Summary
Dit artikel is bedoeld om onderzoekers een gedetailleerde en toegankelijke gids te bieden voor het opzetten van een model van hemorragische shock bij baby's.
Abstract
Hemorragische shock is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij pediatrische patiënten. Interpretatie van de klinische indicatoren die bij volwassenen zijn gevalideerd om reanimatie te begeleiden en vergelijking tussen verschillende therapieën is moeilijk bij kinderen vanwege de inherente heterogeniteit van deze populatie. Als gevolg hiervan is, in vergelijking met volwassenen, de juiste behandeling van pediatrische hemorragische shock nog steeds niet goed ingeburgerd. Bovendien verhindert de schaarste aan pediatrische patiënten met hemorragische shock de ontwikkeling van klinisch relevante studies. Om deze reden is een experimenteel pediatrisch diermodel nodig om de effecten van bloedingen bij kinderen te bestuderen, evenals hun reactie op verschillende therapieën. We presenteren een model van een babydier van volumegecontroleerde hemorragische shock bij verdoofde jonge varkens. Bloeding wordt veroorzaakt door het afnemen van een eerder berekend bloedvolume, en het varken wordt vervolgens gecontroleerd en gereanimeerd met verschillende therapieën. Hier beschrijven we een nauwkeurig en zeer reproduceerbaar model van hemorragische shock bij onvolwassen varkens. Het model levert hemodynamische gegevens op die kenmerkend zijn voor compensatiemechanismen die worden geactiveerd als reactie op ernstige bloedingen.
Introduction
Levensbedreigende bloeding als gevolg van trauma, hoewel ongebruikelijk, is de belangrijkste doodsoorzaak bij pediatrische patiënten 1,2. Bijkomende oorzaken van hemorragische shock zijn hemorragische koorts, gastro-intestinale bloedingen, leverchirurgie en hartchirurgie, vooral wanneer cardiopulmonale bypass wordt gebruikt3.
In tegenstelling tot de volwassen populatie zijn er onvoldoende gegevens over de behandeling van pediatrische hemorragische shock, die grotendeels gebaseerd is op meningen van deskundigen of rechtstreeks is vertaald uit de praktijk van volwassenen 2,4. Het is echter mogelijk dat de vertaling van managementstrategieën van volwassenen niet geschikt is. Klinische indicatoren die bij volwassenen zijn gevalideerd, zijn bijvoorbeeld moeilijk te extrapoleren naar pediatrische patiënten vanwege de fysiologische heterogeniteit die aanwezig is in groepen van verschillende leeftijden en de verschillende letselpatronen die overheersen in de pediatrische populatie. Bijgevolg zijn specifieke eindpunten die interventie bij de pediatrische patiënt zouden veroorzaken, niet goed gedefinieerd. Bovendien is er niet genoeg bewijs voor de schadelijke effecten die therapieën die momenteel bij volwassenen worden toegepast, kunnen hebben op kinderen 2,4,5.
Met het oog op dit alles is verder onderzoek nodig om specifieke reanimatiedrempels vast te stellen om snel in te grijpen, en om beter te bepalen wat de meest geschikte therapieën zijn voor pediatrische hemorragische shock. De ontwikkeling van kwalitatief hoogwaardige en klinisch relevante studies naar levensbedreigende bloedingen bij kinderen is echter moeilijk vanwege het gebrek aan patiënten en de reeds genoemde heterogeniteit in de pediatrische populatie van de neonatale periode tot de adolescentie.
De klinische relevantie van hemorragische shock, naast de moeilijkheden bij het uitvoeren van klinische studies bij pediatrische patiënten, benadrukken de noodzaak van preklinische evaluaties van diermodellen om pathofysiologie na hemorragische shock bij kinderen te bestuderen, en om verschillende therapieën te vergelijken. Verschillende diermodellen zijn op grote schaal gebruikt in onderzoek om hemorragische shock 6,7,8,9 te bestuderen. Vanwege hun anatomische en fysiologische overeenkomsten met mensen worden varkens zeer gewaardeerd in biomedisch onderzoek. Wat betreft de voordelen van het gebruik van specifieke babymodellen, zijn er aanwijzingen dat de hemodynamica van onvolgroeide varkens, evenals respiratoire, hematologische en metabolische systemen, zeer vergelijkbaar zijn met die bij jongemensen9. Dit biedt een unieke kans om een klinisch scenario van hemorragische shock bij kinderen te simuleren.
In dit model wordt een bloeding veroorzaakt door het terugtrekken van een eerder berekend bloedvolume. Vervolgens wordt het varken gemonitord en worden verschillende reanimatievloeistoffen toegediend.
Hier beschrijven we een nauwkeurig en zeer reproduceerbaar model van hemorragische shock bij onvolwassen varkens. Het model levert hemodynamische gegevens op die kenmerkend zijn voor compensatiemechanismen die worden geactiveerd als reactie op ernstige bloedingen.
Protocol
De experimenten in dit protocol zijn goedgekeurd door de Institutionele Ethische Commissie voor Dierproeven van het Gregorio Marañón Universitair Ziekenhuis, Madrid, Spanje, en de Raad voor Landbouw en Milieu van de Autonome Regering van Madrid (vergunningsnummer: 12/0013). Europese en Spaanse richtlijnen voor ethische zorg en het gebruik van proefdieren werden gedurende het hele onderzoek toegepast. De experimenten werden uitgevoerd in de afdeling Experimentele Geneeskunde en Chirurgie, Gregorio Marañón University Hospital, Madrid, Spanje.
OPMERKING: Het gekozen diermodel bestond uit gezonde minivarkens van 2-3 maanden oud (8-12 kg) (Sus scrofa domestica). Minivarkens zijn het resultaat van een kruising van drie verschillende rassen die ze geschikt maken voor biomedisch onderzoek. De dieren zijn bijna identieke lijnen en worden geleverd door een speciaal geautoriseerde fokkerij in Madrid (IMIDRA), die het onderhoud van drie homozygote genetische lijnen in zuiverheid houdt. Mannelijke en vrouwelijke dieren werden door elkaar gebruikt. De dieren kregen een standaard varkensdieet en werden minimaal 2 dagen geobserveerd om een goede gezondheid te garanderen. Voedsel, maar geen water, werd de nacht voor de procedures teruggetrokken om het risico op aspiratie te verminderen. Een typisch experiment duurt ongeveer 6 uur, inclusief 30 minuten voor anesthesie-inductie en chirurgische voorbereiding, 60 minuten voor instrumentatie, 30 minuten voor herstel, 60 minuten voor bloedingsinductie en posterieure stabilisatie, 30 minuten voor reanimatie en 120 minuten voor follow-up.
1. Anesthesie, intubatie en mechanische beademing
- Premedicatie aan het varken met een intramusculaire injectie van ketamine (10 mg/kg) en atropine (0,02 mg/kg) in het laterale gebied van de nek, achter het oor of in het achterste dijbeengebied.
OPMERKING: Anticholinergica, zoals atropine, zijn nuttig omdat varkens overmatig kunnen kwijlen onder narcose10. Onze ervaring is dat deze dosis ketamine voldoende is om stress te verminderen en adequate sedatie en analgesie bij varkens induceert zonder nadelige effecten. Als het dier echter niet goed wordt verdoofd of als de afstand van de huisvesting tot de operatiekamer groot is, kan een nieuwe dosis ketamine (10 mg/kg) veilig worden toegediend.
LET OP: Handschoenen zijn noodzakelijk bij het hanteren van dieren. - Vervoer het verdoofde dier naar de operatiekamer en leg het op een operatietafel voorzien van een warmtedeken.
- Meet de perifere zuurstofverzadiging (Sp02) met een sensor die aan het oor van het varken is bevestigd en start continue elektrocardiografische (ECG) bewaking met drie afleidingen.
- Desinfecteer de huid met ten minste 3 afwisselende rondes povidon-jodium of chloorhexidine-scrub en alcohol. Breng een perifere aderkatheter (22-24 G) in de oorader in. Desinfecteer de huid vooraf met een antiseptische oplossing.
- Induceer anesthesie door een intraveneuze injectie van fentanyl (5 μg/kg), propofol (4 mg/kg) en atracurium (0,5 mg/kg). Zodra de spontane ademhaling verdwijnt en de afwezigheid van reflexen is bevestigd, plaatst u het dier in de dorsale ligpositie en start u onmiddellijk de beademing van het handtasmasker met een hondenmasker met een fractie ingeademde zuurstof (Fi02) ingesteld op 100%.
OPMERKING: Om het risico van accidenteel bewustzijn in verband met het gebruik van neuromusculaire blokkers te verminderen, moeten anesthetica met bekende effectiviteit bij varkens en met doses op de hogere limiet worden gebruikt om een adequaat niveau van anesthesie te garanderen. Controleer bovendien continu cardiovasculaire symptomen zoals hartslag, bloeddruk en lichaamstemperatuur, en dien neuromusculaire blokkers alleen toe wanneer terugtrekkingsreflexen afwezig zijn (terugtrekking van het pedaal, ooglidreflexen en kaaktonus) en de spiertonus ontspannen is. - Voer endotracheale intubatie uit. Voor deze procedure zijn ten minste twee operators nodig.
- Zorg ervoor dat de basisuitrusting en chirurgische hulpmiddelen die nodig zijn voor endotracheale intubatie gereed zijn: bind gaas om de mond te openen en de buis vast te zetten, veterinaire laryngoscoop met een recht mes tussen 17 en 25 cm lang, een gewone endotracheale tube (ID 4-5), stilet, spuit met lucht en plakband.
- Trek de tong iets naar buiten en houd de kaak open met behulp van een bindgaas dat achter de bovenste en onderste hoektanden is geplaatst.
- Voer een laryngoscopie uit en zodra de epiglottis zichtbaar is, gebruikt u de punt van de laryngoscoop om de epiglottis omhoog te drukken in de richting van de basis van de tong.
OPMERKING: Als de epiglottis vastzit aan het zachte gehemelte, kan deze dorsaal worden verplaatst met de punt van de buis. Bediener 1 voert stap 1.6.2 uit, terwijl bediener 2 stap 1.6.3 uitvoert. - Zodra de stembanden zichtbaar zijn, duwt u de buis voorzichtig met lichte rotatie in de luchtpijp.
OPMERKING: Het smalste punt van de luchtpijp bevindt zich op subglottisch niveau. Als het inbrengen van de slang moeilijk is, probeer dan een lichte rotatie of een kleinere buis. - Verwijder de stilet en gebruik een spuit van 5 ml om de manchet op te blazen.
- Zorg voor plaatsing van de endotracheale tube door te letten op symmetrische borststijging, voldoende zuurstofverzadiging (95%-100%) en een juiste golfvorm en eindgetijdenmeting van CO2 (EtCO2).
LET OP: Varkens zijn zeer vatbaar voor laryngospasmen en oedeem van het strottenhoofdslijmvlies, en larynxperforatie kan zelfs optreden na verschillende pogingen tot intubatie of als de sedatie onvoldoende is10.
- Start na bevestiging van de intubatie mechanische beademing met behulp van een mechanisch beademingsapparaat met een ademhalingsfrequentie van 20 ademhalingen per minuut, een ademvolume van 8 ml/kg, een FiO2 van 40% en een positieve eind-expiratoire druk van 4 cm H2O. Pas de ventilatie aan om een partiële druk van kooldioxide (PaCO2) tussen 35 en 45 mmHg te bereiken.
- Handhaaf diepe anesthesie tijdens het experiment via een continue infusie van fentanyl (10 μg/kg/uur), propofol (10 mg/kg/uur) en atracurium (2 mg/kg/uur).
2. Instrumentatie
- Bereid het femurgebied voor op vaatkatheterisatie. Gebruik verband om de benen naar achteren te trekken en desinfecteer de liesstreek met ten minste 3 afwisselende rondes povidon-jodium of chloorhexidine-scrub en alcohol.
- Beoordeel de dijbeenvaten met een echografie en gebruik de Doppler-techniek om onderscheid te maken tussen de slagader en de ader. Breng, afhankelijk van de grootte van de ader, een 5,5-7,5 Franse (F) centraal veneuze katheter met drie poorten in een van de dijbeenaders in onder continu echografisch beeld en met behulp van de Seldinger-techniek11,12.
- Sluit onmiddellijk na het plaatsen van de centraal veneuze katheter een transducersysteem aan om de centraal veneuze druk te meten.
- Zorg ervoor dat een elektrolyt met glucose-infusie (20 ml/uur) is aangesloten op een van de centrale lijnpoorten en dat een onderhoudsinfusie met zoutoplossing (5 ml/uur) wordt toegediend via de resterende poort om occlusie van de katheter te voorkomen.
- Gebruik dezelfde techniek om de tegenoverliggende dijbeenslagader te cannuleren met een 4 F arteriële katheter die speciaal is ontworpen voor cardiale outputbewaking. Voer een bloedgastest uit om de juiste positie van de katheter vast te stellen als echografie geen bevestiging mogelijk is.
OPMERKING: In geval van significante spasmen of hematoom, oversteken naar de contralaterale dijbeenslagader. - Zodra de arteriële katheter is ingebracht, sluit u de arteriële draad van het cardiale outputmonitorsysteem en de arteriële transducer rechtstreeks aan op de monitorpoort. Sluit tegelijkertijd de veneuze meeteenheid van de monitor aan op de centrale veneuze transducer.
OPMERKING: De cardiale outputmonitor die in dit experiment wordt gebruikt, wordt gespecificeerd in de materiaaltabel. Voor installatie, kalibratie en metingen, zie de instructies van de fabrikant13. - Zorg ervoor dat zowel de veneuze als de arteriële transducers op nul zijn gekalibreerd.
- Leg de linker interne halsslagader en de linker externe halsader bloot via de cut-down-techniek.
- Zorg ervoor dat de benodigde apparatuur en chirurgische hulpmiddelen beschikbaar zijn: scalpel, chirurgische schaar met stompe punt, weefselpincet, klein zelfborgend weefseloprolmechanisme, naaldhouder, chirurgische swaps, hechtdraad met naald, een 18 G IV-canule, een 5 F-katheterhuls met een introducer en een Seldinger-voerdraad.
- Desinfecteer met het dier in de dorsale ligpositie de nekhuid met een antiseptische oplossing.
- Gebruik een scalpel om een paratracheale incisie van ~ 10 cm links te maken, waarbij een lijn tussen het manubrium en de hoek van de kaak wordt doorgesneden.
- Om de uitwendige halsader bloot te leggen, ontleedt u het weefsel lateraal van de SCM en isoleert u de ader van de omliggende fascia.
- Gebruik na isolatie twee niet-resorbeerbare zijden hechtingen (USP-0) die rond de ader zijn gelust om het vat te fixeren voorafgaand aan de punctie.
- Snijd de ader in met een Venflon-naald (18 G). Eenmaal in de ader trekt u de naald terug en steekt u de voerdraad door de Venflon-buis.
- Verwijder de Venflon-buis en steek de huls met de introducer (5 F) over de draad. Verwijder na het inbrengen zowel de introducer als de draad.
- Spoel de hulzen onmiddellijk na het inbrengen met 0,9% NaCl (5 ml/uur) om trombusvorming te voorkomen.
- Bind de proximale zijden hechting rond de schede om deze te fixeren. Bevestig daarna het handvat van de schede aan de SCM en sluit de huid af met nietjes.
- Laat de dieren na de chirurgische voorbereiding 30 minuten stabiliseren voordat u de basiswaarden voor monitoring en bloedmonsters verkrijgt.
- Houd de bloedtemperatuur tijdens het experiment op 37-39 °C met behulp van een thermische deken en een plafondwarmer.
NOTITIE: De temperatuur wordt gemeten met een thermistor die zich bij de arteriële kathetertip met thermodilutie bevindt.
3. Hemodynamische en perfusiebewaking
- Bewaak het ECG, de perifere zuurstofverzadiging, het ademhalingsvolume en de druk en Fi02.
- Sluit een spirometer aan tussen de endotracheale tube en een multiparametermonitor om kwalitatieve en kwantitatieve EtC02 te meten.
OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over de multiparametermonitor. - Gebruik nabij-infraroodspectroscopie (NIRS) om de oxygenatie-index van het hersenweefsel (bTOI) en de oxygenatie-index van het splanchnisch weefsel (aTOI) te controleren. Plaats de sensoren op de huid van het voorhoofd en de voorste buikwand (subhepatisch gebied).
NOTITIE: Plaats de hersensensor niet in de middellijn, omdat deze besmet kan zijn met het superieure sagittale sinusveneus bloed14. - Sluit de bloedstroomsonde die aan de interne halsslagader is bevestigd aan op een stroommonitor om de bloedstroom van de halsslagader (CaBF) te meten.
- Plaats een laser Doppler-sensor over de huid van de voorste buikwand voor continue meting van de cutane tissulaire bloedstroom (CuTBF).
NOTITIE: Voor meer informatie over de halsslagader- en cutane tissulaire blaasstroomsensoren, zie de Materiaaltabel. - Noteer de volgende parameters bij baseline en elke 30 minuten: bloedtemperatuur, inspiratoir teugvolume, EtCO2, hartritme, hartslag (HR), systolische en diastolische bloeddruk, gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP), schokindex (HR/systolische bloeddruk)15, centrale veneuze druk, cardiale index (CI), globale diastolische volume-index (GEDVI), slagvolume-index (SVI), linkerventrikelcontractiliteit (Dt/Dpmax), systemische vasculaire weerstandsindex (SVRI), extravasculaire longwaterindex (ELWI), drukpulsvariatie (PPV), perifere hemoglobineverzadiging, centrale veneuze verzadiging (ScvO2), cerebrale (bTOI) en splanchnische (aTOI) weefseloxygenatie-index door NIRS, CaBF en CuTBF.
- Om CI-waarden te verkrijgen, dient u 5 ml bolussen van 0,9% normale zoutoplossing bij een temperatuur lager dan 8 °C via de centraal veneuze katheter toe te dienen. Noteer het gemiddelde van twee opeenvolgende metingen.
- Bepaal elke 30 minuten de arteriële en veneuze bloedgasprofielen en lactaatconcentratie door 0,3 ml bloed uit de femurvaten af te nemen. Voer standaard volledige bloedtellingen, stollingsonderzoeken en biochemie uit bij baseline, na bloedingsinductie en aan het einde van het experiment.
- Spoel na elke bloedafname de lijntjes door met 0,5 ml 100 IE/ml heparine.
4. Hemorragische schokinductie
- Zodra een steady-state is bereikt nadat instrumentatie en basisgegevens zijn verzameld, induceert u een hypovolemische shock door gedurende 30 minuten 30 ml/kg bloed uit de halsader te halen.
- Wacht een periode van 30 minuten voor stabilisatie. Voer tijdens deze periode geen reanimatiepogingen uit om de vertraging bij aankomst van medische noodteams na te bootsen.
5. Infusie en follow-up
- Na de stabilisatieperiode een bolus van een volume-expander of een vasoactief middel toedienen gedurende een periode van 30 minuten.
OPMERKING: Voorbeelden van geteste volume-expanders en vasoactieve middelen zijn normale zoutoplossing, hypertone albumine, angiotensine en terlipressine. In deze studie werden 30 ml/kg normale zoutoplossing (NS) (n = 13), 15 ml/kg 5% albumine plus 3% hypertone zoutoplossing (AHS) (n = 13) of een enkele intraveneuze bolus van 15 μg/kg terlipressine plus 15 ml/kg 5% albumine plus 3% hypertone zoutoplossing (TAHS) (n = 13) gebruikt. - Volg het dier na de infusie gedurende 120 minuten. Noteer de hemodynamische parameters en verkrijg elke 30 minuten bloedmonsters voor arteriële en veneuze bloedgasprofielen en bepaling van de lactaatconcentratie. Voer in deze periode geen reanimatiepogingen uit.
6. Einde van het experiment en euthanasie
- Zodra het experiment is voltooid, gebruikt u een overdosis kalmerende middelen (5 μg/kg fentanyl en 10 mg/kg propofol) en een intraveneuze injectie met kaliumchloride (2 mEq/kg) om alle met succes gereanimeerde dieren te offeren.
- Bevestig de afwezigheid van circulatie door asystolie of pulsloze elektrische activiteit op een continu ECG-display, de afwezigheid van pulserende stroom tijdens invasieve arteriële drukbewaking en de afwezigheid van andere vitale functies.
- Als tijdens de follow-upperiode de arteriële bloeddruk daalt tot onder de 25 mmHg, offer het dier dan op om verder lijden te voorkomen.
Representative Results
Het gepresenteerde model is met succes gebruikt in verschillende experimenten om veranderingen in de macrocirculatie en microcirculatie na hemorragische shock en daaropvolgende reanimatie te bestuderen, waarbij verschillende vloeistoffen en vasoactieve geneesmiddelen worden vergeleken16,17,18,19.
Gezien de reactie op shock, heeft dit model consequent aangetoond dat een gecontroleerde bloeding duidelijke veranderingen in hemodynamische parameters veroorzaakt, evenals in hersen- en weefselperfusie.
Na het terugtrekken van het volume worden significante tachycardie en een afname van MAP, CI, SVI, bloedvolumeparameters (GEDVI en ITBI) en halsslagaderarteriële bloedstroom, samen met een toename van de systemische vasculaire weerstandsindex, gedetecteerd (Figuur 1 en Figuur 2).
Wat de systemische perfusieparameters betreft, neemt lactaat aanzienlijk toe, terwijl ScvO2, CuTBF en bTO afnemen (Figuur 3). Variaties in centrale veneuze druk, Dt/Dpmax en ELW worden meestal niet geregistreerd.
Wat laboratoriumparameters betreft, nemen het hemoglobinegehalte en de hematocriet pas af nadat vloeistoffen zijn toegediend. De albumineconcentratie neemt af en de troponinespiegels nemen aanzienlijk toe na gecontroleerde bloeding. Andere parameters, waaronder kerntemperatuur, PaO2, PaCO2, arteriële zuurstofverzadiging, EtCO2, elektrolyten en nier- en leverfunctieparameters, blijven meestal stabiel.
Naast het nut ervan bij het analyseren van de cardiovasculaire en biochemische reacties op shock, is aangetoond dat dit model met succes onderscheid maakt tussen verschillende reanimatievloeistoffen.
In eerdere studies hebben we geprobeerd te bepalen of, in een babydiermodel van hemorragische shock, het gebruik van een infusie met een lager volume van hypertone vloeistoffen - alleen of in combinatie met verschillende vasopressoren - de globale hemodynamische en perfusieparameters zou verbeteren in vergelijking met normale zoutoplossing.
Zoals eerder gemeld, hebben we consequent waargenomen dat de infusie van hypertone vloeistoffen een vergelijkbare respons produceert als de infusie van tweemaal het volume isotone vloeistof16,17,18.
Meer specifiek produceerde het gebruik van albumine plus hypertone zoutoplossing een grotere en langere volume-uitbreiding dan normale zoutoplossing of hypertone zoutoplossing alleen, met significante verschillen in HR, SVI en PPV, en de afwezigheid van een progressieve daling na volume-uitbreiding van de bloeddruk en GEDVI, zoals waargenomen in de andere groepen (Figuur 1 en Figuur 2). Verder hebben we ook een grotere verbetering van perfusieparameters waargenomen met hypertoon albumine, weergegeven als een grotere toename van bTOI en CaBF, en een grotere afname van lactaatspiegels dan de andere groepen in vergelijking met het begin van de vloeistofexpansie (Figuur 3). We zijn van mening dat dit verschil secundair kan zijn aan het vermogen van albumine om het bloedvolume te verhogen en voor een langere periode in het intravasculaire compartiment te blijven dan normale zoutoplossing. Interessant is dat we hebben gezien dat de toevoeging van een enkele bolus terlipressine aan het begin van vloeistofreanimatie vergelijkbare resultaten opleverde als die waargenomen in de hypertone albuminegroep, zonder extra voordelen in termen van hemodynamische of perfusieparameters17,18.
Figuur 1: Hemodynamische parameters. (A) Evolutie van de hartslag, (B) gemiddelde arteriële druk, (C) cardiale index bij baseline (t0') en (D) systemische vasculaire weerstandsindex bij baseline (t0'). In de loop van het experiment: einde van gecontroleerde bloeding (Shock30'); het begin van de infusie, 30 minuten na het einde van de gecontroleerde bloeding (Res0'); einde van de infusie (Res30'); follow-up 30 minuten na het einde van de infusie (Obs30'); follow-up 60 minuten na het einde van de infusie (Obs60'); follow-up 90 minuten na het einde van de infusie (Obs90'). (*) Significant verschil (p < 0,05) ten opzichte van de baseline, dezelfde groep. (‡) P < 0,05 van bloeding, zelfde groep. (#) p < 0,05 van groep NS. Afkortingen: NS = normale zoutoplossing; AHS = hypertone zoutoplossing albumine; TAHS = terlipressine plus hypertone zoutoplossing albumine. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde en standaarddeviatie. Deze figuur is aangepast met toestemming van Urbano et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Parameters van het bloedvolume. (A) Evolutie van de slagvolume-index, (B) pulsdrukvariatie en (C) globale einddiastolische volume-index bij baseline (t0'). In de loop van het experiment: einde van gecontroleerde bloeding (Shock30'); begin van de infusie, 30 minuten na het einde van de gecontroleerde bloeding (Res0'); einde van de infusie (Res30'); follow-up 30 minuten na het einde van de infusie (Obs30'); follow-up 60 minuten na het einde van de infusie (Obs60'); follow-up 90 minuten na het einde van de infusie (Obs90'). (*) Significant verschil (p < 0,05) ten opzichte van baseline, zelfde groep. (‡) P < 0,05 door bloeding, zelfde groep. (#) p < 0,05 van groep NS. Afkortingen: NS = normale zoutoplossing; AHS = hypertone zoutoplossing albumine; TAHS = terlipressine plus hypertone zoutoplossing albumine. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde en standaarddeviatie. Deze figuur is aangepast met toestemming van Urbano et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Systemische perfusieparameters. (A) Evolutie van arteriële bloedlactaat, (B) centrale veneuze zuurstofverzadiging in het bloed, en (C) Oxygenatie-index van hersenweefsel bij baseline (t0'). In de loop van het experiment: einde van gecontroleerde bloeding (Shock30'); begin van de infusie, 30 minuten na het einde van de gecontroleerde bloeding (Res0'); einde van de infusie (Res30'); follow-up 30 minuten na het einde van de infusie (Obs30'); follow-up 60 minuten na het einde van de infusie (Obs60'); follow-up 90 minuten na het einde van de infusie (Obs90'). (*) Significant verschil (p < 0,05) ten opzichte van baseline, zelfde groep. (‡) P < 0,05 door bloeding, zelfde groep. (#) p < 0,05 van groep NS. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde en standaarddeviatie. Deze figuur is aangepast met toestemming van Urbano et al.17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het uitvoeren van procedures bij jonge varkens kan complex en mogelijk levensbedreigend zijn vanwege bepaalde anatomische en fysiologische kenmerken van deze dieren. Om consistente resultaten te bereiken en het verlies van dieren te verminderen, zijn er enkele cruciale stappen die zorgvuldig moeten worden overwogen. Ten eerste is het bereiken van een adequaat niveau van sedatie essentieel om de stressrespons bij dieren te minimaliseren, die, indien buitensporig, de resultaten kan veranderen als gevolg van het vrijkomen van endogene catecholamine. Het is ook belangrijk om vertragingen tussen de intramusculaire injectie en intubatie te voorkomen, aangezien dieren een ernstige stressreactie kunnen ontwikkelen met tachycardie en onomkeerbare metabole acidose die het einde van het experiment kan bespoedigen. Hoewel andere groepen inhalatie-anesthetica gebruiken met goede resultaten20,21, geven we de voorkeur aan intraveneuze medicatie, omdat inhalatie-sedativa de meting van ademhalingsgasuitwisseling met indirecte calorimetrie niet mogelijk maken. Onze ervaring is dat een combinatie van propofol en fentanyl effectief is en zeer weinig nadelige effecten heeft. Zorgvuldig temperatuurbeheer tijdens het experiment is een ander belangrijk aspect van het protocol, aangezien snelle temperatuurveranderingen de hemodynamische reactie van het dier op schokken aanzienlijk kunnen beïnvloeden, de resultaten kunnen vervalsen of uiteindelijk kunnen leiden tot het mislukken van het experiment.
Een ander cruciaal onderdeel van instrumentatie is intubatie, gezien de bijzonderheden van de anatomie van varkens en hun gevoeligheid voor laryngospasmen. Daarom moet de procedure worden uitgevoerd door ten minste één operator met eerdere ervaring, en het gebruik van een stilet en spierontspanning is aan te raden10,22. Katheterisatie van bloedvaten kan ook een uitdaging zijn vanwege de kleine omvang van de dieren. Voor femurtoegang heeft een echogeleide punctie de voorkeur, omdat de bloedvaten zich diep bevinden, meestal kleine diameters hebben en verschillende banen en posities vertonen22. Voor cervicale toegang gebruiken we chirurgische toegang om de plaatsing van de halsslagaderstroomsonde mogelijk te maken, maar de ultrasone techniek is ook haalbaar23,24. Canulatie van de uitwendige halsader heeft meestal de voorkeur vanwege de grotere diameter, de oppervlakkige locatie en het lagere aantal omliggende structuren22. Katheters moeten onmiddellijk na het inbrengen worden gespoeld met zoutoplossingen om occlusie te voorkomen. We gebruiken geen heparine om stollingsveranderingen te voorkomen. Ook vermeden we aanvankelijk de toediening van glucose-infusies om mogelijke verstoring van de hemodynamische respons door de toediening van extra vloeistoffen te voorkomen, maar we ontdekten dat dieren ernstige en vroege hypoglykemie ontwikkelden. Ten slotte, zelfs met anesthesie en de minder invasieve technieken die tegenwoordig worden gebruikt, genereert instrumentatie een significante stressreactie bij dieren, dus het is wenselijk om voldoende tijd te laten voor herstel voordat met het verwijderen van bloed wordt begonnen. Wat betreft de inductie van de hemorragische shock, raden we aan om 30 ml/kg te verwijderen, omdat dit een significante pathofysiologische respons genereert met uitstekende overlevingskansen. Onze ervaring is dat jonge varkens geen grotere hoeveelheden bloedverlies verdragen en dat de sterfte hoog is. Geleidelijke afname van bloed is ook belangrijk, omdat snelle verwijdering kan leiden tot ernstige hemodynamische instabiliteit en vroege dood van het dier.
Hoewel er een grote verscheidenheid aan soorten en experimentele modellen beschikbaar is voor onderzoekers, vormt het ideale model van hemorragische shock bij dieren - eenvoudige, gemakkelijk reproduceerbare en nauwkeurige replicatie van de klinische situatie - nog steeds een uitdaging. Modellen van kleine dieren - voornamelijk muizen en ratten - worden gebruikt om de pathofysiologische mechanismen van shock te onderzoeken. Hun kleine formaat bemoeilijkt echter aanzienlijk de uitvoering van chirurgische en bemonsteringsprocedures. Grotere dieren, zoals honden en varkens, zijn duurder en complexer om mee om te gaan, maar hun grootte en fysiologische overeenkomsten met mensen maken ze geschikter voor preklinische evaluatie van de behandelingsstrategieën. Het gebruik van honden in het verleden en nog steeds in het verleden is echter ethisch twijfelachtig. Ze bieden geen enkel voordeel ten opzichte van varkens als proefdiermodellen, en hun intelligentie en de speciale bilaterale relatie tussen mens en hond plaatsen hen op een hogere positie op de fylogenetische schaal 6,7,8.
Met het oog op dit alles zijn volwassen varkens op grote schaal gebruikt voor cardiovasculair onderzoek vanwege hun overeenkomsten met de fysiologie, grootte en anatomie van volwassen mensen, die beter is dan de meeste soorten. Zoals echter goed is vastgesteld in de literatuur, zijn er significante verschillen tussen volwassen en pediatrische patiënten in termen van het cardiovasculaire systeem, het bloedvolume, de temperatuurregeling en de reactie op shock 2,3,4. Tegelijkertijd blijkt uit bewijs dat deze verschillen ook van toepassing zijn op varkens, en biggen blijken cardiovasculaire, cerebrovasculaire, hematologische en elektrolytenprofielen te hebben die sterk lijken op die bij pediatrische menselijke patiënten 9,25. Ten slotte, afgezien van deze anatomische en fysiologische verschillen tussen volwassenen en zuigelingen in beide soorten, biedt het gebruik van jonge diermodellen, met name minivarkens, de mogelijkheid om dezelfde apparaten te testen die in de echte klinische setting worden gebruikt voor monitoring. In veel gevallen is bewezen dat de betrouwbaarheid van deze apparaten laag is vanwege een eenvoudige aanpassing van de volwassen algoritmen, sensoren of weegschalen. Al deze aspecten ondersteunen het belang van het ontwikkelen van specifieke pediatrische diermodellen en hun relevantie in termen van translationeel nut voor de pediatrische klinische setting.
Naast het type dier zijn er drie basismodellen die over het algemeen worden gebruikt bij de studie van hemorragische shock: gecontroleerde bloeding - hetzij door volume of druk - en ongecontroleerde bloeding. Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, beschrijft een bloedingsmodel met een vast volume, waarbij een vast bloedvolume, meestal berekend door het percentage lichaamsgewicht, wordt verwijderd over een door de waarnemer vastgestelde periode. Integendeel, in modellen met een bloeding met vaste druk worden dieren uitgebloed volgens een vooraf bepaalde MAP, die vervolgens wordt gehandhaafd met periodieke bloedingen of vloeistofinfusies gedurende een bepaalde periode, afhankelijk van de diersoort en de mate of uitkomst van de shock. Zowel hemorragische schokmodellen met een vast volume als met een vaste druk maken het mogelijk om door schokken geïnduceerde pathofysiologische veranderingen onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen, wat een duidelijk voordeel biedt op het gebied van reproduceerbaarheid en standaardisatie. Hun belangrijkste beperking is echter dat ze de studie van de effecten van verschillende reanimatiestrategieën op actieve bloedingen niet toestaan, waarbij bekend is dat agressieve vloeistofreanimatie vóór de chirurgische controle van bloedingen de bloeding verhoogt en de overleving vermindert, als gevolg van remming van de vorming van de trombus en de stijging van de gemiddelde bloeddruk. Ongecontroleerde bloedingsmodellen geïnduceerd door een gestandaardiseerd vasculair trauma - verbrijzeling/scheuring van lever en milt, slagaderletsel of amputatie van een aanhangsel - zijn gesuggereerd om de klinische situatie beter weer te geven, waardoor een beter begrip mogelijk wordt van de effecten van verschillende vloeistofreanimatiestrategieën en andere interventies, zoals onderkoeling en hemostatische producten. Ondanks dat ze klinisch het meest relevant zijn, hebben deze ongecontroleerde bloedingsmodellen echter enkele duidelijke nadelen op het gebied van standaardisatie en reproduceerbaarheid. Gezien dit alles lijkt het erop dat het ideale model niet bestaat, en daarom moet onderzoek op dit gebied klinische relevantie in evenwicht brengen met experimentele standaardisatie en betrouwbaarheid 6,7,8,9,26.
Het model dat in deze studie wordt beschreven, kan brede potentiële toepassingen bieden in cardiovasculair onderzoek, zoals het onderzoek naar endotheeldisfunctie en veranderingen in de microcirculatie18 tijdens shock, evenals de validatie van verschillende hemodynamische monitoringsystemen. Bovendien kan het ook in andere onderzoeksgebieden worden gebruikt, waardoor de studie van endocriene of immuunresponsen na ernstige bloedingen mogelijk wordt, evenals de bepaling van bijwerkingen van verschillende vloeistoffen en vasopressoren. Met betrekking tot het onderzoek naar verschillende reanimatiestrategieën is het echter raadzaam om hun effecten in ongecontroleerde bloedingsmodellen te bestuderen voordat veranderingen in de klinische setting worden doorgevoerd 7,26.
Naast de moeilijkheid om de resultaten te extrapoleren naar het echte leven, heeft dit model nog andere beperkingen. Om te beginnen zijn er enkele verstorende variabelen die verband houden met de experimentele opzet, zoals het gebruik van anesthetica of mechanische beademing, die de fysiologische reacties tijdens shock kunnen verzwakken en de interpretatie van resultaten kunnen bemoeilijken. Bovendien kunnen de stressrespons van de instrumenten op de dieren en de temperatuurregeling de macro- en microcirculatie via verschillende mechanismen beïnvloeden. Een andere belangrijke beperking van dit model - gerelateerd aan de experimentele behoeften en beschikbaarheid van middelen - is de beperkte posttraumatische observatieperiode, die de studie van de langetermijngevolgen van hemorragische shock verder beperkt. Bovendien zijn er, ondanks de fysiologische overeenkomsten tussen mensen en varkens, enkele verschillen tussen soorten waarmee rekening moet worden gehouden. Het stollingssysteem blijkt bijvoorbeeld effectiever te zijn bij varkens27,28. Ook verschillen de plasmaspiegels van lactaat en succinaat tussen de diersoorten en hebben varkens basale alkalose, wat kan leiden tot een onderschatting van de effecten van bloedingen op het zuur-base-evenwicht29. Ten slotte is het ook bekend dat de ontstekings- en immuunreacties, evenals sommige vasopressorreceptoren, verschillend zijn bij varkens9. Specifieke dierverschillen moeten ook in aanmerking worden genomen als beïnvloedende factoren. Verschillende onderzoeken hebben genderverschillen aangetoond in termen van gevoeligheid voor shock, waarbij vrouwen een aanzienlijk overlevingsvoordeel hebben ten opzichte van mannen 6,9. Desalniettemin gebruiken we in de experimenten die in deze studie zijn uitgevoerd dieren uit dezelfde leeftijdsgroep en met een vergelijkbare genetische achtergrond om de potentiële variabiliteit die inherent is aan soorten te minimaliseren.
Concluderend biedt dit artikel een praktische en stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een varkensmodel van pediatrische hemorragische shock. In vergelijking met andere bestaande modellen is dit een betrouwbaar en gemakkelijk te volgen protocol met brede toepasbaarheid in biomedisch onderzoek, hetzij voor het onderzoek van pathofysiologische reacties na ernstige bloedingen, hetzij voor de evaluatie van verschillende reanimatiestrategieën.
Disclosures
De auteurs van dit werk hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) via het project "PI20/01706" en mede opgericht door de Europese Unie. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript. We willen al onze collega's van de Gregorio Marañón Pediatric Intensive Care Unit en van het Gregorio Marañón Experimental Institute bedanken, want zonder hun werk zou dit project niet mogelijk zijn geweest.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ADA swabs | Albino Dias de Andrade, S.A. | 300575750400 | Non-woven swabs |
| Alaris SE | Carefusion | N/A | Volumetric infusion pump |
| Atracurium | Aspen Pharma Trading Limited. Dublin, Ireland | N/A | Muscle relaxant |
| Atropine 1 mg/mL | B. Braun | 481377/1013 | |
| Barrier adhesive aperture drape | Mölnlycke | 63621 | |
| BD emerald syringe 5 mL, 10 mL, 20 mL | Becton Dickinson S.A | https://www.bd.com/en-eu/offerings/capabilities/syringes-and-needles/injection-syringes/bd-emerald-3-piece-syringe | various options available |
| BLF21A laser doppler monitor | Transonic Systems Inc. | BLF21A | Skin blood flow monitor |
| BlueSensor NF ECG electrodes | Ambu | NF-50-A/12 | |
| Check-Flo performer introducer set 5Fr | Cook Medical | G12018 | Vascular Sheath |
| Datex ohmeda S5 | GE Healthcare Finland Oy, Helsinki, Finland | M1162897 | Hemodynamic monitor |
| Fentanyl 0.05 mg/mL | Kern Pharma | N/A | Anesthesia |
| GE Vivid S5 | GE Healthcare | S series | Ultrasound machine |
| Introcan Safety 18 G, 22 G, 24 G | B. Braun | Introcan series | Safety intravenous catheter |
| INVOS cerebral/somatic oximetry adult sensors | Medtronic PLC, USA | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry/invos-cerebral-somatic-oximetry-adult-sensors.html | |
| INVOS OXIMETER cerebral/somatic | Somanetics | 08-10566 | Regional oxygenation monitor |
| Ketamin 50 mg/mL | Pfizer, S.L. | 47034 | Sedation |
| Leon plus | Heinen + Löwenstein | N/A | Ventilator |
| Life scope VS | Nihon Kohden | N/A | Bedside monitor |
| Miller laryngoscope blade 12″ | Jorgensen Labs, USA | J0449F | Laryngoscope |
| Multi-lumen central venous catheterization set 7 French, 3 lumen, 30 cm | Arrow | CS-14703 | Central venous catheter |
| Nellcor WarmTouch 5300A | Covidien | Thermal blancket | |
| Nitrile gloves | Medihands | KS-ST RT021 | Single use gloves |
| Pediatric SomaSensor INVOS cerebral/somatic | Covidien | https://www.medtronic.com/covidien/en-us/products/cerebral-somatic-oximetry.html | Disposable regional oxygen saturation sensor |
| PICCO monitoring kit | Pulsion Medical Systems | PV8215 | |
| PICCO thermodilution catheter 5F/20 cm | Pulsion Medical Systems | N/A | |
| Propofol Lipoven 10 mg/mL | Fresenius Kabi, Spain | N/A | Anesthesia |
| Pulse contour cardiac output (PiCCO2) | Pulsion Medical Systems | N/A | Hemodynamic monitor |
| Rüsch flexislip | Teleflex Medical | 503700 | Endotracheal tube stylet |
| Softa swabs | B. Braun | 19579 | Alcohol pads |
| Surgical silk sutures USP 0 | Aragó, Barcelona, Spain. | 6245 | |
| TruWave pressure monitoring set | Edwards | T001767A | Pressure monitoring set |
| Ultrasound transmission gel | Ultragel Hungary 2000 Kft. | UC260 |
References
- Disease Control and Prevention (CDC). Vital signs: Unintentional injury deaths among persons aged 0-19 years-United States, 2000-2009. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report. 61, 270-276 (2012).
- Russell, R. T., et al. Pediatric traumatic hemorrhagic shock consensus conference recommendations. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 94, S2-S10 (2023).
- Leonard, J. C., et al. Life-threatening bleeding in children: A prospective observational study. Critical Care Medicine. 49 (11), 1943-1954 (2021).
- Cannon, J. W.
- Dehmer, J. J., Adamson, W. T. Massive transfusion and blood product use in the pediatric trauma patient. Seminars in Pediatric Surgery. 19 (4), 286-291 (2010).
- Fülöp, A., Turóczi, Z., Garbaisz, D., Harsányi, L., Szijártó, A. Experimental models of hemorrhagic shock: a review. European Surgical Research. 50 (2), 57-70 (2013).
- Moochhala, S., Wu, J., Lu, J. Hemorrhagic shock: an overview of animal models. Frontiers in Bioscience. 14 (12), 4631-4639 (2009).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. S., Ayala, A. Shock and hemorrhage: an overview of animal models. Shock. 24, 33-39 (2005).
- Hildebrand, F., Andruszkow, H., Huber-Lang, M., Pape, H. C., van Griensven, M. Combined hemorrhage/trauma models in pigs-current state and future perspectives. Shock. 40 (4), 247-273 (2013).
- Chum, H., Pacharinsak, C.
- Leibowitz, A., Oren-Grinberg, A., Matyal, R. Ultrasound guidance for central venous access: Current evidence and clinical recommendations. Journal of Intensive Care Medicine. 35 (3), 303-321 (2020).
- Lockwood, J., Desai, N.
- Operator's Manual PiCCO2. Version 3.1. Pulsion Medical Systems. , Available from: https://www.manualslib.com/manual/2821743/Pulsion-Picco2.html#manual (2013).
- Operations Manual INVOS ® System, Model 5100C. Medtronic. , Available from: http://www.wemed1.com/downloads/dl/files/id/7947/product/10495/manual_for_mo_s_5100c.pdf (2013).
- Acker, S. N., Ross, J. T., Partrick, D. A., Tong, S., Bensard, D. D. Pediatric specific shock index accurately identifies severely injured children. Journal of Pediatric Surgery. 50 (2), 331-334 (2015).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline and hypertonic saline colloid resuscitation fluids in an infant animal model of hypovolemic shock. Resuscitation. 83 (9), 1159-1165 (2012).
- Urbano, J., et al. Comparison of normal saline, hypertonic saline albumin and terlipressin plus hypertonic saline albumin in an infant animal model of hypovolemic shock. PLoS One. 10 (3), e0121678 (2015).
- González, R., et al. Microcirculatory alterations during haemorrhagic shock and after resuscitation in a paediatric animal model. Injury. 47 (2), 335-341 (2016).
- López-Herce, J., Rupérez, M., Sánchez, C., García, C., García, E. Haemodynamic response to acute hypovolaemia, rapid blood volume expansion and adrenaline administration in an infant animal model. Resuscitation. 68 (2), 259-265 (2006).
- Gil-Anton, J., et al. Addition of terlipressin to initial volume resuscitation in a pediatric model of hemorrhagic shock improves hemodynamics and cerebral perfusion. PLoS One. 15 (7), e0235084 (2020).
- Williams, A. M., et al. Complete and partial aortic occlusion for the treatment of hemorrhagic shock in swine. Journal of Visualized Experiments. (138), e58284 (2018).
- Schüttler, D., et al. A practical guide to setting up pig models for cardiovascular catheterization, electrophysiological assessment, and heart disease research. Lab Animal. 51 (2), 46-67 (2022).
- Chiesa, O. A., et al. Minimally invasive ultrasound-guided technique for central venous catheterization via the external jugular vein in pigs. American Journal of Veterinary Research. 82 (9), 760-769 (2021).
- Anderson, J. H., et al. Ultrasound guided percutaneous common carotid artery access in piglets for intracoronary stem cell infusion. Laboratory Animals. 52 (1), 88-92 (2018).
- Hughes, H. C.
- Mayer, A. R., et al. A systematic review of large animal models of combined traumatic brain injury and hemorrhagic shock. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 104, 160-177 (2019).
- Velik-Salchner, C., et al. Normal values for thrombelastography (ROTEM) and selected coagulation parameters in porcine blood. Thrombosis Research. 117 (5), 597-602 (2006).
- Siller-Matula, J. M., Plasenzotti, R., Spiel, A., Quehenberger, P., Jilma, B.
- Reisz, J. A., et al. All animals are equal but some animals are more equal than others: Plasma lactate and succinate in hemorrhagic shock-A comparison in rodents, swine, nonhuman primates, and injured patients. The Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 84 (3), 537-541 (2018).
