Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון

Published: January 20, 2023 doi: 10.3791/64825
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2,3
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Microbiology Program, University of California, 3Biophysics Program, University of California
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול מתואר לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת כדי לכמת כיצד חלבון האביזר TnpB משפיע על הדינמיקה של טרנספוזיציה בתאי Escherichia coli חיים בודדים.

Abstract

כאן, מתווה פרוטוקול לביצוע הדמיה חיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאי חיידקים חיים באמצעות חבילה של כתבים פלואורסצנטיים המצומדים לטרנספוזיציה. בפרט, הוא מדגים כיצד ניתן להשתמש בהדמיה בזמן אמת כדי להעריך את ההשפעות של חלבון האביזר TnpB על הפעילות של האלמנט הניתן להעברה IS608, חבר במשפחת IS200/IS605 של אלמנטים הניתנים להעברה. משפחת IS200/IS605 של יסודות הניתנים להעברה הם שפע של יסודות ניידים המחוברים לאחד הגנים הרבים ביותר שנמצאו בטבע, tnpB. הומולוגיות של רצף מציעות כי חלבון TnpB עשוי להיות קודמן אבולוציוני למערכות CRISPR/Cas9. בנוסף, TnpB זכה להתעניינות מחודשת, לאחר שהוכח כי הוא פועל כאנדונוקלאז דנ"א מונחה RNA דמוי Cas. ההשפעות של TnpB על שיעורי הטרנספוזיציה של IS608 ניתנות לכימות, והוכח כי הביטוי של TnpB של IS608 גורם לפעילות טרנספוזון מוגברת של ~5x בהשוואה לתאים ללא ביטוי TnpB.

Introduction

אלמנטים הניתנים להעברה (TEs) הם אלמנטים גנטיים המתגייסים בתוך הגנום המארח שלהם על ידי כריתה או זירוז העתקה ואחריה שילוב מחדש של גנום. TEs קיימים בכל תחומי החיים, והטרנספוזיציה בונה מחדש את הגנום המארח, תוך מוטציה של אזורי קידוד ובקרה1. זה יוצר מוטציות ומגוון שממלאים תפקיד חשוב באבולוציה2,3, התפתחות 4,5, וכמה מחלות אנושיות6, כולל סרטן7.

באמצעות מבנים גנטיים חדשניים שמצמידים היבטים של פעילות טרנספוזיציונית לכתבים פלואורסצנטיים, העבודה הקודמת שלנו תיארה את הפיתוח של מערכת ניסיונית המבוססת על TE IS608 החיידקי, נציג של משפחת ה-TEs הנפוצה IS200/IS605, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של טרנספוזיציה בתאים חיים בודדים8 (איור 1). מערכת TE מוצגת באיור 1A. ה- TE כולל את רצף קידוד הטרנספוזאז, tnpA, ולצדו קצה שמאלי (LE) וקצה ימין (RE) חזרות פלינדרומיות לא מושלמות (IP), שהן אתרי הזיהוי והכריתה עבור TnpA. tnpA מבוטא באמצעות מקדם PLTetO1, אשר מודחק על ידי מדכא tet והוא inducible עם anhydrotetracycline (aTc)9. ה- TE מפצל את הרצפים -10 ו- -35 של מקדם PlacIQ1 מכונן10 עבור הכתב הכחול mCerulean311. כפי שניתן לראות באיור 1C, כאשר הייצור של tnpA מושרה, ניתן לכרות את ה-TE, מה שמוביל לשיקום המקדם. התא המיוצר מבטא mCerulean3 ופלואורסצנטי כחול. N-terminus של TnpA מתמזג עם הכתב הצהוב ונוס12, ומאפשר מדידה של רמות TnpA על ידי פלואורסצנציה צהובה.

IS608 וחברים אחרים במשפחת הטרנספוזונים IS200/IS605 מקודדים בדרך כלל גם גן שני של הפונקציה הלא ידועה עד כה, tnpB13. חלבוני TnpB הם משפחה שופעת מאוד אך מאופיינת באופן לא מושלם של נוקלאזות המקודדות על ידי מספר TEs 14,15 חיידקי וארכאי, שלעתים קרובות מורכבים מ-tnpB16 בלבד. יתר על כן, מחקרים אחרונים חידשו את העניין ב-TnpB בכך שמצאו כי TnpB מתפקד כאנדונוקלאז מונחה RNA מונחה קריספר/Cas הניתן לתכנות אשר יניב הפסקות dsDNA או ssDNA בתנאים מגוונים17,18. עם זאת, עדיין לא ברור איזה תפקיד TnpB עשוי למלא בוויסות הטרנספוזיציה. כדי לבצע הדמיה בזמן אמת של ההשפעות של TnpB על טרנספוזיציה של IS608, נוצרה גרסה של הטרנספוזון, כולל אזור הקידוד של TnpB עם היתוך N-מסוף לחלבון הפלואורסצנטי האדום mCherry.

כהשלמה למחקרים מפורטים יותר ברמת תפזורת שבוצעו על ידי מעבדת Kuhlman19, הוא הראה כאן כיצד הדמיה בזמן אמת של פעילות טרנספוזון יכולה לחשוף באופן כמותי את ההשפעה של TnpB או כל חלבון עזר אחר על דינמיקה טרנספוזיציונית. על ידי מיזוג TnpB ל-mCherry, האירועים הטרנספוזיציוניים הבודדים מזוהים על ידי פלואורסצנציה כחולה ומתואמים עם רמות הביטוי של TnpA (פלואורסצנציה צהובה) ו- TnpB (פלואורסצנציה אדומה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תרביות חיידקים

  1. לגדל זן E. coli MG1655 עם מבנים טרנספוזונים פלסמידים (שתוארו בעבר ב- Kim et al.8) בן לילה ב- LB עם האנטיביוטיקה המתאימה (25 מיקרוגרם / מ"ל של קנאמיצין, ראה טבלת חומרים) ב 37 °C.
    הערה: הרצפים של המבנים המשמשים והרצפים הקשורים זמינים כמספרי ההצטרפות של GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 ו- OP717085.
  2. כדי להשיג צמיחה אקספוננציאלית במצב יציב, יש לדלל תרביות ≥100 פעמים לתוך המדיום M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0.5 מיקרוגרם/מ"ל תיאמין [ויטמין B1]) בתוספת מקור פחמן (0.5% w/v גלוקוז כאן) ואנטיביוטיקה מתאימה (ראו טבלת חומרים).
  3. לגדל תרביות ב 37 °C עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר (OD600) מגיע ~ 0.2. התרבויות מוכנות לשימוש.

2. הכנת שקופיות

  1. הכינו שקופית על ידי הרתחת M63 עם 0.5% גלוקוז w/v ו-1.5% w/v agarose במיקרוגל כדי להמיס את האגרוז ולוודא שהוא מותך לחלוטין ומעורבב היטב.
  2. יש לתת לתערובת להתקרר ל~55°C לפני הוספת אנטיביוטיקה וגורמים מעוררים (25 מיקרוגרם/מ"ל קנאמיצין ו-10 ננוגרם/מיקרול אנהידרו-טטרציקלין [aTc], ראו טבלת חומרים).
  3. הנח שקופית מיקרוסקופ על שולחן העבודה. ערמו שתי שקופיות נוספות בניצב לראשון והניחו שקופית נוספת למעלה, במקביל לשקופית התחתונה. ודא שיש רווח השווה לעובי שקופית אחת בין השקופיות התחתונות והעליונות. פיפטה ~ 1 מ"ל של תערובת אגרוז M63 לתוך הפער הזה בין השקופיות לאט לאט כדי ליצור ריבוע ג'ל קטן.
  4. לאחר שהג'ל התמצק (~10-15 דקות), החלק את השקופית העליונה כדי להסיר אותו. גזרו את כרית האגרוז בעזרת סכין גילוח או סכין. ואז פיפטה 2.5 μL של התרבית (שלב 1.3) ולשים את כיסוי על גבי.
  5. אטמו את הרווח בין המגלשה למכסה באמצעות אפוקסי (ראו טבלת חומרים). תנו לאפוקסי להתייבש ולתאים להתיישב על כרית האגרוז למשך שעה אחת לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.

3. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר

  1. הניחו את הדגימה המוכנה (שלב 1.3) על מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) בסביבה מחוממת ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    1. הגדר את זמני החשיפה המתאימים למצלמה המשמשת לרכישת תמונה. כוונן את עוצמת התאורה כדי למזער את הלבנת התמונות.
      הערה: זמן חשיפה של 2 שניות לכל אורך גל שימש במחקר הנוכחי.
    2. עבור כל אורך גל, מצא שדה ראייה (FOV) המכיל פלואורסצנטיות מינימלית. רכוש תמונות לשימוש במהלך הניתוח לחיסור רקע.
  2. הגדר פרוטוקול להשגת תמונות ברשת באורכי גל שונים ובמרווחי זמן קבועים.
    1. קידוד צילום בהילוך מהיר לפרוטוקול. הגדר את תדירות הרכישה למרווח הזמן הרצוי (20 דקות כאן) ואת משך הזמן הכולל לאורך הרצוי (24 שעות).
    2. קידוד אורכי גל מתאימים לפרוטוקול (בהתאם למבנה שבו נעשה שימוש).
      הערה: שיא העירור mCherry הוא ב-587 ננומטר ושיא הפליטה ב-610 ננומטר21; mVenus הוא ב 515 ננומטר ו 527 ננומטר12, בעוד mCerulean3 הוא ב 433 ננומטר ו 475 ננומטר11.
    3. הגדר את גודל הרשת כדי ללכוד בין המספר הרצוי של FOVs.
      הערה: הנתונים המייצגים המוצגים כאן השתמשו ב- 8 x 8 FOVs.

4. ניתוח תמונות

  1. בצע חיסור רקע בכל ערוץ צבע באמצעות תמונות הרקע המתאימות שנרכשו בשלב 3.1.2. עבור כל שלבי הניתוח, אנו משתמשים במודולים סטנדרטיים בפלטפורמת הקוד הפתוח פיג'י22 (ראה טבלת חומרים).
  2. הערך את האוכלוסייה הכוללת בכל נקודת זמן על-ידי ספיגת ערוץ mCerulean וחלוקת אזור הסף באזור התא הממוצע.
  3. כדי לספור את אירועי הכריתה הייחודיים, קח את נגזרת הזמן של ערוץ mCerulean3. בצע זאת על-ידי חיסור תמונות עוקבות בערוץ mCerulean3. אירועי הכריתה יזוהו בנגזרת הזמן כהבזק בהיר של פלואורסצנציה.
    1. סף את ערימת אירועי הכריתה כדי למנוע פלואורסצנטיות לא רצויה. שים לב שתהליך זה יסתום חלקים מהכריתות עצמן. כדי לתקן זאת, הרחיבו את התמונות כדי לשחזר את הכריתות לגודלן המקורי.
      הערה: ניתוחים באמצעות טכניקות דומות של ספיגה וניתוח תמונה יכולים להתבצע גם בערוצי הפלואורסצנציה האחרים (לדוגמה, קורלציה בין אירועי כריתה לבין רמות של טרנספוזאז TnpA [פלואורסצנציה של ונוס צהוב] ו- TnpB [פלואורסצנציה של mCherry אדום].

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שיטה זו של הדמיה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, תוך תפוקה נמוכה יותר מאשר מדידות פלואורסצנטיות בתפזורת, מאפשרת הדמיה ישירה של פעילות טרנספוזון בתאים חיים בודדים. אירועי כריתה של טרנספוזון גורמים לבנייה מחדש של מקדם ה-mCerulean3 (איור 1), מה שמאפשר זיהוי של תאים שעוברים טרנספוזון על-ידי פלואורסצנציה כחולה בהירה (איור 2, TnpB+: סרט משלים 1 ו-TnpB-: סרט משלים 2).

נמצא כי תאים המבטאים את חלבון העזר TnpB (איור 3, כתום) חווים רמות גבוהות פי 4-5 של פעילות טרנספוזון בהשוואה לאלה שאינם חווים (איור 3, כחול), בהתאם למחקרים המפורטים יותר ברמת תפזורת19. זה בולט במיוחד מכיוון שהכללת רצף הקידוד של mCherry-tnpB מגדילה את אורך הטרנספוזון ב~2,000 bp, בעוד שמחקרים קודמים מצאו כי כריתת טרנספוזון IS608 היא פונקציה פוחתת באופן אקספוננציאלי של אורך טרנספוזון23.

יתרון של הדמיה בזמן אמת הוא שלאחר הזיהוי, ניתן לעקוב ולנתח תאים העוברים אירועים טרנספוזיציוניים כדי לקבוע פרמטרים אופייניים אחרים, כגון קצב גדילה, כדי לקבוע את התפלגות השפעות הכושר או את רמת הביטוי של חלבוני עזר כדי לקבוע את השפעתם על הפעילות הטרנספוזיציונית. לדוגמה, בתאי TnpB+, לתאים שעוברים אירועי כריתה של טרנספוזון יש רמות ביטוי גבוהות יותר של mCherry-TnpB מאשר באוכלוסייה הכללית (איור 4A). יתר על כן, עבור תאים שעוברים אירועי כריתה (איור 4B, צהוב כהה), תאי TnpB+ (איור 4B, למטה) מבטאים רק רמות גבוהות יותר באופן שולי של טרנספוזאז Venus-TnpA מאשר תאי TnpB (איור 4B, למעלה) (TnpB- 158.3 ± 68.2 AU, TnpB+: 193 ± 79.9 AU), שהיא גבוהה יותר מהפלואורסצנטיות הצהובה של האוכלוסייה הכללית (איור 4B צהוב בהיר)., יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שחלבון TnpB אחראי לרמות הגבוהות יותר שנצפו של פעילות טרנספוזיציונית.

Figure 1
איור 1: מבנים גנטיים להדמיה של דינמיקה טרנספוזונית בזמן אמת. (A) מקדם mCerulean3 מופרע על ידי ה-TE, שקצותיו מוקפים על ידי רצפים פלינדרומיים פגומים בקצה השמאלי ובקצה הימני (LE IP ו-RE IP). הטרנספוזאז, tnpA (אפור), מבוטא מ-PLtetO1, המווסת על ידי מדכא ה-tet (אפור) וניתן להשראה עם אנהידרו-טטרציקלין (aTc). הרצפים של רצפי צומת Promoter/TE ו-מקדם -10 ו--35 (תיבות אדומות), ואתרי ביקוע TnpA מוצגים על-ידי חצים. (B) מבנה TnpB+ הוא המקום שבו mCherry-tnpB התמזג באופן שעתוק לוונוס-tnpA כך ששניהם מתועתקים כ-mRNA פוליציסטרוני, המחקה את התצורה הטבעית של IS608. (C) עם הכריתה, מקדם mCerulean3 מתוקן, והתא מציג פלואורסצנציה כחולה. רצף המקדמים המשוחזר מוצג מתחת לתרשים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: הדמיה של אירועי כריתת טרנספוזון. שדה הראייה לדוגמה של TnpB+ עם תאים (A) מיד לפני ו- (B) לאחר גילוי אירועי כריתה של טרנספוזון על ידי פלואורסצנציה כחולה. חצים לבנים מציינים אירועי כריתה. הפרש הזמן בין שתי המסגרות הוא 20 דקות. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: TnpB משפר את קצב כריתת הטרנספוזון. קצב הכריתה של תאי TnpB+ (כתום) ותאי TnpB (כחולים). השיעור הממוצע משלושה משוכפלים מוצג כנקודות עם אזורים מוצלים עם רווח בר-סמך של 95%. הנתונים מיושרים כך שהתאים מתחילים לכרות ב- t = 0. הקצב המרבי שנמדד עבור תאי TnpB+ היה 5.1 ± 2.4 x 10-2 אירועים לתא לשעה, ואילו עבור TnpB - היה 1.4 ± 0.48 x 10-2 אירועים לתא לשעה. הקצב הממוצע לאורך כל המרווח שהוצג היה 2.6 ± 1.8 x 10-2 אירועים לתא לשעה עבור תאי TnpB+ ו-5.3 ± 2.9 x 10-3 אירועים לתא לשעה עבור תאי TnpB. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סטטיסטיקה של ביטוי חלבונים עבור כריתת תאים לעומת אוכלוסיית התאים הכוללת. כל מסגרת חולקה ל-64 בלוקים שווים, ופלואורסצנטיות נמדדה עבור תאים שנכרתו בתוך הבלוק ועבור כל התאים הכלולים בתוך הבלוק ללא קשר לפעילות הכריתה. ההסתברות, כפי שהיא משורטטת על ציר y, נמדדת כמספר הפיקסלים של העוצמה המצוינת בכל סוג תא חלקי המספר הכולל של הפיקסלים. גודל הבלוק עבור כל מסגרת נקבע על 445 x 445 פיקסלים. (A) התאים שעוברים אירועי כריתה (אדום כהה) מבטאים יותר TnpB מאשר האוכלוסייה הכללית (אדום בהיר). הממוצע הפלואורסצנטי האדום לכריתת תאים היה 51.3 ± 15.4 AU (אדום כהה), בעוד זה עבור כל התאים היה 42.5 ± 7.4 AU (אדום בהיר). (B) רמות הטרנספוזאז של ונוס-TnpA דומות בתאי TnpB (למעלה) ו-TnpB+ (למטה). מערכי הנתונים מנורמלים כך שהפלואורסצנטיות הצהובות הממוצעות של אוכלוסיית התאים הכוללת (צהוב בהיר) שוות עבור TnpB+/- ב- 105.7 AU. התאים שזוהו כעוברים אירועי כריתה טרנספוזונים (צהוב כהה) מפגינים פלואורסצנטיות צהובה גבוהה יותר מאשר האוכלוסייה הכללית, עם התפלגויות דומות עבור TnpB- (למעלה) ו- TnpB+ (למטה). פלואורסצנטיות צהובות ממוצעות של אוכלוסיות הכריתה הן TnpB-: 158.3 ± 68.2 AU ו- TnpB+: 193 ± 79.9 AU. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

סרט משלים 1: דינמיקה בזמן אמת של כריתת IS608 עם ביטוי TnpB. סרט המציג קטע של 5 שעות של דינמיקת IS608 בזמן אמת; מסגרת נלכדת כל 20 דקות. כריתת IS608 מוצגת באופן חזותי כהתפתחות של פלואורסצנציה כחולה בהירה. התאים המוצגים בסרט זה כוללים את הביטוי של TnpB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים 2: דינמיקה בזמן אמת של כריתת IS608 ללא ביטוי TnpB. סרט המציג קטע של 5 שעות של דינמיקת IS608 בזמן אמת; מסגרת נלכדת כל 20 דקות. כריתת IS608 מוצגת באופן חזותי כהתפתחות של פלואורסצנציה כחולה בהירה. התאים המוצגים בסרט זה אינם כוללים את הביטוי TnpB. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה הייחודית המוצגת כאן להדמיה בזמן אמת של פעילות אלמנטים הניתנים להעברה בתאים חיים היא בדיקה רגישה שיכולה לזהות ישירות טרנספוזיציה בתאים חיים ובזמן אמת ולתאם פעילות זו עם ביטוי של חלבונים נלווים. בעוד שהתפוקה נמוכה מכפי שניתן להשיג בשיטות בתפזורת, שיטה זו משיגה מדידות מפורטות של פעילות TE וביטוי חלבונים בתאים חיים בודדים.

ניתן להשתמש במגוון כלים וטכניקות כדי לגדל תאים ישירות במיקרוסקופ לצורך הדמיה בזמן אמת. השיטה המשמשת כאן של גידול תאים על רפידות agarose יש את היתרון של להיות מהיר, זול, וקל לביצוע. חיסרון אפשרי, בהתאם למצב הגדילה התאית המעניין, הוא שהמשאבים הזמינים לתמיכה בגדילת התאים במשטח האגרוז מוגבלים, ולכן התאים ימצשו באופן טבעי את המשאבים הללו ויפסיקו לגדול לאחר פרק זמן קצר יחסית (12-24 שעות). כתוצאה מכך, יש להקפיד להכין את התאים בגדילה במצב יציב ולחסן את הפד בצפיפות נמוכה מספיק כדי לתת מספיק זמן למדידה. ניתן להשתמש במיקרופלואידיקה כדי לשמור על תאים בגדילה אקספוננציאלית במצב יציב לפרקי זמן ממושכים24, אם כי שיטות אלה דורשות מומחיות, ציוד והתקנה נוספים כדי להיות יעילות.

כהשלמה לעבודה מפורטת יותר ממעבדת קולמן19, מומחש כאן כי החלבון TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 TE מעלה את קצב הכריתה של IS608 עד פי חמישה, וכי כריתה מוגברת נמצאת בקורלציה ישירה עם רמות ביטוי גבוהות יותר של TnpB. שיטות אלה הן דוגמה אחת לטכניקות בדיקה משופרות שעשויות לסייע לשפוך אור על פעילות טרנספוזון והשפעתה על הדינמיקה המוטציונית והאבולוציונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

Acknowledgments

תמיכה כספית למחקר זה ניתנה על ידי קרנות סטארט-אפ מאוניברסיטת קליפורניה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 Ton Clear Epoxy Devcon 31345
Agarose Sigma-Aldrich 5066
Ammonium sulfate Sigma-Aldrich AX1385-1
Anhydrotetracycline hydrochloride Sigma-Aldrich 37919
Argon Laser Melles Griot 35-IMA-840-015
Blue Filter Cube Chroma Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M
D(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Eclipse Ti-E Microscope Nikon Discontinued
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) Eppendorf North America Biotools 22491504
Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) Eppendorf North America Biotools 22491555
Ferrous Sulfate Acs 500 g Fisher Scientific 706834
Fiji Fiji (imagej.net)
Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) Fisher Scientific BP9723-2 
Glass Cover Slide Fisher Scientific 12-542B 
Kanamycin Sulfate Sigma-Aldrich 1355006
Magnesium sulfate Cert Ac Fisher Scientific XXM63SP3KG
Microscope Heater World Precision Instruments 96810-1
Potassium Phosphate Monobasic Fisher Scientific 17001H
ProScan III Stage Prior
Red Filter Cube Chroma Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M
Sapphire 561 LP Laser Coherent 1170412
Slide, Microscope Fisher Scientific 125535B
Thiamine Hydrochloride Sigma-Aldrich (SIAL) T1270-100G
Ti-LU4 Laser Launch Nikon
Yellow Filter Cube Chroma Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
  2. Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
  3. Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
  4. Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
  5. Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
  6. Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
  7. Goodier, J. L. Retrotransposition in tumors and brains. Mobile DNA. 5, 11 (2014).
  8. Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
  9. Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
  10. Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
  11. Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
  12. Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
  13. Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
  14. Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
  15. Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
  16. Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
  17. Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
  18. Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
  19. Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
  20. Benson, D. A., et al. GenBank. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 36-42 (2013).
  21. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
  24. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Current Biology. 20 (12), 1099-1103 (2010).

Tags

ביולוגיה גיליון 191
כימות בזמן אמת של ההשפעות של TnpB הקשור למשפחת IS200/IS605 על פעילות טרנספוזון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman,… More

Worcester, M., Manoj, F., Kuhlman, T. E. Real-Time Quantification of the Effects of IS200/IS605 Family-Associated TnpB on Transposon Activity. J. Vis. Exp. (191), e64825, doi:10.3791/64825 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter