Summary
Her beskriver vi en protokoll som beskriver hvordan man isolerer humane eggstokkfollikler fra frosset-tint kortikalt vev for å utføre genuttrykksanalyser.
Abstract
Eggstokken er et heterogent organ sammensatt av forskjellige celletyper. For å studere molekylære mekanismer som forekommer under follikulogenese, kan lokalisering av proteiner og genuttrykk utføres på fast vev. For å kunne vurdere genuttrykksnivåer i en human follikkel, må denne komplekse og delikate strukturen isoleres. Derfor har en tilpasset protokoll tidligere beskrevet av Woodruffs laboratorium blitt utviklet for å skille follikler (oocytten og granulosacellene) fra omgivelsene. Det ovariekortikale vevet behandles først manuelt for å oppnå små fragmenter ved hjelp av to verktøy: en vevskutter og en vevshakker. Vevet blir deretter enzymatisk fordøyd med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase i minst 40 minutter. Dette fordøyelsestrinnet utføres ved 37 °C og 5 % CO2 og ledsages av mekanisk pipettering av mediet hvert 10. minutt. Etter inkubering oppsamles de isolerte folliklene manuelt ved hjelp av en kalibrert mikrokapillærpipette under mikroskopforstørrelse. Hvis follikler fortsatt er tilstede i vevsbitene, blir prosedyren fullført med manuell mikrodisseksjon. Folliklene samles på is i et kulturmedium og skylles to ganger i dråper av fosfatbufret saltoppløsning. Denne fordøyelsesprosedyren må kontrolleres nøye for å unngå follikelforringelse. Så snart strukturen i folliklene ser ut til å være kompromittert eller etter maksimalt 90 minutter, stoppes reaksjonen med en 4 °C blokkeringsløsning inneholdende 10% føtalt storfeserum. Minst 20 isolerte follikler (størrelse under 75 μm) bør samles for å oppnå en tilstrekkelig mengde totalt RNA etter RNA-ekstraksjon for sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR). Etter ekstraksjon når kvantifiseringen av totalt RNA fra 20 follikler en middelverdi på 5 ng / μL. Det totale RNA blir deretter retrotranskribert til cDNA, og genene av interesse analyseres videre ved hjelp av RT-qPCR.
Introduction
Eggstokken er et komplekst organ som består av funksjonelle og strukturelle enheter, inkludert folliklene i cortex og stroma. Follikulogenese, prosessen med follikelaktivering, vekst og modning fra en primordial hviletilstand til en moden follikkel som kan befruktes og støtte tidlig embryonal utvikling, er mye studert i forskning1. Å avdekke mekanismene som driver dette fenomenet, kan forbedre fruktbarhetsomsorgen for kvinner2. Analyser på fast humant vev tillater vurdering av proteinuttrykk og genlokalisering innenfor de funksjonelle enhetene i eggstokken 3,4. Imidlertid er det nødvendig med spesifikke teknikker for å dissosiere folliklene fra den omkringliggende cortex for nøyaktig å vurdere genuttrykksnivåer i eggstokkfolliklene. Derfor ble det i en tidligere studie utviklet en follikelisolasjonsteknikk for å tillate analyser av genuttrykk direkte fra den funksjonelle enheten i eggstokken5. Ulike tilnærminger har blitt utviklet, for eksempel enzymatisk fordøyelse og / eller mekanisk isolasjon, samt laserfangstmikrodisseksjon, som tillater follikelisolering i et stykke vev 6,7,8,9. Follikelisolering er mye brukt, enten med eggstokkvev fra mennesker eller dyr, for å evaluere genuttrykksprofilene til follikler i alle stadier av utvikling10,11,12. Imidlertid bør en optimal isolasjonsprosedyre ta hensyn til den skjøre strukturen av follikkelen i den tette cortex og bør derfor utføres med forsiktighet for å unngå skade7. Dette manuskriptet beskriver en prosedyre, tilpasset fra en protokoll beskrevet av Woodruffs laboratorium, for å isolere humane follikler fra frossen-tint ovarial cortex for å utføre genuttrykksanalyser13.
Det første trinnet med ovariefollikelisolasjon fra frosset humant vev er tineprosedyren. Denne prosessen utføres basert på den kliniske protokollen som brukes til poding av kryopreservert eggstokkvev, som tidligere beskrevet14,15. Prosessen tar sikte på å fjerne kryobeskyttelsesmidlene ved å skylle eggstokkbarken i synkende konsentrasjoner av mediet. Deretter fragmenteres vevet før enzymatisk og mekanisk isolasjon for å hente folliklene. Follikler på forskjellige stadier kan skilles ved hjelp av et stereomikroskop med høy forstørrelse og optikk av god kvalitet for å isolere de av interesse. Hver isolerte follikkel måles ved hjelp av en linjal integrert i mikroskopet, og folliklene kan samles i henhold til utviklingsstadiet: primordiale follikler (30 μm), primære follikler (60 μm), sekundære follikler (120-200 μm) og antralfollikler (>200 μm) 16. Ytterligere klassifisering kan utføres i henhold til folliklenes morfologi: primordiale follikler har ett lag flattede granulosaceller (GC), primære follikler har ett lag kuboidale GC, sekundære follikler har minst to lag kuboidale GC, og tilstedeværelsen av et hulrom blant GCene karakteriserer antralstadiet. Når follikler av interesse velges, utføres RNA-ekstraksjon. RNA-kvantitet og -kvalitet evalueres før sanntids kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR) (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette prosjektet ble godkjent av Erasme Hospital Ethical Committee (Brussel, Belgia). Pasienten inkludert i denne protokollen gjennomgikk nedfrysing av eggstokkvev (OTC) for fertilitetsbevaring før kjemoterapieksponering i 2000. Pasienten signerte informert skriftlig samtykke til å donere sitt gjenværende frosne vev til forskning ved slutten av lagringsperioden.
1. Tining av kryopreservert eggstokkvev
- Forbered en 6-brønnsplate som inneholder fem tineløsninger. Den første brønnen inneholder 5 ml kryobeskyttelsesmiddeloppløsning sammensatt av Leibovitz-15 medium, 0,1 mol/L sukrose, 1,5 mol/L dimetylsulfoksid (DMSO) og 1 % humant serumalbumin (HSA). De neste brønnene inneholder 5 ml Leibovitz-15 medium med avtagende konsentrasjoner av kryobeskyttelsesmiddel: 1 mol/L, 0,5 mol/L og 2 x 0 mol/L DMSO.
MERK: Den kryobeskyttelsesmiddeloppløsningen kan variere i henhold til protokollen som brukes i fertilitetsklinikken. - Fjern et hetteglass som inneholder et ovarialt kortikal fragment fra flytende nitrogen i samsvar med sikkerhetsregler (kryogene hansker, vernebriller og lukkede sko), og hold røret ved romtemperatur (RT) i 30 s.
- Bløtlegg hetteglasset i dobbeltdestillert vann i 2 minutter ved RT med forsiktig omrøring før hetteglasset åpnes under en vertikal hette og overføres direkte til den første brønnen på 6-brønnsplaten (på is).
- Overfør fragmentet suksessivt til hver brønn i 6-brønnplaten, med hver inneholdende konsentrasjoner av kryobeskyttelsesmiddel i 5 ml Leibovitz-15 medium. Rør vevet forsiktig i hvert medium i 5 minutter (på is).
2. Follikkel isolasjon
MERK: Alle eksperimenter utføres ved hjelp av RNase-frie materialer og under en vertikal hette.
- Overfør det tinte vevet til en 2 mm gridded petriskål fylt med 10 ml disseksjonsmedium (Leibovitz-15 medium, natriumpyruvat [2 mmol / L], L-glutamin [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicillin G [30 μg / ml] og streptomycin [50 μg / ml]). Juster størrelsen på vevet med en skalpell om nødvendig.
MERK: Avhengig av den kliniske protokollen kan størrelsen på det frosne vevet variere fra 8 mm x 4 mm x 1 mm til 4 mm x 2 mm x 1 mm. For denne protokollen ble det brukt to striper på 4 mm x 2 mm x 1 mm. - Hop opp de tre stykkene av vevskutteren, legg fragmentet mellom de to blokkene, og kutt fragmentet i to ved hjelp av et blad, skyv gjennom blokkene for å oppnå to fragmenter på 0,5 mm tykkelse.
- Bruk vevhakkeren til å kutte fragmentet og få mindre biter. Klipp om nødvendig de resterende bitene manuelt med en skalpell til vevet er helt knust.
- Overfør det fragmenterte vevet til en gridded petriskål fylt med 7 ml fordøyelsesmedium (kulturmedium [McCoys 5A-medium, 3 mmol / L glutamin, 0,1% HSA, 30 μg / ml penicillin G, 50 μg / ml streptomycin, 2,5 μg / ml transferrin, 4 ng / ml selen og 50 μg / ml askorbinsyre] supplert med 0,2% kollagenase og 0,02% DNase).
- Sett fatet i inkubatoren ved 5% CO2 og 37 ° C. Hvert 10. minutt tar petriskålen ut av inkubatoren og skyller vevet ved å pipetere opp og ned med en 1 ml pipette.
- Etter 45 min inkubasjon i fordøyelsesmediet, plasser parabolen under et stereomikroskop med et forstørrelsesområde på 5x-6,3x, og hent folliklene ved hjelp av en mikrokapillær pipette. Velg folliklene av interesse, og isoler dem ved å suge dem opp med en munnpipette.
MERK: Munnpipettering bør utføres forsiktig for å unngå tap av materiale i røret og forurensning. - Hvis folliklene forblir fast i et stykke cortex, isoler dem mekanisk med to 27 G sprøyter ved å rive cortex av med sprøytespissen for å frigjøre follikler fra stroma.
MERK: Ikke berør folliklene med sprøytene for å unngå å skade dem. - Overfør folliklene med mikrokapillæren i en 4-brønnplate som inneholder dråper på 15 μL av det kalibrerte kulturmediet dekket av 500 μL oljekultur (1 til 10 follikler per dråpe). Dette trinnet opprettholder follikkelens levedyktighet under innsamlingsprosessen. Ved slutten av prosedyren, skyll folliklene to ganger i 5 s hver gang i to dråper 15 μL fosfatbufret saltoppløsning (PBS) dekket av 500 μL oljekultur (på is).
- Samle 20 follikler med en minimal mengde PBS ved hjelp av munnpipetten (maksimalt 10 μL) i et tomt rør, og hold røret på is.
MERK: For RNA-stabilitet er det avgjørende å utføre trinn 2.8 og trinn 2.9 på is. Rundt 20 follikler (<75 μm) er nødvendig for å ha nok RNA for standard RT-qPCR (SYBR Green). - Etter maksimalt 90 min inkubasjon i fordøyelsesmediet, stopp den enzymatiske reaksjonen ved å tilsette i petriskålen en overflødig kald (4 ° C) blokkerende løsning (7,5 ml) sammensatt av kulturmedium tilsatt 10% føtal bovint serum (FBS).
MERK: Blokkeringsløsningen kan tilsettes så snart eksperimentøren observerer follikler som stikker på platen eller skadede follikler (asymmetrisk form eller mørkere follikler). Det anbefales å utføre follikelisolering innen maksimalt 2,5 timer for å unngå follikkelskade og å utføre RNA-ekstraksjon umiddelbart etter isolering.
3. RNA-ekstraksjon
MERK: RNA-ekstraksjon utføres i henhold til instruksjonene som følger med et RNA-ekstraksjonssett ved å tilpasse elueringsvolumene.
- Suspender de isolerte folliklene ved å tilsette 100 μL av lysisløsningen som følger med RNA-ekstraksjonssettet til røret som inneholder folliklene under en kjemisk hette og virvel med høy hastighet (2,500 rpm / min) for å bryte strukturen av folliklene. Tilsett 50 μL etanol (100%) til røret, og kort virvel med høy hastighet.
MERK: Siden lysisbufferen inneholder 2-merkaptoetanol og tiocyansyre, må dette trinnet utføres med forsiktighet under en kjemisk hette. - Overfør det totale volumet av røret (ca. 160 μL) til en mikrofilterpatronenhet bestående av en kolonne og et oppsamlingsrør, og sentrifuger det i 10 s ved 16 363 x g ved 4 °C. Vask søylen med 180 μl vaskeoppløsning 1, som følger med settet, og sentrifuger røret i 10 s ved 16 363 x g ved 4 °C.
- Tilsett 180 μL vaskeoppløsning 2/3, som følger med settet, til kolonnen, og sentrifuge i 10 s ved 16 363 x g ved 4 °C. Utfør dette trinnet to ganger. Sentrifuger røret en siste gang i 1 min for å tørke filteret, og plasser et nytt oppsamlingsrør under patronen.
- Utfør eluering av nukleinsyrene i to trinn:
- Tilsett først 8 μL varm elueringsoppløsning (75 °C) til filteret, vent i 1 min ved RT og sentrifuge i 30 s ved 16 363 x g ved 4 °C.
- Gjenta dette trinnet med 7 μL elueringsoppløsning.
MERK: Tuben som inneholder de eluerte nukleinsyrene må holdes på is. For å unngå DNA-kontaminering, anbefales et supplerende trinn med DNA-nedbrytning på det sterkeste-trinn 3.5.
- Inkuber røret med 2 IE DNase og 1x DNase buffer i 20 minutter ved 37 °C. Blokker den enzymatiske aktiviteten med 1/10 DNase-inaktiveringsreagens i 2 minutter ved RT.
- Sentrifuger røret i 1,5 min ved 16 363 x g ved 4 °C. Til slutt samler du suspensjonen som inneholder RNA, og overfører den til et nytt rør.
- Vurder mengden RNA som er tilstede i prøven ved hjelp av et spektrofotometer (NanoDrop 2000-programvare > nukleinsyre > RNA). Bruk 1 μL elueringsløsning som et emne, og mål RNA-mengden ekstrahert fra isolerte follikler med 1 μL løsning.
- Sjekk forholdet 260/280 for RNA-renhet (rundt 2,0). Oppbevar prøven ved -80 °C, eller retrotranskriber den direkte for å utføre RT-qPCR.
MERK: For å vurdere RNA-integriteten kan prøven behandles med et høyoppløselig automatisert elektroforesesystem før eller etter frysing ved -80 °C. I dette arbeidet, etter retrotranskripsjon, ble RT-qPCR utført med følgende syklus:
Hold scenen med 20 s ved 50 °C og 10 min ved 95 °C
40 PCR-sykluser med 15 s ved 95 °C og 1 min ved 60 °C
Smeltekurvetrinn med 15 s ved 95 °C, 1 min ved 60 °C, 30 s ved 95 °C og 15 s ved 60 °C
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne isolasjonsprosedyren kan eksperimentøren hente follikler fra stromalmiljøet for å utføre spesifikke genuttrykksanalyser. Basert på folliklenes størrelse og morfologi, er det mulig å skille de forskjellige stadiene av follikulogenese. Eksperimentøren kan velge follikler av interesse i henhold til deres størrelse ved hjelp av en tilpasset mikrokapillær pipette. Ved å bruke en mikrokapillær på maksimalt 75 μm, er det mulig å diskriminere primordiale og primære follikler fra sekundære, antrale og modne follikler. Videre kan eksperimentøren bekrefte follikelstadiet i henhold til follikelmorfologien. Når man studerer follikkelaktivering, velges hvilende og primære follikler, og omtrent 20 follikler er nødvendig for å nå en RNA-konsentrasjon på rundt 5 ng / μL.
To homogeniserte ovariefragmenter (4 mm x 2 mm x 1 mm) fra samme pasient ble behandlet for å isolere follikler ved hjelp av denne protokollen (figur 2). Etter en 1,5 timers isolasjonsprosedyre ble to populasjoner av follikler hentet i henhold til utviklingsstadiene for å sammenligne RNA-mengden og for å markere relevansen av follikelvalg: 20 follikler på <75 μm (rør 1) og 15 follikler på <200 μm (rør 2). Deretter ble RNA-ekstraksjon utført, og 4,8 ng / μL totalt RNA fra rør 1 og 10,5 ng / μL totalt RNA fra rør 2 ble oppnådd ved hjelp av et spektrofotometer for kvantifisering (tabell 1). Ved hjelp av dette mikrovolumspektrofotometersystemet ble forholdet 260/280 også målt for å vurdere RNA-renheten. Dette forholdet gjenspeiler potensiell forurensning av protein eller andre reagenser under ekstraksjon og må være nær 2,0 for RNA-prøver. Forholdet 260/280 var henholdsvis 1,89 og 1,74 i rør 1 og rør 2, noe som validerte renheten til prøvene (tabell 1). RNA-kvaliteten ble deretter verifisert ved å behandle prøvene med høyoppløselig automatisert elektroforese. Etter denne prosedyren ble RNA-integritetsnummeret (RIN) estimert. RIN-verdien, fra 1 (degradert) til 10 (intakt), gjenspeiler nivået av nedbrytning av RNA i en prøve. RIN-verdiene var henholdsvis 7,1 og 7,9 i rør 1 og rør 2, noe som validerte kvaliteten på RNA fra våre prøver (tabell 1). For å utføre en RT-qPCR ble det totale volumet av ekstrahert RNA først retrotranskribert til cDNA. Deretter ble 1,25 ng cDNA tilsatt per brønn på en 96-brønnsplate, med primere for rengjøring og målgener (hypoksantin-guaninfosforibosyltransferase [HPRT], Kit Ligand [KL] og vekstdifferensieringsfaktor 9 [GDF9]) og SYBR Green master mix17,18. Etter å ha kjørt en standardsyklus på et sanntids PCR-system, var syklustersklene (Ct) oppnådd 30,87 (rør 1) og 29,56 (rør 2) for HPRT, 33,5 (rør 1) og 31,77 (rør 2) for KL, og 30,71 (rør 1) og 30,57 (rør 2) for GDF9 (tabell 1).
Figur 1: Skjematisk fremstilling av metoden for å vurdere RNA-ekstraksjon fra isolerte humane eggstokkfollikler. Tre trinn er beskrevet i dette manuskriptet: vevtining, isoleringsprosedyren, inkludert mekanisk og enzymatisk prosessering, og RNA-ekstraksjon fra folliklene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Innsamlede follikler etter isolasjonsprotokoll. (A) Tint kortikalt vev. (B) Vevskutteren og (C) vevshakkeren som brukes til å fragmentere vevet. (D-E) Bilder av innhentede isolerte follikler observert med et stereomikroskop med et 10x okular og et bredt zoomområde (1x-6,3x); Forstørrelsesinnstillinger på 50x-63x ble brukt for identifisering av primordiale og primære follikler. Vekter: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Rør | Antall follikler | Follikler størrelse (μm) | RNA-konsentrasjon (ng/μL) | 260/280-forhold | RNA-integritetsnummer (RIN) | HPRT Ct | KL Ct | GDF9 Ct | |
| 1 | 20 | <75 | 4.8 | 1.89 | 7.1 | 30.87 | 33.5 | 30.71 | |
| 2 | 15 | <200 | 10.5 | 1.74 | 7.9 | 29.56 | 31.77 | 30.57 | |
Tabell 1: Renhet, RIN og syklusterskler for to homogeniserte ovariefragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kryopreservering av eggstokkvev er en lovende tilnærming for å bevare fruktbarheten til kreftpasienter. I klinikken blir tint kortikalt vev podet tilbake i pasienten etter remisjon, slik at ovariefunksjon og fruktbarhet kan gjenopptas19,20. I tillegg til klinisk bruk kan gjenværende ovariefragmenter også doneres til forskning ved slutten av lagringsperioden for å studere mekanismene som regulerer follikulogenese. Dessuten er dette vevet spesielt nyttig for å utvikle alternativer til poding når det ikke er mulig, for eksempel in vitro-kultursystemer eller kunstige eggstokker. Variasjoner både innenfor og mellom pasienter begrenser imidlertid forsøkenes gjennomførbarhet og reproduserbarhet og tolkningen av resultatene. Faktisk reduseres follikulær tetthet dramatisk med alderen, og follikler er ikke likt fordelt mellom fragmenter21. Siden antallet tilgjengelige fragmenter er begrenset, må menneskelig vev brukes med banebrytende teknikker. Et bredt spekter av teknikker som immunhistokjemi og immunfluorescens, samt in situ hybridisering, kan utføres på fast vev for å vurdere protein- og genlokalisering 3,18. For å studere molekylære mekanismer som regulerer follikulogenese innenfor de funksjonelle enhetene i eggstokken på forskjellige stadier av utvikling, er isolering av follikler nødvendig.
Flere studier har utforsket effektive metoder for å skille follikler fra det omkringliggende vevet hos mennesker og dyr22. Antall follikler hentet og kvaliteten på RNA etter ekstraksjon kan variere i henhold til teknikkene som brukes. For å studere follikkelaktivering (dvs. primordiale og primære follikler), er det nødvendig med minst 20 sammenslåtte follikler for å utføre standard RT-qPCR. Ved å bruke alternative metoder som RNA- eller cDNA-amplifisering eller nestet PCR, er det mulig å jobbe med færre follikler23,24.
Den tette naturen til eggstokkcortex gjør follikelisolering utfordrende, noe som har ført til bruk av metoder som involverer en kombinasjon av enzymatisk og mekanisk isolasjon25. Ulike typer enzymer kan brukes, for eksempel kollagenase og DNase26. Studier har imidlertid rapportert follikkelskader etter enzymatisk fordøyelse, noe som påvirker ytterligere in vitro-utvikling 27,28. For å opprettholde follikkelintegritet bruker flere team for tiden tilpassede enzymatiske fordøyelsesprotokoller eller utfører bare mekanisk isolasjon for påfølgende follikulær kultur 25,29,30,31. Dette manuskriptet rapporterer en enkel og effektiv metode for å oppnå isolerte follikler for kvantitativ PCR-analyse. Likevel krever alle eksperimenter en læringskurve før de når optimale resultater.
For grunnleggende forskningsformål ble det utviklet en revisjon av en tidligere protokoll for å hente en stor mengde follikler uten å påvirke deres integritet13. Behandlingen for genekspresjonsanalyse utføres direkte etter isolasjon for å optimalisere RNA-kvaliteten. Det er også viktig å unngå langvarig fordøyelse for å begrense risikoen for å velge degenererte follikler. Dermed forblir fordøyelsestrinnet avgjørende i denne protokollen. Tre punkter krever spesiell oppmerksomhet: (1) spyling av vevet under den enzymatiske reaksjonen hvert 10. minutt for å gi homogen enzymvirkning; (2) kontroll av follikkelintegriteten ved å velge friske follikler under prosedyren og stoppe reaksjonen med blokkeringsoppløsning så snart skade er observert; (3) tilpasningen av kollagenasekonsentrasjonen, da vevsstivhet kan variere mellom pasienter i henhold til alder. Konsentrasjonen av kollagenase kan reduseres (til 0,12 %) i noen tilfeller for å forhindre skade (dvs. hos prepubertale pasienter)32.
I den siste delen av denne protokollen ble RNA-ekstraksjon fra isolerte follikler utført etter tilpassede instruksjoner. Dette tillater et bredt spekter av eksperimenter, for eksempel RT-qPCR eller RNA-sekvensering, og gir grunnleggende informasjon om forskjellige cellulære prosesser som er spesifikke for oocytt- og granulosaceller. Tallrike protokoller og sett er tilgjengelige for å trekke ut RNA fra vev. Vi har her rapportert en effektiv teknikk som brukes i vårt laboratorium som tillater ekstraksjon av en tilstrekkelig mengde RNA for å utføre genuttrykksanalyser ved RT-qPCR. Mens direkte RNA-ekstraksjon er sterkt anbefalt etter follikelisolering for å opprettholde RNA-integritet, er det også mulig å fryse de isolerte folliklene ved -80 ° C hvis ekstraksjonen ikke kan utføres samme dag. RNA-mengden kan variere i henhold til størrelsen på folliklene, og voksende follikler kan forstyrre analysen hvis de slås sammen med de hvilende folliklene. Seleksjon basert på størrelse er ekstremt relevant, avhengig av målene for studien, spesielt for det første trinnet av follikulogenese. Imidlertid er differensieringen mellom primordiale og primære follikler basert bare på størrelse fortsatt utfordrende når det gjelder riktig vurdering av primordiale follikelgenuttrykksnivåer. Valget av primordiale og primære follikler kan utføres basert på deres morfologi, men diskrimineringen mellom dem med et stereomikroskop ved en forstørrelse på 63x er vanskelig.
Avslutningsvis må eksperimentøren være oppmerksom på utfordringene med follikelisolasjon og ta hensyn til dem når resultatene analyseres. Viktige parametere må vurderes, for eksempel (1) intra/inter-variasjoner i follikkeltetthet mellom pasienter; (2) follikelintegritet under follikelisolasjon; (3) differensiering mellom forskjellige follikler stadier; og (4) RNA stabilitet og integritet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et Excellence of Science (EOS) stipend (ID: 30443682). I.D. er forsker ved Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm gridded Petri dish | Corning | 430196 | |
| 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
| 2100 Expert software | Agilent | version B.02.08.SI648 | |
| 4-wells plate | Sigma Aldrich | D6789 | |
| 6-wells plate | Carl Roth | EKX5.1 | |
| Agilent total RNA 6000 pico kit | Agilent | 5067-1513 | |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| Aspirator tube assemblies for microcapillary pipettes | Sigma Aldrich | A5177 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Collagenase IV | LifeTechnologies | 17104-019 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DNase | Sigma Aldrich | D4527-10kU | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| GoScript reverse transcriptase | Promega | A5003 | |
| HSA | CAF DCF | LC4403-41-080 | |
| Leibovitz-15 | LifeTechnologies | 11415-049 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| McCoy’s 5A + bicarbonate + Hepes | LifeTechnologies | 12330-031 | |
| McIlwain tissue chopper | Stoelting | 51350 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 200 µm | CooperSurgical | 7-72-2200/1 | |
| Microcapillary RI EZ-Tips 75 µm | CooperSurgical | 7-72-2075/1 | |
| NanoDrop 2000/2000c operating software | ThermoFisher | version 1.6 | |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher | 2000/2000c | |
| Penicillin G | Sigma Aldrich | P3032 | |
| PowerTrack SYBR green master mix | ThermoFisher | A46109 | |
| Primers: GDF9 | F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG | ||
| Primers: HPRT | F: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA | ||
| Primers: Kit Ligand | F: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT | ||
| Real-Time qPCR Quantstudio 3 | ThermoFisher | A33779 | |
| RNAqueous-micro total RNA isolation kit | ThermoFisher | AM1931 | |
| Selenium | Sigma Aldrich | S9133 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800 | |
| Streptomycine sulfate | Sigma Aldrich | S1277 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S1888 | |
| Thermo Scientific Forma Series II water-jacketed CO2 incubators | ThermoFisher | 3110 | |
| Thomas Stadie-Riggs tissue slicer | Thomas Scientific | 6727C10 | |
| Transferrin | Roche | 10652202001 |
References
- Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
- Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
- Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
- Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31 (2015).
- Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
- Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417 (2011).
- Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71 (2017).
- Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
- Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
- Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
- McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423 (2022).
- Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
- Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
- Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
- Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
- Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
- Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
- Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
- Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
- Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
- Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
- Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
- Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
- Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
- Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
- Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
- Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
- Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
- Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
