Summary
Здесь мы описываем протокол, описывающий, как изолировать фолликулы яичников человека из замороженной-размороженной корковой ткани для проведения анализа экспрессии генов.
Abstract
Яичник представляет собой гетерогенный орган, состоящий из разных типов клеток. Для изучения молекулярных механизмов, происходящих во время фолликулогенеза, локализация белков и экспрессия генов могут быть выполнены на фиксированной ткани. Однако, чтобы правильно оценить уровни экспрессии генов в фолликуле человека, эта сложная и тонкая структура должна быть изолирована. Следовательно, адаптированный протокол, ранее описанный лабораторией Вудраффа, был разработан для отделения фолликулов (клеток ооцитов и гранулез) от окружающей их среды. Ткань коры яичников сначала обрабатывается вручную для получения небольших фрагментов с использованием двух инструментов: тканевого слайсера и тканевого измельчителя. Затем ткань ферментативно переваривают 0,2% коллагеназой и 0,02% ДНКазой в течение не менее 40 мин. Эта стадия разложения выполняется при 37 °C и 5% CO2 и сопровождается механическим пипетированием среды каждые 10 минут. После инкубации выделенные фолликулы собирают вручную с помощью калиброванной микрокапиллярной пипетки под микроскопическим увеличением. Если фолликулы все еще присутствуют в кусочках ткани, процедура завершается ручной микродиссекцией. Фолликулы собирают на льду в питательной среде и дважды промывают каплями фосфатно-буферного физиологического раствора. Эту процедуру пищеварения необходимо тщательно контролировать, чтобы избежать разрушения фолликулов. Как только структура фолликулов кажется нарушенной или максимум через 90 минут, реакцию останавливают раствором, блокирующим 4 ° C, содержащим 10% эмбриональной бычьей сыворотки. Необходимо собрать не менее 20 изолированных фолликулов (размером менее 75 мкм) для получения достаточного количества общей РНК после экстракции РНК для количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-кПЦР). После экстракции количественное определение общей РНК из 20 фолликулов достигает среднего значения 5 нг/мкл. Затем общая РНК ретротранскрибируется в кДНК, а интересующие гены дополнительно анализируются с помощью ОТ-кПЦР.
Introduction
Яичник представляет собой сложный орган, состоящий из функциональных и структурных единиц, включая фолликулы в коре и строму. Фолликулогенез, процесс активации, роста и созревания фолликулов от первичного состояния покоя до зрелого фолликула, способного к оплодотворению и поддержке раннего эмбрионального развития, широко изучается в исследовании1. Раскрытие механизмов, лежащих в основе этого явления, может улучшить лечение бесплодия у женщин2. Анализы фиксированных тканей человека позволяют оценить экспрессию белка и локализацию генов в функциональных единицах яичника 3,4. Тем не менее, необходимы специальные методы для диссоциации фолликулов от окружающей коры, чтобы точно оценить уровни экспрессии генов в фолликулах яичников. Следовательно, в предыдущем исследовании был разработан метод выделения фолликулов, позволяющий анализировать экспрессию генов непосредственно из функциональной единицы яичника5. Были разработаны различные подходы, такие как ферментативное расщепление и/или механическая изоляция, а также микродиссекция с лазерным захватом, которые позволяют изолировать фолликулы в кусочкеткани 6,7,8,9. Выделение фолликулов широко используется как с тканью яичников человека, так и с тканями животных для оценки профилей экспрессии генов фолликулов на всех стадиях развития10,11,12. Тем не менее, оптимальная процедура изоляции должна учитывать хрупкую структуру фолликула в плотной коре и, следовательно, должна выполняться с осторожностью, чтобы избежать каких-либо повреждений7. В этой рукописи описывается процедура, адаптированная из протокола, описанного лабораторией Вудраффа, для выделения фолликулов человека из замороженной-размороженной коры яичников для проведения анализа экспрессии генов13.
Первым этапом выделения фолликулов яичников из замороженных тканей человека является процедура размораживания. Этот процесс выполняется на основе клинического протокола, используемого для трансплантации криоконсервированной ткани яичника, как описано ранее14,15. Процесс направлен на удаление криопротекторов путем промывания коры яичников при снижении концентрации среды. Затем ткань фрагментируется перед ферментативной и механической изоляцией для извлечения фолликулов. Фолликулы на разных стадиях можно различить с помощью стереомикроскопа с большим увеличением и качественной оптикой, чтобы выделить интересующие. Каждый изолированный фолликул измеряется с помощью линейки, встроенной в микроскоп, и фолликулы могут быть объединены в соответствии со стадией их развития: примордиальные фолликулы (30 мкм), первичные фолликулы (60 мкм), вторичные фолликулы (120-200 мкм) и антральные фолликулы (>200 мкм)16. Дальнейшая классификация может быть выполнена по морфологии фолликулов: примордиальные фолликулы имеют один слой уплощенных гранулезных клеток (ГК), первичные фолликулы имеют один слой кубовидных ГК, вторичные фолликулы имеют не менее двух слоев кубовидных ГК, а наличие полости среди ГК характеризует антральную стадию. При отборе интересующих фолликулов проводится экстракция РНК. Количество и качество РНК оцениваются перед количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ОТ-кПЦР) (рис. 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот проект был одобрен Этическим комитетом больницы Эразме (Брюссель, Бельгия). Пациентка, включенная в этот протокол, прошла криоконсервацию ткани яичника (OTC) для сохранения фертильности перед химиотерапией в 2000 году. Пациентка подписала информированное письменное согласие на сдачу остаточной замороженной ткани на исследование по окончании срока хранения.
1. Размораживание криоконсервированной ткани яичника
- Подготовьте 6-луночную тарелку, содержащую пять оттаивающих растворов. Первая лунка содержит 5 мл раствора криопротектора, состоящего из среды Лейбовица-15, 0,1 моль/л сахарозы, 1,5 моль/л диметилсульфоксида (ДМСО) и 1% сывороточного альбумина человека (HSA). Следующие скважины содержат 5 мл среды Лейбовица-15 с убывающими концентрациями криопротектора: 1 моль/л, 0,5 моль/л и 2 х 0 моль/л ДМСО.
ПРИМЕЧАНИЕ: Криопротекторный раствор может отличаться в зависимости от протокола, используемого в клинике репродуктивной медицины. - Извлеките флакон, содержащий фрагмент коры яичников, из жидкого азота с соблюдением правил безопасности (криогенные перчатки, защитные очки и закрытая обувь) и держите пробирку при комнатной температуре (РТ) в течение 30 с.
- Замочите флакон в двойной дистиллированной воде на 2 минуты при RT при легком перемешивании, прежде чем открыть флакон под вертикальным колпаком и непосредственно перенести его в первую лунку 6-луночной пластины (на льду).
- Перенесите фрагмент последовательно в каждую лунку 6-луночного планшета, каждая из которых содержит уменьшающиеся концентрации криопротектора в 5 мл среды Лейбовица-15. Осторожно взбалтывайте ткань в каждой среде в течение 5 минут (на льду).
2. Выделение фолликулов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты проводятся с использованием материалов, не содержащих РНКазы, и под вертикальным капотом.
- Переложите размороженную ткань в решетчатую чашку Петри диаметром 2 мм, заполненную 10 мл диссекционной среды (среда Лейбовица-15, пируват натрия [2 ммоль/л], L-глютамин [2 ммоль/л], HSA [0,3%], пенициллин G [30 мкг/мл] и стрептомицин [50 мкг/мл]). При необходимости отрегулируйте размер ткани скальпелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от клинического протокола размер замороженной ткани может варьироваться от 8 мм х 4 мм х 1 мм до 4 мм х 2 мм х 1 мм. Для этого протокола использовались две полоски размером 4 мм х 2 мм х 1 мм. - Сложите три части тканевого слайсера, поместите фрагмент между двумя блоками и разрежьте фрагмент пополам с помощью лезвия, скользя по блокам, чтобы получить два фрагмента толщиной 0,5 мм.
- Используйте измельчитель ткани, чтобы разрезать фрагмент и получить более мелкие кусочки. При необходимости отрежьте оставшиеся кусочки вручную скальпелем, пока ткань полностью не разобьется.
- Перенесите фрагментированную ткань в решетчатую чашку Петри, заполненную 7 мл среды для пищеварения (питательная среда [среда Маккоя 5A, 3 ммоль/л глутамина, 0,1% HSA, 30 мкг/мл пенициллина G, 50 мкг/мл стрептомицина, 2,5 мкг/мл трансферрина, 4 нг/мл селена и 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты] с добавкой 0,2% коллагеназы и 0,02% ДНКазы).
- Поставьте посуду в инкубатор при 5%CO2 и 37 °C. Каждые 10 минут вынимайте чашку Петри из инкубатора и промывайте ткань пипеткой вверх и вниз пипеткой объемом 1 мл.
- После 45 минут инкубации в среде для разложения поместите чашку под стереомикроскоп с диапазоном увеличения 5x-6,3x и извлеките фолликулы с помощью микрокапиллярной пипетки. Выберите интересующие фолликулы и изолируйте их, всасывая их с помощью ротовой пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пипетирование во рту следует выполнять осторожно, чтобы избежать попадания материала в трубу и загрязнения. - Если фолликулы застряли в кусочке коры, изолируйте их механически с помощью двух шприцев по 27 G, оторвав кору кончиком шприца, чтобы высвободить фолликулы из стромы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к фолликулам шприцами, чтобы не повредить их. - Перенесите фолликулы с микрокапилляром в 4-луночную пластину, содержащую капли 15 мкл калиброванной питательной среды, покрытой 500 мкл масляной культуры (от 1 до 10 фолликулов на каплю). Этот шаг поддерживает жизнеспособность фолликула в процессе сбора. В конце процедуры промыть фолликулы дважды в течение 5 с каждый раз в две капли по 15 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), покрытого 500 мкл масляной культуры (на льду).
- Соберите 20 фолликулов с минимальным количеством PBS с помощью ротовой пипетки (максимум 10 мкл) в пустую пробирку и держите трубку на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для стабильности РНК крайне важно выполнить шаги 2.8 и 2.9 на льду. Около 20 фолликулов (<75 мкм) необходимо, чтобы иметь достаточное количество РНК для стандартной ОТ-кПЦР (SYBR Green). - Максимум через 90 минут инкубации в среде сбраживания остановите ферментативную реакцию, добавив в чашку Петри избыток холодного (4 °C) блокирующего раствора (7,5 мл), состоящего из питательной среды, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий раствор может быть добавлен, как только экспериментатор заметит прилипание фолликулов к пластине или поврежденные фолликулы (асимметричная форма или фолликулы более темного цвета). Рекомендуется выполнять изоляцию фолликулов в течение максимум 2,5 часов, чтобы избежать повреждения фолликулов, и выполнять экстракцию РНК сразу после выделения.
3. Экстракция РНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция РНК выполняется в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору для экстракции РНК, путем адаптации объемов элюирования.
- Суспендируйте изолированные фолликулы, добавив 100 мкл лизисного раствора, поставляемого с набором для экстракции РНК, в трубку, содержащую фолликулы под химическим колпаком, и вихревите с высокой скоростью (2,500 об / мин), чтобы разрушить структуру фолликулов. Добавьте 50 мкл этанола (100%) в пробирку и кратковременно встряхните на высокой скорости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку буфер для лизиса содержит 2-меркаптоэтанол и тиоциановую кислоту, этот этап следует выполнять с осторожностью под химическим колпаком. - Перенесите общий объем пробирки (приблизительно 160 мкл) в узел картриджа микрофильтра, состоящий из колонки и сборной трубки, и центрифугируйте его в течение 10 с при 16 363 x g при 4 °C. Вымойте колонку 180 мкл промывочного раствора 1, входящего в комплект поставки, и центрифугируйте пробирку в течение 10 с при 16 363 x g при 4 °C.
- Добавьте 180 мкл промывочного раствора 2/3, входящего в комплект, в колонну и центрифугу в течение 10 с при 16,363 x g при 4 °C. Выполните этот шаг дважды. Центрифугируйте пробирку в последний раз в течение 1 минуты, чтобы высушить фильтр, и поместите новую сборную трубку под картридж.
- Выполняют элюирование нуклеиновых кислот в два этапа:
- Сначала добавьте в фильтр 8 мкл теплого элюирующего раствора (75 °C), подождите 1 мин при RT и центрифугу в течение 30 с при 16,363 x g при 4 °C.
- Повторите этот шаг с 7 мкл элюирующего раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирка, содержащая элюированные нуклеиновые кислоты, должна храниться на льду. Чтобы избежать загрязнения ДНК, настоятельно рекомендуется дополнительный этап деградации ДНК - шаг 3.5.
- Инкубируйте пробирку с 2 МЕ ДНКазой и 1x ДНКазным буфером в течение 20 мин при 37 ° C. Блокировать ферментативную активность реагентом для инактивации ДНКазы 1/10 в течение 2 мин при ЛТ.
- Центрифугируйте пробирку в течение 1,5 мин при 16,363 x g при 4 °C. Наконец, соберите суспензию, содержащую РНК, и перенесите ее в новую пробирку.
- Оцените количество РНК, присутствующей в образце, с помощью спектрофотометра (программное обеспечение NanoDrop 2000 > нуклеиновых кислот > РНК). Используйте 1 мкл элюирующего раствора в качестве заготовки и измерьте количество РНК, извлеченной из изолированных фолликулов, с помощью 1 мкл раствора.
- Проверьте соотношение 260/280 на чистоту РНК (около 2,0). Храните образец при температуре −80 °C или непосредственно ретротранскрибируйте его для выполнения ОТ-кПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки целостности РНК образец может быть обработан с помощью автоматизированной системы электрофореза высокого разрешения до или после замораживания при -80 ° C. В этой работе после ретротранскрипции ОТ-кПЦР проводили по следующему циклу:
Выдерживать сцену 20 с при 50 °C и 10 мин при 95 °C
40 циклов ПЦР по 15 с при 95 °C и 1 мин при 60 °C
Стадия кривой расплава с 15 с при 95 °C, 1 мин при 60 °C, 30 с при 95 °C и 15 с при 60 °C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя эту процедуру выделения, экспериментатор может извлекать фолликулы из стромальной среды для выполнения специфического анализа экспрессии генов. Основываясь на размерах и морфологии фолликулов, можно дифференцировать различные стадии фолликулогенеза. Экспериментатор может выбрать интересующие фолликулы в соответствии с их размером, используя адаптированную микрокапиллярную пипетку. Используя микрокапилляр размером не более 75 мкм, можно отличить первичные и первичные фолликулы от вторичных, антральных и зрелых фолликулов. Кроме того, экспериментатор может подтвердить стадию фолликула в соответствии с морфологией фолликула. При изучении активации фолликулов отбираются покоившиеся и первичные фолликулы, и для достижения концентрации РНК около 5 нг/мкл необходимо примерно 20 фолликулов.
Два гомогенизированных фрагмента яичников (4 мм х 2 мм х 1 мм) у одной и той же пациентки были обработаны для выделения фолликулов с использованием этого протокола (рис. 2). После 1,5-часовой процедуры выделения были извлечены две популяции фолликулов в соответствии со стадиями развития, чтобы сравнить количество РНК и подчеркнуть значимость отбора фолликулов: 20 фолликулов размером <75 мкм (трубка 1) и 15 фолликулов размером <200 мкм (трубка 2). Затем проводили экстракцию РНК, и с помощью спектрофотометра для количественного определения получали общую РНК 4,8 нг/мкл из пробирки 1 и общую РНК 10,5 нг/мкл из пробирки 2 (табл. 1). Используя эту систему микрообъемного спектрофотометра, соотношение 260/280 также было измерено для оценки чистоты РНК. Это соотношение отражает потенциальное загрязнение белком или другими реагентами во время экстракции и должно быть близко к 2,0 для образцов РНК. Соотношение 260/280 составляло 1,89 и 1,74 в пробирке 1 и пробирке 2 соответственно, что подтверждает чистоту образцов (таблица 1). Затем качество РНК проверяли путем обработки образцов с помощью автоматизированного электрофореза высокого разрешения. После этой процедуры оценивали число целостности РНК (RIN). Значение RIN от 1 (деградированный) до 10 (неповрежденный) отражает уровень деградации РНК в образце. Значения RIN составили 7,1 и 7,9 в пробирке 1 и пробирке 2 соответственно, что подтверждает качество РНК из наших образцов (таблица 1). Для проведения ОТ-кПЦР общий объем выделенной РНК сначала ретротранскрибировали в кДНК. Затем на 96-луночную пластину добавляли 1,25 нг кДНК с праймерами для ведения домашнего хозяйства и генами-мишенями (гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза [HPRT], Kit Ligand [KL] и фактор дифференцировки роста 9 [GDF9]) и мастер-микс SYBRGreen 17,18. После запуска стандартного цикла на системе ПЦР в реальном времени полученные пороговые значения цикла (Ct) составили 30,87 (пробирка 1) и 29,56 (пробирка 2) для HPRT, 33,5 (пробирка 1) и 31,77 (пробирка 2) для KL и 30,71 (пробирка 1) и 30,57 (пробирка 2) для GDF9 (таблица 1).
Рисунок 1: Схематическое изображение метода оценки выделения РНК из изолированных фолликулов яичников человека. В этой рукописи описаны три этапа: размораживание тканей, процедура выделения, включая механическую и ферментативную обработку, и экстракция РНК из фолликулов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Собранные фолликулы в соответствии с протоколом выделения. (А) Размороженная корковая ткань. (B) Тканевый слайсер и (C) измельчитель ткани, используемый для фрагментации ткани. (Д-В) Изображения извлеченных изолированных фолликулов, наблюдаемые с помощью стереомикроскопа с 10-кратным окуляром и широким диапазоном зума (1x-6,3x); Для идентификации первичных и первичных фолликулов использовались настройки увеличения 50х-63х. Масштабные линейки: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Тюбик | Количество фолликулов | Размер фолликулов (мкм) | Концентрация РНК (нг/мкл) | Соотношение 260/280 | Номер целостности РНК (RIN) | ХПРТ Кт | КЛ Кт | ГДФ9 Кт | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Таблица 1: Пороги чистоты, RIN и цикла двух гомогенизированных фрагментов яичников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Криоконсервация ткани яичников является перспективным подходом для сохранения фертильности онкологических больных. В клинике размороженная кортикальная ткань пересаживается обратно пациентке после ремиссии, что позволяет возобновить функцию яичников и фертильность19,20. Помимо клинического применения, остаточные фрагменты яичников также могут быть переданы для исследования в конце периода хранения для изучения механизмов, регулирующих фолликулогенез. Кроме того, эта ткань особенно полезна для разработки альтернатив трансплантации, когда это невозможно, например, систем культивирования in vitro или искусственных яичников. Однако различия как внутри, так и между пациентами ограничивают осуществимость и воспроизводимость экспериментов и интерпретацию результатов. Действительно, плотность фолликулов резко снижается с возрастом, и фолликулы неравномерно распределены между фрагментами21. Поскольку количество доступных фрагментов ограничено, ткани человека необходимо использовать с использованием передовых методов. Широкий спектр методов, таких как иммуногистохимия и иммунофлуоресценция, а также гибридизация in situ, может быть выполнен на фиксированной ткани для оценки локализации белка и генов 3,18. Для изучения молекулярных механизмов, регулирующих фолликулогенез в функциональных единицах яичника на разных стадиях развития, требуется выделение фолликулов.
В нескольких исследованиях изучались эффективные методы отделения фолликулов от окружающих тканей у людей и животных22. Количество извлеченных фолликулов и качество РНК после экстракции могут варьироваться в зависимости от используемых методов. Для изучения активации фолликулов (т.е. первичных и первичных фолликулов) необходимо не менее 20 объединенных фолликулов для выполнения стандартной ОТ-кПЦР. Используя альтернативные методы, такие как амплификация РНК или кДНК или вложенная ПЦР, можно работать с меньшим количеством фолликулов23,24.
Плотная природа коры яичников затрудняет выделение фолликулов, что привело к использованию методов, включающих комбинацию ферментативной и механической изоляции25. Можно использовать различные типы ферментов, такие как коллагеназа и ДНКаза26. Тем не менее, исследования сообщили о повреждении фолликулов после ферментативного пищеварения, что повлияло на дальнейшее развитие in vitro 27,28. Для поддержания целостности фолликулов несколько команд в настоящее время используют адаптированные протоколы ферментативного пищеварения или выполняют только механическую изоляцию для последующего культивирования фолликулов 25,29,30,31. В этой рукописи сообщается о простом и эффективном методе получения изолированных фолликулов для количественного ПЦР-анализа. Тем не менее, все эксперименты требуют обучения, прежде чем достичь оптимальных результатов.
В целях фундаментальных исследований был разработан пересмотр предыдущего протокола, позволяющий извлекать большое количество фолликулов без ущерба для их целостности13. Обработка для анализа экспрессии генов выполняется непосредственно после выделения для оптимизации качества РНК. Также крайне важно избегать длительного пищеварения, чтобы ограничить риск выделения дегенерированных фолликулов. Таким образом, этап пищеварения остается решающим в этом протоколе. Особого внимания требуют три момента: (1) промывание ткани во время ферментативной реакции каждые 10 мин для обеспечения гомогенного действия фермента; (2) контроль целостности фолликулов путем выбора здоровых фолликулов во время процедуры и остановки реакции блокирующим раствором, как только наблюдается повреждение; (3) адаптация концентрации коллагеназы, так как жесткость тканей может варьироваться у разных пациентов в зависимости от возраста. Концентрация коллагеназы может быть снижена (до 0,12%) в некоторых случаях для предотвращения повреждения (например, у пациентов препубертатного возраста)32.
В последней части этого протокола экстракция РНК из изолированных фолликулов проводилась в соответствии с адаптированными инструкциями. Это позволяет проводить широкий спектр экспериментов, таких как ОТ-кПЦР или секвенирование РНК, предоставляя фундаментальную информацию о различных клеточных процессах, специфичных для клеток ооцитов и гранулез. Доступны многочисленные протоколы и наборы для извлечения РНК из ткани. Мы сообщили здесь об эффективном методе, используемом в нашей лаборатории, который позволяет извлекать достаточное количество РНК для проведения анализа экспрессии генов с помощью ОТ-кПЦР. Хотя прямая экстракция РНК настоятельно рекомендуется после выделения фолликулов для поддержания целостности РНК, также можно заморозить изолированные фолликулы при -80 ° C, если экстракция не может быть выполнена в тот же день. Количество РНК может варьироваться в зависимости от размера фолликулов, и растущие фолликулы могут мешать анализу, если они объединены с фолликулами, находящимися в состоянии покоя. Отбор по размеру чрезвычайно актуален в зависимости от целей исследования, особенно для первого этапа фолликулогенеза. Тем не менее, дифференциация между примордиальными и первичными фолликулами, основанная только на размере, остается сложной с точки зрения правильной оценки уровней экспрессии генов примордиальных фолликулов. Отбор первичных и первичных фолликулов может быть выполнен на основе их морфологии, но различение их стереомикроскопом при увеличении 63х затруднено.
В заключение, экспериментатор должен знать о проблемах выделения фолликулов и учитывать их при анализе результатов. Необходимо учитывать важные параметры, такие как (1) интра/взаимные вариации плотности фолликулов между пациентами; (2) целостность фолликулов во время выделения фолликулов; (3) дифференциация между различными стадиями фолликулов; и (4) стабильность и целостность РНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). И.Д. является младшим научным сотрудником Национального фонда научных исследований Бельгии (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
