem 2/3, fornecida com o kit, à coluna e centrifugar durante 10 s a 16,363 x g a 4 °C. Execute esta etapa duas vezes. Centrifugar o tubo uma última vez por 1 min para secar o filtro e colocar um novo tubo de coleta sob o cartucho.
- Realizar a eluição dos ácidos nucleicos em duas etapas:
- Primeiro, adicionar 8 μL de solução de eluição quente (75 °C) ao filtro, aguardar 1 min em RT e centrifugar durante 30 s a 16,363 x g a 4 °C.
- Repetir este passo com 7 μL de solução de eluição.
NOTA: O tubo que contém os ácidos nucleicos eluídos deve ser mantido no gelo. Para evitar a contaminação do DNA, uma etapa suplementar de degradação do DNA é altamente recomendada- etapa 3.5.
- Incubar o tubo com 2 UI de DNase e 1x tampão DNase durante 20 min a 37 °C. Bloquear a atividade enzimática com o reagente de inativação da 1/10 DNase por 2 min em TR.
- Centrifugar o tubo durante 1,5 min a 16,363 x g a 4 °C. Por fim, colete a suspensão contendo o RNA e transfira-o para um novo tubo.
- Avaliar a quantidade de RNA presente na amostra utilizando um espectrofotômetro (software NanoDrop 2000 > Ácido Nucleico > RNA). Use 1 μL de solução de eluição como um branco e meça a quantidade de RNA extraída de folículos isolados com 1 μL de solução.
- Verifique a relação 260/280 para a pureza do RNA (em torno de 2,0). Armazenar a amostra a −80 °C ou retrotranscrevê-la diretamente para realizar RT-qPCR.
NOTA: Para avaliar a integridade do RNA, a amostra pode ser processada com um sistema de eletroforese automatizado de alta resolução antes ou depois do congelamento a -80 °C. Neste trabalho, após retrotranscrição, foi realizada RT-qPCR com o seguinte ciclo:
Estágio de espera com 20 s a 50 °C e 10 min a 95 °C
40 ciclos de PCR com 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C
Estágio da curva de fusão com 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C e 15 s a 60 °C
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Representative Results
Usando este procedimento de isolamento, o experimentador pode recuperar folículos do ambiente estromal para realizar análises específicas de expressão gênica. Com base no tamanho e morfologia dos folículos, é possível diferenciar os diferentes estágios da foliculogênese. O experimentador pode selecionar folículos de interesse de acordo com seu tamanho usando uma pipeta microcapilar adaptada. Usando um microcapilar de no máximo 75 μm, é possível discriminar folículos primordiais e primários de folículos secundários, antrais e maduros. Além disso, o experimentador pode confirmar o estágio do folículo de acordo com a morfologia do folículo. Ao estudar a ativação dos folículos, folículos quiescentes e primários são selecionados, e aproximadamente 20 folículos são necessários para atingir uma concentração de RNA em torno de 5 ng/μL.
Dois fragmentos ovarianos homogeneizados (4 mm x 2 mm x 1 mm) da mesma paciente foram processados para isolar folículos usando este protocolo (Figura 2). Após um procedimento de isolamento de 1,5 h, duas populações de folículos foram recuperadas de acordo com os estágios de desenvolvimento para comparar a quantidade de RNA e destacar a importância da seleção de folículos: 20 folículos de <75 μm (tubo 1) e 15 folículos de <200 μm (tubo 2). Em seguida, foi realizada a extração de RNA, obtendo-se 4,8 ng/μL de RNA total do tubo 1 e 10,5 ng/μL de RNA total do tubo 2 em espectrofotômetro (Tabela 1). Usando este sistema de espectrofotômetro de microvolume, a razão 260/280 também foi medida para avaliar a pureza do RNA. Essa relação reflete o potencial de contaminação por proteínas ou outros reagentes durante a extração e deve ser próxima de 2,0 para amostras de RNA. As relações 260/280 foram de 1,89 e 1,74 no tubo 1 e no tubo 2, respectivamente, validando a pureza das amostras (Tabela 1). A qualidade do RNA foi então verificada através do processamento das amostras com eletroforese automatizada de alta resolução. Após esse procedimento, o número de integridade do RNA (NIR) foi estimado. O valor de NIR, de 1 (degradado) a 10 (intacto), reflete o nível de degradação do RNA em uma amostra. Os valores de NIR foram 7,1 e 7,9 no tubo 1 e no tubo 2, respectivamente, validando a qualidade do RNA de nossas amostras (Tabela 1). Para a realização da RT-qPCR, o volume total do RNA extraído foi primeiramente retrotranscrito para cDNA. Em seguida, 1,25 ng de cDNA foi adicionado por poço em uma placa de 96 poços, com primers para genes housekeeping e alvo (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase [HPRT], Kit Ligand [KL] e Growth Differentiation Factor 9 [GDF9]) e SYBR Green master mix17,18. Após a execução de um ciclo padrão em um sistema de PCR em tempo real, os limiares de ciclo (Ct) obtidos foram 30,87 (tubo 1) e 29,56 (tubo 2) para HPRT, 33,5 (tubo 1) e 31,77 (tubo 2) para KL e 30,71 (tubo 1) e 30,57 (tubo 2) para GDF9 (Tabela 1).
Figura 1: Representação esquemática do método de avaliação da extração de RNA de folículos ovarianos humanos isolados. Três etapas são descritas neste manuscrito: o descongelamento do tecido, o procedimento de isolamento, incluindo processamento mecânico e enzimático, e a extração de RNA dos folículos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Folículos coletados seguindo o protocolo de isolamento. (A) Tecido cortical descongelado. (B) O cortador de tecido e (C) o cortador de tecido usado para fragmentar o tecido. (D-E) Imagens de folículos isolados recuperados observados com estereomicroscópio com ocular de 10x e ampla faixa de zoom (1x-6,3x); Ajustes de magnificação de 50x-63x foram utilizados para a identificação dos folículos primordiais e primários. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tubo | Número de folículos | Tamanho dos folículos (μm) | Concentração de RNA (ng/μL) | Relação 260/280 | Número de integridade do RNA (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabela 1: Limiares de pureza, RIN e ciclo de dois fragmentos ovarianos homogeneizados.
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Discussion
A criopreservação do tecido ovariano é uma abordagem promissora para a preservação da fertilidade de pacientes com câncer. Na clínica, o tecido cortical descongelado é enxertado de volta na paciente após a remissão, permitindo a retomada da função ovariana e da fertilidade19,20. Além do uso clínico, fragmentos ovarianos residuais também podem ser doados para pesquisa ao final do período de armazenamento para estudar os mecanismos reguladores da foliculogênese. Além disso, esse tecido é particularmente útil para o desenvolvimento de alternativas à enxertia quando ela não é viável, como sistemas de cultivo in vitro ou ovários artificiais. Entretanto, variações dentro e entre pacientes limitam a viabilidade e a reprodutibilidade dos experimentos e a interpretação dos resultados. De fato, a densidade folicular diminui drasticamente com a idade, e os folículos não estão igualmente distribuídos entre os fragmentos21. Como o número de fragmentos disponíveis é limitado, o tecido humano precisa ser usado com técnicas de ponta. Uma ampla gama de técnicas, como imunohistoquímica e imunofluorescência, bem como hibridização in situ, pode ser realizada em tecido fixo para avaliar a localização de proteínas e genes 3,18. Para estudar os mecanismos moleculares que regulam a foliculogênese dentro das unidades funcionais do ovário em diferentes estágios de desenvolvimento, o isolamento dos folículos é necessário.
Vários estudos têm explorado métodos eficazes para separar os folículos do tecido circundante em espécies humanas e animais22. O número de folículos recuperados e a qualidade do RNA após a extração podem variar de acordo com as técnicas utilizadas. Para estudar a ativação dos folículos (isto é, folículos primordiais e primários), pelo menos 20 folículos agrupados são necessários para realizar a RT-qPCR padrão. Utilizando métodos alternativos como amplificação de RNA ou cDNA ou nested PCR, é possível trabalhar com menos folículos23,24.
A natureza densa do córtex ovariano torna o isolamento dos folículos desafiador, o que tem levado ao uso de métodos que envolvem uma combinação de isolamento enzimático e mecânico25. Diferentes tipos de enzimas podem ser utilizadas, como colagenase e DNase26. No entanto, estudos têm relatado danos nos folículos após a digestão enzimática, impactando ainda mais o desenvolvimento in vitro 27,28. Para manter a integridade dos folículos, várias equipes estão atualmente utilizando protocolos de digestão enzimática adaptados ou realizando apenas isolamento mecânico para posterior cultura folicular 25,29,30,31. Este manuscrito relata um método simples e eficiente para obtenção de folículos isolados para análise quantitativa da PCR. No entanto, todos os experimentos requerem uma curva de aprendizado antes de alcançar os melhores resultados.
Para fins de pesquisa fundamental, uma revisão de um protocolo anterior foi desenvolvida para recuperar uma grande quantidade de folículos sem afetar sua integridade13. O processamento para análise da expressão gênica é realizado diretamente após o isolamento para otimizar a qualidade do RNA. Também é crucial evitar a digestão prolongada, a fim de limitar o risco de selecionar folículos degenerados. Assim, a etapa de digestão permanece crucial neste protocolo. Três pontos requerem atenção específica: (1) a lavagem do tecido durante a reação enzimática a cada 10 min para proporcionar ação enzimática homogênea; (2) o controle da integridade do folículo selecionando folículos saudáveis durante o procedimento e interrompendo a reação com solução de bloqueio assim que o dano é observado; (3) a adaptação da concentração de colagenase, uma vez que a rigidez tecidual pode variar entre os pacientes de acordo com a idade. A concentração de colagenase pode ser reduzida (para 0,12%) em alguns casos para prevenir danos (ou seja, em pacientes pré-púberes)32.
Na última parte deste protocolo, a extração de RNA dos folículos isolados foi realizada seguindo instruções adaptadas. Isso permite uma ampla gama de experimentos, como RT-qPCR ou sequenciamento de RNA, fornecendo informações fundamentais sobre vários processos celulares específicos de células de ovócitos e granulosas. Numerosos protocolos e kits estão disponíveis para extrair o RNA do tecido. Relatamos aqui uma técnica eficiente utilizada em nosso laboratório que permite a extração de uma quantidade suficiente de RNA para realizar análises de expressão gênica por RT-qPCR. Embora a extração direta de RNA seja altamente recomendada após o isolamento do folículo para manter a integridade do RNA, também é possível congelar os folículos isolados a -80 °C se a extração não puder ser realizada no mesmo dia. A quantidade de RNA pode variar de acordo com o tamanho dos folículos, e os folículos em crescimento podem interferir na análise se agrupados com os folículos quiescentes. A seleção baseada no tamanho é de extrema relevância, dependendo dos objetivos do estudo, principalmente para a primeira etapa da foliculogênese. No entanto, a diferenciação entre folículos primordiais e primários baseada apenas no tamanho permanece desafiadora em termos de avaliar adequadamente os níveis de expressão gênica dos folículos primordiais. A seleção dos folículos primordiais e primários pode ser realizada com base em sua morfologia, mas a discriminação entre eles com um estereomicroscópio em um aumento de 63x é difícil.
Em conclusão, o experimentador deve estar ciente dos desafios do isolamento dos folículos e levá-los em consideração ao analisar os resultados. Parâmetros importantes devem ser considerados, como (1) intra/intervariações na densidade dos folículos entre as pacientes; (2) integridade do folículo durante o isolamento do folículo; (3) diferenciação entre diferentes estágios dos folículos; e (4) estabilidade e integridade do RNA.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Excelência da Ciência (EOS) (ID: 30443682). I.D. é pesquisador associado do Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
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