Summary
Burada, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan yumurtalık foliküllerinin dondurulmuş-çözülmüş kortikal dokudan nasıl izole edileceğini özetleyen bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Yumurtalık, farklı hücre tiplerinden oluşan heterojen bir organdır. Folikülogenez sırasında meydana gelen moleküler mekanizmaları incelemek için, proteinlerin lokalizasyonu ve gen ekspresyonu sabit doku üzerinde gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bir insan folikülündeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için, bu karmaşık ve hassas yapı izole edilmelidir. Bu nedenle, Woodruff'un laboratuvarı tarafından daha önce tarif edilen uyarlanmış bir protokol, folikülleri (oosit ve granüloza hücreleri) çevrelerinden ayırmak için geliştirilmiştir. Yumurtalık kortikal dokusu ilk önce iki araç kullanılarak küçük parçalar elde etmek için manuel olarak işlenir: bir doku dilimleyici ve bir doku doğrayıcı. Doku daha sonra en az 40 dakika boyunca% 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile enzimatik olarak sindirilir. Bu çürütme adımı 37 °C ve %5 CO2'de gerçekleştirilir ve her 10 dakikada bir ortamın mekanik pipetlenmesi eşlik eder. İnkübasyondan sonra, izole edilmiş foliküller, mikroskop büyütme altında kalibre edilmiş bir mikrokapiller pipet kullanılarak manuel olarak toplanır. Doku parçalarında foliküller hala mevcutsa, prosedür manuel mikrodiseksiyon ile tamamlanır. Foliküller bir kültür ortamında buz üzerinde toplanır ve fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi damlacıkları içinde iki kez durulanır. Bu sindirim prosedürü, folikül bozulmasını önlemek için dikkatlice kontrol edilmelidir. Foliküllerin yapısı tehlikeye girer girmez veya maksimum 90 dakika sonra, reaksiyon% 10 fetal sığır serumu içeren 4 ° C'lik bir bloke edici çözelti ile durdurulur. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) için RNA ekstraksiyonundan sonra yeterli miktarda toplam RNA elde etmek için en az 20 izole folikül (75 μm'nin altında boyutlu) toplanmalıdır. Ekstraksiyondan sonra, 20 folikülden toplam RNA'nın miktarının belirlenmesi ortalama 5 ng / μL'lik bir değere ulaşır. Toplam RNA daha sonra cDNA'ya retrokribe edilir ve ilgilenilen genler RT-qPCR kullanılarak daha fazla analiz edilir.
Introduction
Yumurtalık, korteks ve stroma içindeki foliküller de dahil olmak üzere fonksiyonel ve yapısal birimlerden oluşan karmaşık bir organdır. Folikülogenez, folikül aktivasyonu, büyümesi ve olgunlaşması süreci, ilkel sessiz bir durumdan döllenebilen ve erken embriyonik gelişimi destekleyen olgun bir foliküle kadar, araştırma1'de yaygın olarak incelenmiştir. Bu fenomeni yönlendiren mekanizmaların çözülmesi, kadınlar için doğurganlık bakımını iyileştirebilir2. Sabit insan dokusu üzerinde yapılan analizler, yumurtalığın fonksiyonel birimleri içinde protein ekspresyonunun ve gen lokalizasyonunun değerlendirilmesine izin verir 3,4. Bununla birlikte, yumurtalık folikülleri içindeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için folikülleri çevreleyen korteksten ayırmak için spesifik tekniklere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, önceki bir çalışmada, gen ekspresyonunun doğrudan yumurtalık fonksiyonel biriminden analiz edilmesine izin vermek için bir folikül izolasyon tekniği geliştirilmiştir5. Enzimatik sindirim ve / veya mekanik izolasyonun yanı sıra lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi, bir doku parçası 6,7,8,9 içinde folikül izolasyonuna izin veren farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Folikül izolasyonu, gelişimin her aşamasında foliküllerin gen ekspresyon profillerini değerlendirmek için insan veya hayvan yumurtalık dokusu ile yaygın olarak kullanılmaktadır10,11,12. Bununla birlikte, optimal bir izolasyon prosedürü, folikülün yoğun korteks içindeki kırılgan yapısını dikkate almalı ve bu nedenle herhangi bir hasarı önlemek için dikkatle yapılmalıdır7. Bu makale, Woodruff'un laboratuvarı tarafından tanımlanan bir protokolden uyarlanmış, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan foliküllerini dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık korteksinden izole etmek için bir prosedürü açıklamaktadır13.
Dondurulmuş insan dokusundan yumurtalık folikülü izolasyonunun ilk adımı çözme işlemidir. Bu işlem, daha önce tarif edildiği gibi, kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun greftlenmesi için kullanılan klinik protokole dayanarak gerçekleştirilir14,15. İşlem, ortamın azalan konsantrasyonlarında yumurtalık korteksi durulayarak kriyoprotektan ajanların uzaklaştırılmasını amaçlamaktadır. Daha sonra, folikülleri almak için enzimatik ve mekanik izolasyondan önce doku parçalanır. Farklı aşamalardaki foliküller, ilgilenenleri izole etmek için yüksek büyütmeli ve kaliteli optiklere sahip bir stereomikroskop kullanılarak ayırt edilebilir. İzole edilen her folikül, mikroskopa entegre edilmiş bir cetvel kullanılarak ölçülür ve foliküller gelişim aşamalarına göre toplanabilir: ilkel foliküller (30 μm), birincil foliküller (60 μm), ikincil foliküller (120-200 μm) ve antral foliküller (>200 μm)16. Foliküllerin morfolojisine göre daha ileri sınıflandırma yapılabilir: primordiyal foliküller bir kat düzleştirilmiş granüloza hücresine (GC) sahiptir, primer foliküller bir kat küboidal GC'ye sahiptir, ikincil foliküller en az iki kat küboidal GC'ye sahiptir ve GC'ler arasında bir boşluğun varlığı antral aşamayı karakterize eder. İlgilenilen foliküller seçildiğinde, RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilir. RNA miktarı ve kalitesi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonundan (RT-qPCR) önce değerlendirilir (Şekil 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu proje Erasme Hastanesi Etik Kurulu (Brüksel, Belçika) tarafından onaylanmıştır. Bu protokole dahil edilen hastaya 2000 yılında kemoterapiye maruz kalmadan önce fertilitenin korunması için yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu (OTC) uygulandı. Hasta, kalan dondurulmuş dokusunu depolama süresinin sonunda araştırmaya bağışlamak için bilgilendirilmiş yazılı onay imzaladı.
1. Kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun çözülmesi
- Beş çözme çözeltisi içeren 6 delikli bir plaka hazırlayın. İlk kuyu, Leibovitz-15 besiyeri, 0.1 mol / L sakaroz, 1.5 mol / L dimetil sülfoksit (DMSO) ve% 1 insan serum albümininden (HSA) oluşan 5 mL kriyoprotektan çözeltisi içerir. Bir sonraki kuyucuklar, azalan kriyoprotektan konsantrasyonlarına sahip 5 mL Leibovitz-15 ortamı içerir: 1 mol / L, 0.5 mol / L ve 2 x 0 mol / L DMSO.
NOT: Kriyoprotektan çözeltisi, doğurganlık kliniğinde kullanılan protokole göre farklılık gösterebilir. - Yumurtalık kortikal parçası içeren bir şişeyi güvenlik kurallarına (kriyojenik eldivenler, koruyucu gözlükler ve kapalı ayakkabılar) uygun olarak sıvı azottan çıkarın ve tüpü 30 sn boyunca oda sıcaklığında (RT) tutun.
- Flakonu dikey bir davlumbazın altında açmadan ve doğrudan 6 delikli plakanın ilk kuyucuğuna (buz üzerinde) aktarmadan önce şişeyi RT'de 2 dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın.
- Parçayı art arda 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna aktarın, her biri 5 mL Leibovitz-15 ortamında azalan kriyoprotektan konsantrasyonları içerir. Her ortamdaki dokuyu 5 dakika boyunca (buz üzerinde) hafifçe çalkalayın.
2. Folikül izolasyonu
NOT: Tüm deneyler RNase içermeyen malzemeler kullanılarak ve dikey bir başlık altında gerçekleştirilir.
- Çözülmüş dokuyu 10 mL diseksiyon ortamı (Leibovitz-15 ortamı, sodyum piruvat [2 mmol / L], L-glutamin [2 mmol / L], HSA [% 0.3], penisilin G [30 μg / mL] ve streptomisin [50 μg / mL]) ile doldurulmuş 2 mm'lik ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Gerekirse dokunun boyutunu bir neşterle ayarlayın.
NOT: Klinik protokole bağlı olarak, dondurulmuş dokunun boyutu 8 mm x 4 mm x 1 mm ila 4 mm x 2 mm x 1 mm arasında değişebilir. Bu protokol için 4 mm x 2 mm x 1 mm'lik iki şerit kullanılmıştır. - Doku dilimleyicinin üç parçasını yığın, parçayı iki blok arasına koyun ve parçayı bir bıçak kullanarak ikiye bölün, 0,5 mm kalınlığında iki parça elde etmek için bloklar arasında kaydırın.
- Parçayı kesmek ve daha küçük parçalar elde etmek için doku doğrayıcıyı kullanın. Gerekirse, doku tamamen parçalanana kadar kalan parçaları bir neşterle manuel olarak kesin.
- Parçalanmış dokuyu, % 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile desteklenmiş 7 mL sindirim ortamı (kültür ortamı [McCoy'un 5A ortamı, 3 mmol / L glutamin,% 0.1 HSA, 30 μg / mL penisilin G, 50 μg / mL streptomisin, 2.5 μg / mL transferrin, 4 ng / mL selenyum ve 50 μg / mL askorbik asit] ile doldurulmuş ızgaralı bir Petri kabına aktarın).
- Çanağı inkübatöre% 5 CO2 ve 37 ° C'de koyun. Her 10 dakikada bir, Petri kabını inkübatörden çıkarın ve 1 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu yıkayın.
- Sindirim ortamında 45 dakikalık inkübasyondan sonra, çanağı 5x-6.3x büyütme aralığına sahip bir stereomikroskop altına yerleştirin ve bir mikrokapiler pipet kullanarak folikülleri alın. İlgilendiğiniz folikülleri seçin ve bir ağız pipeti ile emerek izole edin.
NOT: Ağız pipetlemesi, boruya malzeme kaybını ve kontaminasyonu önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. - Foliküller bir korteks parçasında sıkışıp kalırsa, folikülleri stromadan serbest bırakmak için korteksi şırıngaların ucuyla sökerek iki 27 G şırınga ile mekanik olarak izole edin.
NOT: Zarar görmemesi için foliküllere şırıngalarla dokunmayın. - Folikülleri, mikrokapiler ile, 500 μL yağ kültürü (damla başına 1 ila 10 folikül) ile kaplanmış kalibre edilmiş kültür ortamının 15 μL'lik damlalarını içeren 4 delikli bir plakaya aktarın. Bu adım, toplama işlemi sırasında folikül canlılığını korur. İşlemin sonunda, folikülleri her seferinde 5 s boyunca iki kez durulayın, 500 μL yağ kültürü (buz üzerinde) ile kaplanmış iki damla 15 μL fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) halinde durulayın.
- Boş bir tüpte ağız pipetini (maksimum 10 μL) kullanarak minimum miktarda PBS ile 20 folikül toplayın ve tüpü buz üzerinde tutun.
NOT: RNA kararlılığı için, adım 2.8 ve adım 2.9'u buz üzerinde gerçekleştirmek çok önemlidir. Standart RT-qPCR (SYBR Green) için yeterli RNA'ya sahip olmak için yaklaşık 20 folikül (<75 μm) gereklidir. - Sindirim ortamında maksimum 90 dakikalık inkübasyondan sonra, Petri kabına% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş kültür ortamından oluşan fazla miktarda soğuk (4 ° C) bloke edici çözelti (7.5 mL) ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
NOT: Bloke edici çözelti, deneyci plakaya yapışan folikülleri veya hasarlı folikülleri (asimetrik şekil veya daha koyu renkli foliküller) gözlemlediği anda eklenebilir. Foliküler hasarı önlemek ve izolasyondan hemen sonra RNA ekstraksiyonu yapmak için folikül izolasyonunun maksimum 2.5 saatlik bir süre içinde yapılması önerilir.
3. RNA ekstraksiyonu
NOT: RNA ekstraksiyonu, bir RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen talimatları izleyerek, elüsyon hacimlerini uyarlayarak gerçekleştirilir.
- RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen lizis çözeltisinin 100 μL'sini, folikülleri içeren tüpe kimyasal bir başlık altında ekleyerek izole edilmiş folikülleri askıya alın ve foliküllerin yapısını kırmak için yüksek hızda (2.500 rpm / dak) vorteks yapın. Tüpe 50 μL etanol (% 100) ekleyin ve kısa bir süre yüksek hızda vorteks yapın.
NOT: Lizis tamponu 2-merkaptoetanol ve tiyosiyanik asit içerdiğinden, bu adım kimyasal bir başlık altında dikkatle gerçekleştirilmelidir. - Tüpün toplam hacmini (yaklaşık 160 μL) bir sütun ve bir toplama tüpünden oluşan bir mikrofiltre kartuşu tertibatına aktarın ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj edin. Kolonu, kit ile birlikte verilen 180 μL yıkama çözeltisi 1 ile yıkayın ve tüpü 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj edin.
- Kolona kit ile birlikte verilen 180 μL 2/3 yıkama çözeltisini ekleyin ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj yapın. Bu adımı iki kez gerçekleştirin. Filtreyi kurutmak için tüpü 1 dakika boyunca son bir kez santrifüj edin ve kartuşun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin.
- Nükleik asitlerin elüsyonunu iki adımda gerçekleştirin:
- İlk olarak, filtreye 8 μL ılık elüsyon çözeltisi (75 ° C) ekleyin, RT'de 1 dakika bekleyin ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 30 s santrifüj yapın.
- Bu adımı 7 μL elüsyon çözeltisi ile tekrarlayın.
NOT: Salınan nükleik asitleri içeren tüp buz üzerinde tutulmalıdır. DNA kontaminasyonunu önlemek için, DNA yıkımının ek bir adımı şiddetle tavsiye edilir-adım 3.5.
- Tüpü 2 IU DNaz ve 1x DNaz tamponu ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. RT'de 2 dakika boyunca 1/10 DNaz inaktivasyon reaktifi ile enzimatik aktiviteyi bloke edin.
- Tüpü 4 °C'de 16.363 x g'de 1,5 dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, RNA'yı içeren süspansiyonu toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
- Bir spektrofotometre (NanoDrop 2000 yazılımı > Nükleik Asit > RNA) kullanarak numunede bulunan RNA miktarını değerlendirin. Boş olarak 1 μL elüsyon çözeltisi kullanın ve izole foliküllerden ekstrakte edilen RNA miktarını 1 μL çözelti ile ölçün.
- RNA saflığı için 260/280 oranını kontrol edin (yaklaşık 2.0). Numuneyi −80 °C'de saklayın veya RT-qPCR gerçekleştirmek için doğrudan geriye dönük olarak transkripte edin.
NOT: RNA bütünlüğünü değerlendirmek için, numune -80 ° C'de donmadan önce veya sonra yüksek çözünürlüklü otomatik bir elektroforez sistemi ile işlenebilir. Bu çalışmada retrotranskripsiyonu takiben RT-qPCR aşağıdaki siklus ile uygulanmıştır:
Sahneyi 50 °C'de 20 sn ve 95 °C'de 10 dakika ile tutun
95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 1 dakika ile 40 PCR döngüsü
95 °C'de 15 sn, 60 °C'de 1 dakika, 95 °C'de 30 s ve 60 °C'de 15 s ile erime eğrisi aşaması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu izolasyon prosedürünü kullanarak, deneyci spesifik gen ekspresyon analizleri yapmak için stromal ortamdan folikülleri alabilir. Foliküllerin büyüklüğüne ve morfolojisine dayanarak, folikülogenezin farklı aşamalarını ayırt etmek mümkündür. Deneyci, uyarlanmış bir mikrokapiler pipet kullanarak ilgilendiği folikülleri boyutlarına göre seçebilir. Maksimum 75 μm'lik bir mikrokapiller kullanarak, primordial ve primer folikülleri ikincil, antral ve matür foliküllerden ayırmak mümkündür. Ayrıca, deneyci folikül morfolojisine göre folikül aşamasını doğrulayabilir. Folikül aktivasyonunu incelerken, sessiz ve birincil foliküller seçilir ve yaklaşık 5 ng / μL'lik bir RNA konsantrasyonuna ulaşmak için yaklaşık 20 foliküle ihtiyaç vardır.
Aynı hastadan alınan iki homojenize yumurtalık fragmanı (4 mm x 2 mm x 1 mm) bu protokol kullanılarak foliküllerin izolatılması için işlendi (Şekil 2). 1.5 saatlik bir izolasyon prosedüründen sonra, RNA miktarını karşılaştırmak ve folikül seçiminin alaka düzeyini vurgulamak için gelişim aşamalarına göre iki folikül popülasyonu alındı: <75 μm'lik 20 folikül (tüp 1) ve <200 μm'lik 15 folikül (tüp 2). Daha sonra RNA ekstraksiyonu yapıldı ve tüp 1'den 4.8 ng/μL toplam RNA ve tüp 2'den 10.5 ng/μL toplam RNA, niceleme için bir spektrofotometre kullanılarak elde edildi (Tablo 1). Bu mikrohacim spektrofotometre sistemi kullanılarak, RNA saflığını değerlendirmek için 260/280 oranı da ölçüldü. Bu oran, ekstraksiyon sırasında protein veya diğer reaktifler tarafından potansiyel kontaminasyonu yansıtır ve RNA örnekleri için 2.0'a yakın olmalıdır. 260/280 oranları, numunelerin saflığını doğrulayan tüp 1 ve tüp 2'de sırasıyla 1.89 ve 1.74 idi (Tablo 1). RNA kalitesi daha sonra numunelerin yüksek çözünürlüklü otomatik elektroforez ile işlenmesiyle doğrulandı. Bu prosedürü takiben, RNA bütünlük numarası (RIN) tahmin edildi. RIN değeri, 1 (bozunmuş) ila 10 (bozulmamış) arasında, bir numunedeki RNA'nın bozunma seviyesini yansıtır. RIN değerleri, tüp 1 ve tüp 2'de sırasıyla 7.1 ve 7.9 idi ve RNA'nın kalitesini örneklerimizden doğruladı (Tablo 1). Bir RT-qPCR gerçekleştirmek için, ekstrakte edilen RNA'nın toplam hacmi ilk önce cDNA'ya retrokribe edildi. Daha sonra, 96 delikli bir plaka üzerine kuyu başına 1.25 ng cDNA, temizlik ve hedef genler için primerler (Hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz [HPRT], Kit Ligand [KL] ve Büyüme Farklılaşma Faktörü 9 [GDF9]) ve SYBR Green master karışımı17,18 ile birlikte eklendi. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde standart bir döngü çalıştırdıktan sonra, elde edilen döngü eşikleri (Ct), HPRT için 30.87 (tüp 1) ve 29.56 (tüp 2), KL için 33.5 (tüp 1) ve 31.77 (tüp 2) ve GDF9 için 30.71 (tüp 1) ve 30.57 (tüp 2) idi (Tablo 1).
Şekil 1: İzole insan yumurtalık foliküllerinden RNA ekstraksiyonunu değerlendirme yönteminin şematik gösterimi. Bu makalede üç adım anlatılmaktadır: doku çözme, mekanik ve enzimatik işleme dahil olmak üzere izolasyon prosedürü ve foliküllerden RNA ekstraksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İzolasyon protokolünü takiben toplanan foliküller. (A) Çözülmüş kortikal doku. (B) Dokuyu parçalamak için kullanılan doku dilimleyici ve (C) doku doğrayıcı. (D-E) 10x göz merceği ve geniş bir yakınlaştırma aralığına (1x-6.3x) sahip bir stereomikroskopla gözlenen alınan izole foliküllerin görüntüleri; Primerdiyal ve primer foliküllerin tanımlanması için 50x-63x büyütme ayarları kullanıldı. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Tüp | Folikül sayısı | Folikül boyutu (μm) | RNA konsantrasyonu (ng/μL) | 260/280 oran | RNA Bütünlük Numarası (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tablo 1: İki homojenize yumurtalık parçasının saflığı, RIN ve döngü eşikleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yumurtalık dokusunun kriyoprezervasyonu, kanser hastalarının fertilitesini korumak için umut verici bir yaklaşımdır. Klinikte, çözülmüş kortikal doku remisyon sonrası hastaya tekrar aşılanır ve yumurtalık fonksiyonunun ve doğurganlığın yeniden başlamasına izin verir19,20. Klinik kullanımın yanı sıra, folikülogenezi düzenleyen mekanizmaları incelemek için depolama süresinin sonunda araştırma için artık yumurtalık fragmanları da bağışlanabilir. Dahası, bu doku, in vitro kültür sistemleri veya yapay yumurtalıklar gibi mümkün olmadığında aşılamaya alternatifler geliştirmek için özellikle yararlıdır. Bununla birlikte, hem hastalar içindeki hem de hastalar arasındaki farklılıklar, deneylerin fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini ve sonuçların yorumlanmasını sınırlar. Gerçekten de, foliküler yoğunluk yaşla birlikte önemli ölçüde azalır ve foliküller fragmanlar21 arasında eşit olarak dağılmaz. Mevcut parçaların sayısı sınırlı olduğundan, insan dokusunun en yeni tekniklerle kullanılması gerekir. İmmünohistokimya ve immünofloresan gibi çok çeşitli tekniklerin yanı sıra in situ hibridizasyon, protein ve gen lokalizasyonunu değerlendirmek için sabit doku üzerinde uygulanabilir 3,18. Gelişimin farklı aşamalarında yumurtalığın fonksiyonel birimleri içindeki folikülogenezi düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için, foliküllerin izolasyonu gereklidir.
Birçok çalışma, insan ve hayvan türlerinde folikülleri çevreleyen dokudan ayırmak için etkili yöntemler araştırmıştır22. Ekstraksiyondan sonra alınan folikül sayısı ve RNA'nın kalitesi kullanılan tekniklere göre değişebilir. Folikül aktivasyonunu incelemek için (yani, primordial ve primer foliküller), standart RT-qPCR gerçekleştirmek için en az 20 havuzlanmış folikül gereklidir. RNA veya cDNA amplifikasyonu veya iç içe PCR gibi alternatif yöntemler kullanılarakdaha az folikül 23,24 ile çalışmak mümkündür.
Yumurtalık korteksinin yoğun doğası, folikül izolasyonunu zorlaştırır, bu da enzimatik ve mekanik izolasyonun bir kombinasyonunu içeren yöntemlerin kullanılmasına yol açmıştır25. Kollajenaz ve DNaz26 gibi farklı enzim türleri kullanılabilir. Bununla birlikte, çalışmalar enzimatik sindirimi takiben folikül hasarı bildirmiştir ve in vitro gelişimi daha da etkilemektedir27,28. Folikül bütünlüğünü korumak için, birkaç ekip şu anda uyarlanmış enzimatik sindirim protokolleri kullanıyor veya sonraki foliküler kültür 25,29,30,31 için sadece mekanik izolasyon gerçekleştiriyor. Bu makalede, kantitatif PCR analizi için izole foliküllerin elde edilmesinde basit ve etkili bir yöntem sunulmaktadır. Bununla birlikte, tüm deneyler optimal sonuçlara ulaşmadan önce bir öğrenme eğrisi gerektirir.
Temel araştırma amaçları için, bütünlüklerini etkilemeden büyük miktarda folikül elde etmek için önceki bir protokolün revizyonu geliştirilmiştir13. Gen ekspresyon analizi için işleme, RNA kalitesini optimize etmek için izolasyonu takiben doğrudan gerçekleştirilir. Dejenere foliküllerin seçilme riskini sınırlamak için uzun süreli sindirimden kaçınmak da çok önemlidir. Bu nedenle, sindirim adımı bu protokolde çok önemli olmaya devam etmektedir. Üç nokta özel dikkat gerektirir: (1) homojen enzim etkisi sağlamak için enzimatik reaksiyon sırasında her 10 dakikada bir dokunun yıkanması; (2) İşlem sırasında sağlıklı foliküllerin seçilmesi ve hasar gözlenir gözlenmez bloke edici çözelti ile reaksiyonun durdurulması yoluyla folikül bütünlüğünün kontrolü; (3) Kollajenaz konsantrasyonunun adaptasyonu, çünkü doku sertliği hastalar arasında yaşa göre değişebilir. Kollajenaz konsantrasyonu, hasarı önlemek için bazı durumlarda (yani prepubertal hastalarda) azaltılabilir (% 0.12'ye)32.
Bu protokolün son bölümünde, izole foliküllerden RNA ekstraksiyonu, uyarlanmış talimatlar izlenerek gerçekleştirildi. Bu, RT-qPCR veya RNA dizilimi gibi çok çeşitli deneylere izin verir ve oosit ve granüloza hücrelerine özgü çeşitli hücresel süreçler hakkında temel bilgiler sağlar. RNA'yı dokudan çıkarmak için çok sayıda protokol ve kit mevcuttur. Burada, laboratuvarımızda kullanılan ve RT-qPCR ile gen ekspresyon analizleri yapmak için yeterli miktarda RNA'nın ekstraksiyonuna izin veren etkili bir teknik sunulmuştur. RNA bütünlüğünü korumak için folikül izolasyonunu takiben doğrudan RNA ekstraksiyonu şiddetle tavsiye edilirken, ekstraksiyon aynı gün yapılamazsa, izole edilmiş foliküllerin -80 ° C'de dondurulması da mümkündür. RNA miktarı, foliküllerin boyutuna göre değişebilir ve büyüyen foliküller, sessiz foliküllerle birleştirilirse analize müdahale edebilir. Boyuta dayalı seçim, çalışmanın amaçlarına bağlı olarak, özellikle folikülogenezin ilk adımı için son derece önemlidir. Bununla birlikte, primordial ve primer foliküller arasındaki sadece boyuta dayalı ayrım, primordial folikül gen ekspresyon seviyelerinin doğru bir şekilde değerlendirilmesi açısından zor olmaya devam etmektedir. İlkel ve primer foliküllerin seçimi morfolojilerine göre yapılabilir, ancak 63x büyütmede stereomikroskopla aralarındaki ayrım zordur.
Sonuç olarak, deneyci folikül izolasyonunun zorluklarının farkında olmalı ve sonuçları analiz ederken bunları dikkate almalıdır. Önemli parametreler göz önünde bulundurulmalıdır, örneğin (1) hastalar arasındaki folikül yoğunluğundaki intra/inter-varyasyonlar; (2) folikül izolasyonu sırasında folikül bütünlüğü; (3) farklı folikül aşamaları arasında farklılaşma; ve (4) RNA kararlılığı ve bütünlüğü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma bir Bilim Mükemmelliği (EOS) hibesi (ID: 30443682) ile desteklenmiştir. I.D. Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique'de (FNRS) yardımcı araştırmacıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
