Summary
Här beskriver vi ett protokoll som beskriver hur man isolerar humana äggstocksfolliklar från fryst tinad kortikal vävnad för att utföra genuttrycksanalyser.
Abstract
Äggstocken är ett heterogent organ som består av olika celltyper. För att studera de molekylära mekanismer som uppstår under follikulogenesen kan lokalisering av proteiner och genuttryck utföras på fast vävnad. Men för att korrekt bedöma genuttrycksnivåer i en mänsklig follikel måste denna komplexa och känsliga struktur isoleras. Därför har ett anpassat protokoll som tidigare beskrivits av Woodruffs laboratorium utvecklats för att separera folliklar (oocyten och granulosacellerna) från deras omgivande miljö. Den ovariella kortikala vävnaden bearbetas först manuellt för att erhålla små fragment med hjälp av två verktyg: en vävnadsskivare och en vävnadshackare. Vävnaden spjälkas sedan enzymatiskt med 0,2% kollagenas och 0,02% DNas i minst 40 min. Detta uppslutningssteg utförs vid 37 °C och 5 %CO2 och åtföljs av mekanisk pipettering av mediet var 10:e minut. Efter inkubation uppsamlas de isolerade folliklarna manuellt med hjälp av en kalibrerad mikrokapillärpipett under mikroskopförstoring. Om folliklar fortfarande finns i vävnadsbitarna avslutas proceduren med manuell mikrodissektion. Folliklarna samlas på is i ett odlingsmedium och sköljs två gånger i droppar fosfatbuffrad saltlösning. Denna matsmältningsprocedur måste kontrolleras noggrant för att undvika försämring av follikeln. Så snart folliklarnas struktur verkar vara nedsatt eller efter högst 90 minuter stoppas reaktionen med en 4 °C blockerande lösning innehållande 10 % fetalt bovint serum. Minst 20 isolerade folliklar (storlek under 75 μm) bör samlas in för att erhålla en tillräcklig mängd totalt RNA efter RNA-extraktion för kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR). Efter extraktion når kvantifieringen av totalt RNA från 20 folliklar ett medelvärde på 5 ng / μL. Det totala RNA transkriberas sedan retrotranskriberat till cDNA, och generna av intresse analyseras vidare med RT-qPCR.
Introduction
Äggstocken är ett komplext organ som består av funktionella och strukturella enheter, inklusive folliklarna i cortex och stroma. Follikulogenes, processen för follikelaktivering, tillväxt och mognad från ett primordialt vilande tillstånd till en mogen follikel som kan befruktas och stödja tidig embryonal utveckling, studeras allmänt i forskning1. Att riva upp mekanismerna som driver detta fenomen kan förbättra fertilitetsvården för kvinnor2. Analyser av fast mänsklig vävnad gör det möjligt att bedöma proteinuttryck och genlokalisering inom äggstockens funktionella enheter 3,4. Emellertid behövs specifika tekniker för att dissociera folliklarna från den omgivande cortexen för att exakt bedöma genuttrycksnivåer inom äggstocksfolliklarna. I en tidigare studie utvecklades därför en follikelisoleringsteknik för att möjliggöra analyser av genuttryck direkt från den funktionella enheten i äggstocken5. Olika tillvägagångssätt har utvecklats, såsom enzymatisk nedbrytning och / eller mekanisk isolering, liksom laserinfångningsmikrodissektion, som möjliggör follikelisolering i en bit vävnad 6,7,8,9. Follikelisolering används i stor utsträckning, antingen med äggstocksvävnad från människa eller djur, för att utvärdera genuttrycksprofilerna för folliklar i alla utvecklingsstadier10,11,12. Ett optimalt isoleringsförfarande bör emellertid ta hänsyn till follikelns bräckliga struktur i den täta cortexen och bör därför utföras med försiktighet för att undvika skador7. Detta manuskript beskriver ett förfarande, anpassat från ett protokoll som beskrivs av Woodruffs laboratorium, för att isolera mänskliga folliklar från fryst tinad äggstocksbark för att utföra genuttrycksanalyser13.
Det första steget i isolering av äggstocksfollikeln från frusen mänsklig vävnad är upptiningsproceduren. Denna process utförs baserat på det kliniska protokoll som används för ympning av kryokonserverad äggstocksvävnad, som tidigare beskrivits14,15. Processen syftar till att avlägsna kryoprotektiva medel genom att skölja äggstocksbarken i minskande koncentrationer av mediet. Därefter fragmenteras vävnaden före enzymatisk och mekanisk isolering för att hämta folliklarna. Folliklar i olika stadier kan särskiljas med hjälp av ett stereomikroskop med hög förstoring och optik av god kvalitet för att isolera de av intresse. Varje isolerad follikel mäts med hjälp av en linjal integrerad i mikroskopet, och folliklarna kan slås samman enligt deras utvecklingsstadium: primordiala folliklar (30 μm), primära folliklar (60 μm), sekundära folliklar (120-200 μm) och antrala folliklar (>200 μm)16. Ytterligare klassificering kan utföras enligt folliklarnas morfologi: primordiala folliklar har ett lager av plana granulosaceller (GC), primära folliklar har ett lager av kuboidala GC, sekundära folliklar har minst två lager av kuboidala GC och närvaron av ett hålrum bland GC: erna kännetecknar antralstadiet. När folliklar av intresse väljs utförs RNA-extraktion. RNA-kvantiteten och kvaliteten utvärderas före kvantitativ polymeraskedjereaktion i realtid (RT-qPCR) (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Projektet godkändes av den etiska kommittén för Erasme-sjukhuset (Bryssel, Belgien). Patienten som ingår i detta protokoll genomgick kryokonservering av äggstocksvävnad (OTC) för fertilitetsbevarande före kemoterapiexponering år 2000. Patienten undertecknade informerat skriftligt samtycke till att donera sin kvarvarande frysta vävnad till forskning i slutet av lagringsperioden.
1. Upptining av kryokonserverad äggstocksvävnad
- Förbered en 6-brunnsplatta som innehåller fem upptiningslösningar. Den första brunnen innehåller 5 ml kryoskyddande lösning bestående av Leibovitz-15-medium, 0,1 mol / L sackaros, 1,5 mol / L dimetylsulfoxid (DMSO) och 1% humant serumalbumin (HSA). Nästa brunnar innehåller 5 ml Leibovitz-15-medium med minskande koncentrationer av kryoskyddande medel: 1 mol / L, 0,5 mol / L och 2 x 0 mol / L DMSO.
OBS: Kryoskyddslösningen kan variera beroende på protokollet som används i fertilitetskliniken. - Ta bort en injektionsflaska som innehåller ett kortikalt fragment av äggstockarna från flytande kväve i enlighet med säkerhetsreglerna (kryogena handskar, skyddsglasögon och stängda skor) och håll röret vid rumstemperatur (RT) i 30 sekunder.
- Blötlägg injektionsflaskan i dubbeldestillerat vatten i 2 minuter vid rumstemperatur med försiktig omrörning innan du öppnar injektionsflaskan under en vertikal huva och överför den direkt till den första brunnen på 6-brunnsplattan (på is).
- Överför fragmentet successivt till varje brunn på 6-brunnsplattan, var och en innehållande minskande koncentrationer av kryoprotektivt medel i 5 ml Leibovitz-15-medium. Skaka försiktigt vävnaden i varje medium i 5 minuter (på is).
2. Follikelisolering
OBS: Alla experiment utförs med RNase-fria material och under en vertikal huva.
- Överför den tinade vävnaden till en 2 mm rutad petriskål fylld med 10 ml dissektionsmedium (Leibovitz-15-medium, natriumpyruvat [2 mmol / L], L-glutamin [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicillin G [30 μg / ml] och streptomycin [50 μg / ml]). Justera vävnadens storlek med en skalpell om det behövs.
OBS: Beroende på det kliniska protokollet kan storleken på den frysta vävnaden variera från 8 mm x 4 mm x 1 mm till 4 mm x 2 mm x 1 mm. För detta protokoll användes två remsor på 4 mm x 2 mm x 1 mm. - Stapla upp de tre bitarna av vävnadsskivan, lägg fragmentet mellan de två blocken och skär fragmentet i hälften med ett blad, glid genom blocken för att få två fragment med 0,5 mm tjocklek.
- Använd vävnadshackaren för att skära fragmentet och få mindre bitar. Skär vid behov de återstående bitarna manuellt med en skalpell tills vävnaden är helt splittrad.
- Överför den fragmenterade vävnaden till en rutad petriskål fylld med 7 ml matsmältningsmedium (odlingsmedium [McCoys 5A-medium, 3 mmol / L glutamin, 0,1% HSA, 30 μg / ml penicillin G, 50 μg / ml streptomycin, 2,5 μg / ml transferrin, 4 ng / ml selen och 50 μg / ml askorbinsyra] kompletterat med 0,2% kollagenas och 0,02% DNas).
- Sätt skålen i inkubatorn vid 5% CO2 och 37 ° C. Var 10: e minut, ta petriskålen ur inkubatorn och spola vävnaden genom att pipettera upp och ner med en 1 ml pipett.
- Efter 45 minuters inkubation i matsmältningsmediet, placera skålen under ett stereomikroskop med ett förstoringsområde på 5x-6,3x och hämta folliklarna med en mikrokapillärpipett. Välj folliklarna av intresse och isolera dem genom att suga upp dem med en munpipett.
OBS: Munpipettering bör utföras försiktigt för att undvika förlust av material i röret och kontaminering. - Om folliklarna förblir fast i en bit cortex, isolera dem mekaniskt med två 27 G sprutor genom att riva av cortex med sprutans spets för att frigöra folliklar från stroma.
OBS: Rör inte folliklarna med sprutorna för att undvika att skada dem. - Överför folliklarna med mikrokapillären i en 4-brunnsplatta innehållande droppar på 15 μL av det kalibrerade odlingsmediet täckt av 500 μL oljekultur (1 till 10 folliklar per droppe). Detta steg upprätthåller follikelns livskraft under insamlingsprocessen. Vid slutet av proceduren sköljs folliklarna två gånger i 5 s varje gång i två droppar 15 μL fosfatbuffrad saltlösning (PBS) täckt av 500 μL oljekultur (på is).
- Samla 20 folliklar med en minimal mängd PBS med hjälp av munpipetten (max 10 μL) i ett tomt rör och håll röret på is.
OBS: För RNA-stabilitet är det viktigt att utföra steg 2.8 och steg 2.9 på is. Cirka 20 folliklar (<75 μm) behövs för att ha tillräckligt med RNA för standard RT-qPCR (SYBR Green). - Efter högst 90 minuters inkubation i matsmältningsmediet, stoppa den enzymatiska reaktionen genom att i petriskålen tillsätta ett överskott av kall (4 °C) blockerande lösning (7,5 ml) bestående av odlingsmedium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS).
OBS: Den blockerande lösningen kan tillsättas så snart experimenten observerar folliklar som fastnar på plattan eller skadade folliklar (asymmetrisk form eller mörkare färgade folliklar). Det rekommenderas att utföra follikelisolering inom en maximal period av 2,5 timmar för att undvika follikelskador och att utföra RNA-extraktion omedelbart efter isolering.
3. RNA-extraktion
OBS: RNA-extraktion utförs enligt instruktionerna som medföljer ett RNA-extraktionskit genom att justera elueringsvolymerna.
- Suspendera de isolerade folliklarna genom att tillsätta 100 μl av lyslösningen som medföljer RNA-extraktionssatsen till röret som innehåller folliklarna under en kemisk huva och virvel med hög hastighet (2 500 rpm/min) för att bryta folliklarnas struktur. Tillsätt 50 μL etanol (100%) till röret och virvla kort med hög hastighet.
OBS: Eftersom lysbufferten innehåller 2-merkaptoetanol och tiocyansyra måste detta steg utföras med försiktighet under en kemisk huva. - Överför rörets totala volym (ca 160 μl) till en mikrofilterpatron bestående av en kolonn och ett uppsamlingsrör och centrifugera den i 10 s vid 16 363 x g vid 4 °C. Tvätta kolonnen med 180 μl tvättlösning 1, medföljer satsen, och centrifugera röret i 10 s vid 16 363 x g vid 4 °C.
- Tillsätt 180 μl tvättlösning 2/3, medföljer satsen, till kolonnen och centrifugera i 10 s vid 16,363 x g vid 4 °C. Utför det här steget två gånger. Centrifugera röret en sista gång i 1 minut för att torka filtret och placera ett nytt uppsamlingsrör under patronen.
- Utför elueringen av nukleinsyrorna i två steg:
- Tillsätt först 8 μl varm elueringslösning (75 °C) till filtret, vänta i 1 min vid rumstemperatur och centrifugera i 30 s vid 16,363 x g vid 4 °C.
- Upprepa detta steg med 7 μl elueringslösning.
OBS: Röret som innehåller de eluerade nukleinsyrorna måste hållas på is. För att undvika DNA-kontaminering rekommenderas starkt ett kompletterande steg av DNA-nedbrytning - steg 3.5.
- Inkubera röret med 2 IE DNas och 1x DNas-buffert i 20 min vid 37 °C. Blockera den enzymatiska aktiviteten med 1/10 DNas-inaktiveringsreagens i 2 minuter vid rumstemperatur.
- Centrifugera röret i 1,5 min vid 16 363 x g vid 4 °C. Slutligen samla suspensionen innehållande RNA och överför den till ett nytt rör.
- Bedöm mängden RNA som finns i provet med hjälp av en spektrofotometer (NanoDrop 2000-programvara > nukleinsyra > RNA). Använd 1 μl elueringslösning som blindprov och mät RNA-mängden extraherad från isolerade folliklar med 1 μl lösning.
- Kontrollera förhållandet 260/280 för RNA-renhet (cirka 2,0). Förvara provet vid −80 °C eller retrotranskribera det direkt för att utföra RT-qPCR.
OBS: För att bedöma RNA-integriteten kan provet bearbetas med ett högupplöst automatiserat elektroforessystem före eller efter frysning vid −80 °C. I detta arbete, efter retrotranskription, utfördes RT-qPCR med följande cykel:
Håll scenen med 20 s vid 50 °C och 10 min vid 95 °C
40 PCR-cykler med 15 s vid 95 °C och 1 min vid 60 °C
Smältkurvsteg med 15 s vid 95 °C, 1 min vid 60 °C, 30 s vid 95 °C och 15 s vid 60 °C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av denna isoleringsprocedur kan experimenten hämta folliklar från stromalmiljön för att utföra specifika genuttrycksanalyser. Baserat på folliklarnas storlek och morfologi är det möjligt att differentiera de olika stadierna av follikulogenes. Experimenten kan välja folliklar av intresse beroende på deras storlek med hjälp av en anpassad mikrokapillärpipett. Genom att använda en mikrokapillär på maximalt 75 μm är det möjligt att urskilja primordiala och primära folliklar från sekundära, antrala och mogna folliklar. Dessutom kan experimenten bekräfta follikelstadiet enligt follikelmorfologin. Vid studier av follikelaktivering väljs vilande och primära folliklar, och cirka 20 folliklar behövs för att nå en RNA-koncentration på cirka 5 ng / μL.
Två homogeniserade äggstocksfragment (4 mm x 2 mm x 1 mm) från samma patient bearbetades för att isolera folliklar med hjälp av detta protokoll (figur 2). Efter en 1,5 h isoleringsprocedur hämtades två populationer av folliklar enligt utvecklingsstadierna för att jämföra RNA-kvantiteten och för att belysa relevansen av follikelval: 20 folliklar på <75 μm (rör 1) och 15 folliklar på <200 μm (rör 2). Därefter utfördes RNA-extraktion och 4,8 ng / μL totalt RNA från rör 1 och 10,5 ng / μL totalt RNA från rör 2 erhölls med användning av en spektrofotometer för kvantifiering (tabell 1). Med hjälp av detta mikrovolymspektrofotometersystem mättes också förhållandet 260/280 för att bedöma RNA-renheten. Detta förhållande återspeglar den potentiella kontamineringen av protein eller andra reagens under extraktionen och måste vara nära 2,0 för RNA-prover. Förhållandena 260/280 var 1,89 och 1,74 i rör 1 respektive rör 2, vilket validerade provernas renhet (tabell 1). RNA-kvaliteten verifierades sedan genom att bearbeta proverna med högupplöst automatiserad elektrofores. Efter denna procedur uppskattades RNA-integritetsnumret (RIN). RIN-värdet, från 1 (nedbrutet) till 10 (intakt), återspeglar nedbrytningsnivån av RNA i ett prov. RIN-värdena var 7,1 och 7,9 i rör 1 respektive rör 2, vilket validerade kvaliteten på RNA från våra prover (tabell 1). För att utföra en RT-qPCR transkriberades den totala volymen extraherat RNA först till cDNA. Därefter tillsattes 1,25 ng cDNA per brunn på en 96-brunnsplatta, med primers för hushållning och målgener (hypoxantin-guaninfosforibosyltransferas [HPRT], Kit Ligand [KL] och tillväxtdifferentieringsfaktor 9 [GDF9]) och SYBR Green mastermix17,18. Efter att ha kört en standardcykel på ett PCR-system i realtid var tröskelvärdena för cykeln (Ct) 30,87 (rör 1) och 29,56 (rör 2) för HPRT, 33,5 (rör 1) och 31,77 (rör 2) för KL och 30,71 (rör 1) och 30,57 (rör 2) för GDF9 (tabell 1).
Figur 1: Schematisk representation av metoden för bedömning av RNA-extraktion från isolerade humana äggstocksfolliklar. Tre steg beskrivs i detta manuskript: vävnadsupptining, isoleringsproceduren, inklusive mekanisk och enzymatisk bearbetning, och RNA-extraktion från folliklarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Insamlade folliklar enligt isoleringsprotokollet . (A) Upptinad kortikal vävnad. (B) Tissue Shecker och (C) tissue chopper som används för att fragmentera vävnaden. (D–E) Bilder av hämtade isolerade folliklar observerade med ett stereomikroskop med ett 10x okular och ett brett zoomområde (1x-6.3x); Förstoringsinställningar på 50x-63x användes för identifiering av primordiala och primära folliklar. Skalstänger: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Rör | Antal folliklar | Folliklar storlek (μm) | RNA-koncentration (ng/μl) | 260/280-förhållande | RNA-integritetsnummer (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabell 1: Renhets-, RIN- och cykeltröskelvärden för två homogeniserade äggstocksfragment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryokonservering av äggstocksvävnad är ett lovande tillvägagångssätt för att bevara fertiliteten hos cancerpatienter. På kliniken ympas tinad kortikal vävnad tillbaka in i patienten efter remission, vilket möjliggör återupptagande av äggstocksfunktion och fertilitet19,20. Förutom klinisk användning kan kvarvarande äggstocksfragment också doneras för forskning i slutet av lagringsperioden för att studera mekanismerna som reglerar follikulogenes. Dessutom är denna vävnad särskilt användbar för att utveckla alternativ till ympning när det inte är möjligt, såsom in vitro-odlingssystem eller konstgjorda äggstockar. Variationer både inom och mellan patienter begränsar dock experimentens genomförbarhet och reproducerbarhet och tolkningen av resultaten. Faktum är att follikeldensiteten minskar dramatiskt med åldern, och folliklar är inte jämnt fördelade mellan fragment21. Eftersom antalet tillgängliga fragment är begränsat måste mänsklig vävnad användas med avancerad teknik. Ett brett spektrum av tekniker såsom immunohistokemi och immunofluorescens, såväl som in situ-hybridisering, kan utföras på fast vävnad för att bedöma protein- och genlokalisering 3,18. För att studera de molekylära mekanismerna som reglerar follikulogenes inom äggstockens funktionella enheter vid olika utvecklingsstadier krävs isolering av folliklar.
Flera studier har undersökt effektiva metoder för att separera folliklar från den omgivande vävnaden hos människor och djurarter22. Antalet folliklar som hämtas och kvaliteten på RNA efter extraktion kan variera beroende på vilka tekniker som används. För att studera follikelaktivering (dvs. primordiala och primära folliklar) behövs minst 20 poolade folliklar för att utföra standard RT-qPCR. Genom att använda alternativa metoder som RNA- eller cDNA-amplifiering eller kapslad PCR är det möjligt att arbeta med färre folliklar23,24.
Den täta naturen hos äggstocksbarken gör follikelisolering utmanande, vilket har lett till användningen av metoder som involverar en kombination av enzymatisk och mekanisk isolering25. Olika typer av enzymer kan användas, såsom kollagenas och DNas26. Studier har dock rapporterat follikelskador efter enzymatisk matsmältning, vilket påverkar ytterligare in vitro-utveckling 27,28. För att upprätthålla follikelintegriteten använder flera team för närvarande anpassade enzymatiska matsmältningsprotokoll eller utför endast mekanisk isolering för efterföljande follikelkultur 25,29,30,31. Detta manuskript rapporterar en enkel och effektiv metod för att erhålla isolerade folliklar för kvantitativ PCR-analys. Ändå kräver alla experiment en inlärningskurva innan de når optimala resultat.
För grundläggande forskningsändamål utvecklades en revidering av ett tidigare protokoll för att hämta en stor mängd folliklar utan att påverka deras integritet13. Bearbetningen för genuttrycksanalys utförs direkt efter isolering för att optimera RNA-kvaliteten. Det är också viktigt att undvika långvarig matsmältning för att begränsa risken för att välja degenererade folliklar. Således förblir matsmältningssteget avgörande i detta protokoll. Tre punkter kräver särskild uppmärksamhet: (1) spolning av vävnaden under den enzymatiska reaktionen var 10: e minut för att ge homogen enzymverkan; (2) kontrollen av follikelintegriteten genom att välja friska folliklar under proceduren och stoppa reaktionen med blockerande lösning så snart skada observeras; (3) anpassning av kollagenaskoncentrationen, eftersom vävnadsstyvheten kan variera mellan patienter beroende på ålder. Koncentrationen av kollagenas kan minskas (till 0,12 %) i vissa fall för att förhindra skador (dvs. hos prepubertala patienter)32.
I den sista delen av detta protokoll utfördes RNA-extraktion från isolerade folliklar enligt anpassade instruktioner. Detta möjliggör ett brett spektrum av experiment, såsom RT-qPCR eller RNA-sekvensering, vilket ger grundläggande information om olika cellulära processer som är specifika för oocyt- och granulosaceller. Många protokoll och kit finns tillgängliga för att extrahera RNA från vävnad. Vi har här rapporterat en effektiv teknik som används i vårt laboratorium som möjliggör extraktion av en tillräcklig mängd RNA för att utföra genuttrycksanalyser med RT-qPCR. Medan direkt RNA-extraktion rekommenderas starkt efter follikelisolering för att upprätthålla RNA-integritet, är det också möjligt att frysa de isolerade folliklarna vid -80 ° C om extraktionen inte kan utföras samma dag. RNA-kvantiteten kan variera beroende på folliklarnas storlek, och växande folliklar kan störa analysen om de slås samman med vilande folliklar. Urval baserat på storlek är extremt relevant, beroende på målen för studien, särskilt för det första steget i follikulogenesen. Differentieringen mellan primordiala och primära folliklar baserat endast på storlek är dock fortfarande utmanande när det gäller korrekt bedömning av primordiala follikelgenuttrycksnivåer. Valet av primordiala och primära folliklar kan utföras baserat på deras morfologi, men diskrimineringen mellan dem med ett stereomikroskop vid en förstoring av 63x är svår.
Sammanfattningsvis måste experimenten vara medveten om utmaningarna med follikelisolering och ta hänsyn till dem vid analys av resultaten. Viktiga parametrar måste beaktas, såsom (1) intra/inter-variationer i follikeltäthet mellan patienter; (2) follikelintegritet under follikelisolering; (3) differentiering mellan olika follikelstadier; och (4) RNA-stabilitet och integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inte några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett Excellence of Science (EOS) bidrag (ID: 30443682). I.D. är associerad forskare vid Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
