Summary
Se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo en tiempo real para cuantificar cómo la proteína accesoria TnpB afecta la dinámica de transposición en células vivas individuales de Escherichia coli .
Abstract
Aquí, se describe un protocolo para realizar imágenes en vivo y en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células bacterianas vivas utilizando un conjunto de reporteros fluorescentes acoplados a la transposición. En particular, demuestra cómo se pueden utilizar las imágenes en tiempo real para evaluar los efectos de la proteína accesoria TnpB sobre la actividad del elemento transponible IS608, un miembro de la familia de elementos transponibles IS200/IS605. La familia de elementos transponibles IS200/IS605 son elementos móviles abundantes conectados con uno de los genes más innumerables que se encuentran en la naturaleza, tnpB. Las homologías de secuencia proponen que la proteína TnpB puede ser un precursor evolutivo de los sistemas CRISPR/Cas9. Además, TnpB ha recibido un renovado interés, habiéndose demostrado que actúa como una endonucleasa de ADN guiada por ARN similar a Cas. Se cuantifican los efectos de TnpB en las tasas de transposición de IS608, y se demuestra que la expresión de TnpB de IS608 da como resultado ~ 5 veces mayor actividad de transposones en comparación con las células que carecen de expresión de TnpB.
Introduction
Los elementos transponibles (ET) son elementos genéticos que se movilizan dentro de sus genomas del huésped por escisión o copia catalizada seguida de reintegración genómica. Los TE existen en todos los dominios de la vida, y la transposición reestructura el genoma del huésped, mutando las regiones codificantes y de control1. Esto genera mutaciones y diversidad que juegan un papel importante en la evolución2,3, el desarrollo4,5 y varias enfermedades humanas6, incluyendo el cáncer7.
Utilizando nuevas construcciones genéticas que acoplan aspectos de la actividad transposicional a reporteros fluorescentes, nuestro trabajo anterior describió el desarrollo de un sistema experimental basado en el TE IS608 bacteriano, un representante de la familia generalizada de TE IS200 / IS605, que permite la visualización en tiempo real de la transposición en células vivas individuales8 (Figura 1). El sistema TE se muestra en la Figura 1A. El TE comprende la secuencia codificante de transposasa, tnpA, flanqueada por repeticiones palindrómicas imperfectas (IPs) del extremo izquierdo (LE) y del extremo derecho (RE), que son los sitios de reconocimiento y escisión para TnpA. La tnpA se expresa utilizando el promotor PLTetO1, que es reprimido por el represor tet y es inducible con anhidrotetraciclina (aTc)9. El TE divide las secuencias -10 y -35 de un promotor constitutivo PlacIQ1 10 para el reportero azul mCerulean311. Como se muestra en la Figura 1C, cuando se induce la producción de tnpA, el TE puede ser extirpado, lo que lleva a la reconstitución del promotor. La célula producida expresa mCerulean3 y fluoresce azul. El extremo N de TnpA está fusionado con el reportero amarillo Venus12, lo que permite la medición de los niveles de TnpA por fluorescencia amarilla.
IS608 y otros miembros de la familia de transposones IS200/IS605 también codifican típicamente un segundo gen de la función hasta ahora desconocida, tnpB13. Las proteínas TnpB son una familia de nucleasas tremendamente abundantes pero imperfectamente caracterizadas codificadas por varias ETs bacterianas y arqueales 14,15, que a menudo consisten solo en tnpB16. Además, estudios recientes han renovado el interés en TnpB al encontrar que TnpB funciona como una endonucleasa guiada por ARN programable similar a CRISPR / Cas que producirá roturas de dsDNA o ssDNA en diversas condiciones17,18. Sin embargo, no está claro qué papel puede desempeñar TnpB en la regulación de la transposición. Para realizar la visualización en tiempo real de los efectos de TnpB en la transposición de IS608, se creó una versión del transposón, incluida la región codificante de TnpB con una fusión N-terminal a la proteína fluorescente roja mCherry.
Complementando estudios más detallados a nivel de masa realizados por el laboratorio de Kuhlman19, se muestra aquí cómo las imágenes en tiempo real de la actividad de transposones pueden revelar cuantitativamente el impacto de TnpB o cualquier otra proteína accesoria en la dinámica transposicional. Al fusionar TnpB con mCherry, los eventos transposicionales individuales se identifican por fluorescencia azul y se correlacionan con los niveles de expresión de TnpA (fluorescencia amarilla) y TnpB (fluorescencia roja).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de cultivos bacterianos
- Cultivar la cepa MG1655 de E. coli con construcciones de transposones plásmidos (descritas previamente en Kim et al.8) durante la noche en LB con los antibióticos apropiados (25 μg/ml de kanamicina, ver Tabla de materiales) a 37 °C.
NOTA: Las secuencias de los constructos utilizados y las secuencias relacionadas están disponibles como GenBank20 números de acceso OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 y OP717085. - Para lograr un crecimiento exponencial en estado estacionario, los cultivos diluidos ≥100 veces en el medio M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1.8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2 SO 4, 0.5 μg / ml tiamina [vitamina B1]) suplementados con una fuente de carbono (0.5% p/v glucosa aquí) y antibióticos apropiados (ver Tabla de materiales).
- Cultivar cultivos a 37 °C hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) alcance ~0.2. Las culturas están listas para su uso.
2. Preparación de la diapositiva
- Prepare un portaobjetos hirviendo M63 con 0,5% p/v de glucosa y 1,5% p/v de agarosa en el microondas para derretir la agarosa y asegurarse de que esté completamente fundida y bien mezclada.
- Deje que la mezcla se enfríe a ~55 °C antes de agregar antibióticos e inductores (25 μg/ml de kanamicina y 10 ng/μl de anhidrotetraciclina [aTc], ver Tabla de materiales).
- Coloque un portaobjetos de microscopio en el banco de trabajo. Apila dos diapositivas más perpendiculares a la primera y coloca otra en la parte superior, paralela a la diapositiva inferior. Asegúrese de que haya un espacio igual a un grosor de diapositiva entre las diapositivas inferior y superior. Pipetea ~1 ml de la mezcla de agarosa M63 en este espacio entre las diapositivas lentamente para crear un pequeño cuadrado de gel.
- Una vez que el gel se haya solidificado (~10-15 min), deslice el portaobjetos superior para retirarlo. Recorte la almohadilla de agarosa con una hoja de afeitar o un cuchillo. A continuación, pipetear 2,5 μL del cultivo (paso 1.3) y colocar el cubreobjetos encima.
- Selle el espacio entre la diapositiva y el cubreobjetos con epoxi (consulte la Tabla de materiales). Dejar secar el epoxi y que las células se depositen en la almohadilla de agarosa durante al menos 1 h a 37 °C.
3. Microscopía de fluorescencia timelapse
- Colocar la muestra preparada (paso 1.3) en un microscopio de fluorescencia (véase la Tabla de materiales) en un ambiente calentado y mantenido a 37 °C.
- Establezca los tiempos de exposición apropiados para la cámara utilizada para la adquisición de imágenes. Ajuste la intensidad de la iluminación para minimizar el fotoblanqueo.
NOTA: Para el presente estudio se utilizó un tiempo de exposición de 2 s para cada longitud de onda. - Para cada longitud de onda, encuentre un campo de visión (FOV) que contenga una fluorescencia mínima. Adquiera imágenes para usar durante el análisis para la sustracción de fondo.
- Establezca los tiempos de exposición apropiados para la cámara utilizada para la adquisición de imágenes. Ajuste la intensidad de la iluminación para minimizar el fotoblanqueo.
- Configure un protocolo para adquirir imágenes en una cuadrícula en diferentes longitudes de onda y en intervalos de tiempo regulares.
- Codifica la fotografía timelapse en el protocolo. Establezca la frecuencia de adquisición en el intervalo de tiempo deseado (20 minutos aquí) y la duración total del lapso de tiempo en la duración deseada (24 h).
- Codifique las longitudes de onda apropiadas en el protocolo (dependiendo de la construcción utilizada).
NOTA: El pico de excitación mCherry está en 587 nm y el pico de emisión en 610 nm21; mVenus está en 515 nm y 527 nm12, mientras que mCerulean3 está en 433 nm y 475 nm11. - Establezca el tamaño de la cuadrícula para capturar entre el número deseado de FOV.
NOTA: Los datos representativos que se muestran aquí utilizaron 8 x 8 FOV.
4. Análisis de imágenes
- Realice la sustracción de fondo en cada canal de color utilizando las imágenes de fondo respectivas adquiridas en el paso 3.1.2. Para todos los pasos de análisis, utilizamos módulos estándar en la plataforma de código abierto Fiji22 (ver Tabla de materiales).
- Aproximar la población total en cada punto en el tiempo mediante el umbral del canal mCerulean y dividiendo el área umbral por el área celular promedio.
- Para contar los eventos de escisión únicos, tome la derivada de tiempo del canal mCerulean3. Realice esto restando imágenes sucesivas en el canal mCerulean3. Los eventos de escisión se detectarán en la derivada temporal como un destello brillante de fluorescencia.
- Umbralice la pila de eventos de escisión para eliminar la fluorescencia no deseada. Tenga en cuenta que este proceso eliminará partes de las escisiones en sí. Para solucionar esto, dilate las imágenes para restaurar las escisiones a sus tamaños originales.
NOTA: También se pueden realizar análisis que utilizan técnicas similares de umbralización y análisis de imágenes en los otros canales de fluorescencia (por ejemplo, correlacionar los eventos de escisión con los niveles de transposasa TnpA [fluorescencia amarilla de Venus] y TnpB [fluorescencia mCherry roja].
- Umbralice la pila de eventos de escisión para eliminar la fluorescencia no deseada. Tenga en cuenta que este proceso eliminará partes de las escisiones en sí. Para solucionar esto, dilate las imágenes para restaurar las escisiones a sus tamaños originales.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este método de visualización de la actividad del transposón en células vivas mediante microscopía de fluorescencia, aunque tiene un rendimiento más bajo que las mediciones de fluorescencia a granel, permite la visualización directa de la actividad del transposón en células vivas individuales. Los eventos de escisión de transposones resultan en la reconstitución del promotor para mCerulean3 (Figura 1), permitiendo la identificación de células sometidas a actividad transposónica por fluorescencia azul brillante (Figura 2, TnpB+: Película suplementaria 1 y TnpB-: Película complementaria 2).
Se encuentra que las células que expresan la proteína accesoria TnpB (Figura 3, naranja) experimentan niveles 4-5 veces más altos de actividad de transposones en comparación con aquellas que no lo hacen (Figura 3, azul), consistente con los estudios más detallados a nivel de masa19. Esto es particularmente notable ya que la inclusión de la secuencia codificante de mCherry-tnpB aumenta la longitud del transposón en ~ 2,000 pb, mientras que estudios previos han encontrado que la escisión de transposones IS608 es una función exponencialmente decreciente de la longitud del transposón23.
Una ventaja de las imágenes en tiempo real es que una vez identificadas, las células que experimentan eventos transposicionales pueden ser rastreadas y analizadas para determinar otros parámetros característicos, como la tasa de crecimiento, para determinar la distribución de los efectos de aptitud o el nivel de expresión de las proteínas accesorias para determinar su impacto en la actividad transposicional. Por ejemplo, en las células TnpB+, las células sometidas a eventos de escisión de transposones tienen niveles de expresión más altos de mCherry-TnpB que la población general (Figura 4A). Además, para las células sometidas a eventos de escisión (Figura 4B, amarillo oscuro), las células TnpB+ (Figura 4B, abajo) expresan solo niveles marginalmente más altos de transposasa Venus-TnpA que las células TnpB- (Figura 4B, arriba) (TnpB- 158.3 ± 68.2 UA, TnpB +: 193 ± 79.9 UA), que es más alta que la fluorescencia amarilla de la población general (Figura 4B , amarillo claro). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la proteína TnpB es responsable de los niveles más altos observados de actividad transposicional.
Figura 1: Construcciones genéticas para la obtención de imágenes de la dinámica del transposón en tiempo real. (A) El promotor mCerulean3 es interrumpido por el TE, cuyos extremos están flanqueados por el extremo izquierdo y el extremo derecho secuencias palindrómicas defectuosas (LE IP y RE IP). La transposasa, tnpA (gris), se expresa a partir de PLtetO1, que está regulado por el represor tet (gris) y es inducible con anhidrotetraciclina (aTc). Las secuencias de la unión promotor/TE y las secuencias promotor -10 y -35 (cuadros rojos), y los sitios de escisión TnpA se muestran mediante flechas. (B) La construcción TnpB+ es donde mCherry-tnpB se ha fusionado transcripcionalmente a venus-tnpA de tal manera que ambos se transcriben como un ARNm policistrónico, imitando la configuración natural de IS608. (C) Tras la escisión, el promotor mCerulean3 se repara, y la célula exhibe fluorescencia azul. La secuencia promotora reconstituida se muestra debajo del diagrama. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visualización de eventos de escisión de transposones. El ejemplo de campo de visión de TnpB+ con células (A) inmediatamente antes y (B) después de detectar eventos de escisión de transposones por fluorescencia azul. Las flechas blancas indican eventos de escisión. La diferencia de tiempo entre los dos fotogramas es de 20 min. Barra de escala = 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: TnpB mejora la tasa de escisión de transposones. La tasa de escisión para las células TnpB+ (naranja) y TnpB- (azules). La tasa media de tres réplicas se muestra como puntos con regiones sombreadas con un intervalo de confianza del 95%. Los datos están alineados para que las células comiencen a extirparse en t = 0. La tasa máxima medida para las células TnpB+ fue de 5,1 ± 2,4 x 10-2 eventos por célula por hora, mientras que para las células TnpB- fue de 1,4 ± 0,48 x 10-2 eventos por célula por hora. La tasa promedio durante todo el intervalo mostrado fue de 2.6 ± 1.8 x 10-2 eventos por celda por hora para las células TnpB + y 5.3 ± 2.9 x 10-3 eventos por celda por hora para las células TnpB-. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Estadísticas de expresión de proteínas para células de escisión versus población celular total. Cada marco se dividió en 64 bloques iguales, y se midió la fluorescencia para las células que se extirpan dentro del bloque y para todas las células contenidas dentro del bloque, independientemente de la actividad de escisión. La probabilidad, tal como se representa en el eje y, se mide como el número de píxeles de la intensidad indicada en cada tipo de celda dividido por el número total de píxeles. El tamaño de bloque para cada fotograma se estableció en 445 x 445 píxeles. (A) Las células que sufren eventos de escisión (rojo oscuro) expresan más TnpB que la población general (rojo claro). La fluorescencia roja promedio para las células de escisión fue de 51,3 ± 15,4 UA (rojo oscuro), mientras que para todas las células fue de 42,5 ± 7,4 UA (rojo claro). (B) Los niveles de transposasa Venus-TnpA son similares en las células TnpB- (arriba) y TnpB+ (abajo). Los conjuntos de datos se normalizan de modo que las fluorescencias amarillas medias de la población celular total (amarillo claro) son iguales para TnpB +/- a 105.7 UA. Las células que han sido identificadas como sometidas a eventos de escisión de transposones (amarillo oscuro) exhiben una fluorescencia amarilla más alta que la población general, con distribuciones similares para TnpB- (arriba) y TnpB + (abajo). Las fluorescencias amarillas medias de las poblaciones extirpadoras son TnpB-: 158,3 ± 68,2 UA y TnpB+: 193 ± 79,9 UA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película complementaria 1: Dinámica en tiempo real de la escisión IS608 con expresión TnpB. Una película que muestra un segmento de 5 h de la dinámica IS608 en tiempo real; se captura un fotograma cada 20 minutos. La escisión IS608 se visualiza como el desarrollo de la fluorescencia azul brillante. Las celdas que se muestran en esta película incluyen la expresión de TnpB. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Película complementaria 2: Dinámica en tiempo real de la escisión IS608 sin expresión de TnpB. Una película que muestra un segmento de 5 h de la dinámica IS608 en tiempo real; se captura un fotograma cada 20 minutos. La escisión IS608 se visualiza como el desarrollo de la fluorescencia azul brillante. Las celdas que se muestran en esta película no incluyen la expresión de TnpB. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El método único presentado aquí para obtener imágenes en tiempo real de la actividad de elementos transponibles en células vivas es un ensayo sensible que puede detectar directamente la transposición en células vivas y en tiempo real y correlacionar esta actividad con la expresión de proteínas accesorias. Si bien el rendimiento es menor que el que se puede lograr con métodos a granel, este método logra mediciones detalladas de la actividad de TE y la expresión de proteínas en células vivas individuales.
Se puede emplear una variedad de herramientas y técnicas para cultivar células directamente en el microscopio para obtener imágenes en tiempo real. El método utilizado aquí de crecimiento celular en almohadillas de agarosa tiene la ventaja de ser rápido, barato y fácil de realizar. Una posible desventaja, dependiendo del estado de interés del crecimiento celular, es que los recursos disponibles para apoyar el crecimiento celular en la almohadilla de agarosa son limitados y, por lo tanto, las células agotarán naturalmente estos recursos y dejarán de crecer después de un período de tiempo relativamente corto (12-24 h). En consecuencia, se debe tener cuidado para preparar las células en estado estacionario de crecimiento e inocular la almohadilla a una densidad lo suficientemente baja como para dar tiempo suficiente para la medición. La microfluídica se puede emplear para mantener las células en estado estacionario de crecimiento exponencial durante largos períodos de tiempo24, aunque estos métodos requieren experiencia, equipo y configuración adicionales para ser efectivos.
Complementando el trabajo más detallado del laboratorio de Kuhlman19, se ilustra aquí que la proteína TnpB asociada a la familia IS200 / IS605 TE aumenta la tasa de escisión de IS608 hasta cinco veces, y que el aumento de la escisión se correlaciona directamente con niveles más altos de expresión de TnpB. Estos métodos son un ejemplo de técnicas de ensayo mejoradas que pueden ayudar a arrojar luz sobre la actividad del transposón y su impacto en la dinámica mutacional y evolutiva.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Acknowledgments
El apoyo financiero para esta investigación fue proporcionado por fondos iniciales de la Universidad de California.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 Ton Clear Epoxy | Devcon | 31345 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| Ammonium sulfate | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Blue Filter Cube | Chroma | Ex: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscope | Nikon | Discontinued | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 0.1 to 10 µL, Length: 3.4 cm, 1.33 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Boxes and Refill Trays, Volume: 50 to 1000 µL, Length: 7.1 cm, 2.79 in., PP (Polypropylene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Ferrous Sulfate Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji | Fiji (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Broth, Miller (Granulated) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Glass Cover Slide | Fisher Scientific | 12-542B | |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| Magnesium sulfate Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscope Heater | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III Stage | Prior | ||
| Red Filter Cube | Chroma | Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | |
| Sapphire 561 LP Laser | Coherent | 1170412 | |
| Slide, Microscope | Fisher Scientific | 125535B | |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Laser Launch | Nikon | ||
| Yellow Filter Cube | Chroma | Ex: Z514/10X, Em: ET535/30M |
References
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234 (2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Microbiology. 155 (5), 319-327 (2004).
- Chao, L., Vargas, C., Spear, B. B., Cox, E. C. Transposable elements as mutator genes in evolution. Nature. 303 (5918), 633-635 (1983).
- Coufal, N. G., et al. L1 retrotransposition in human neural progenitor cells. Nature. 460 (7259), 1127-1131 (2009).
- Kano, H., et al. L1 retrotransposition occurs mainly in embryogenesis and creates somatic mosaicism. Genes & Development. 23 (11), 1303-1312 (2009).
- Belancio, V. P., Deininger, P. L., Roy-Engel, A. M. LINE dancing in the human genome: transposable elements and disease. Genome Medicine. 1 (10), 97 (2009).
- Goodier, J. L.
- Kim, N. H., et al. Real-time transposable element activity in individual live cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7278-7283 (2016).
- Lutz, R., Bujard, H. Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Research. 25 (6), 1203-1210 (1997).
- Calos, M. P., Miller, J. H. The DNA sequence change resulting from the IQ1 mutation, which greatly increases promoter strength. Molecular and General Genetics MGG. 183 (3), 559-560 (1981).
- Markwardt, M. L., et al. An improved cerulean fluorescent protein with enhanced brightness and reduced reversible photoswitching. PLoS One. 6 (3), 17896 (2011).
- Nagai, T., et al. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nature Biotechnology. 20 (1), 87-90 (2002).
- Kersulyte, D., et al. Transposable element ISHp608 of Helicobacter pylori: nonrandom geographic distribution, functional organization, and insertion specificity. Journal of Bacteriology. 184 (4), 992-1002 (2002).
- Shmakov, S., et al. Diversity and evolution of class 2 CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology. 15 (3), 169-182 (2017).
- Bao, W., Jurka, J. Homologues of bacterial TnpB_IS605 are widespread in diverse eukaryotic transposable elements. Mobile DNA. 4 (1), 12 (2013).
- Siguier, P., Gourbeyre, E., Chandler, M. Bacterial insertion sequences: their genomic impact and diversity. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 865-891 (2014).
- Altae-Tran, H., et al. The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases. Science. 374 (6563), 57-65 (2021).
- Karvelis, T., et al. Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease. Nature. 599 (7886), 692-696 (2021).
- Kaur, D., Kuhlman, T. E. IS200/IS605 family-associated TnpB increases transposon activity and retention. bioRxiv. , (2022).
- Benson, D. A., et al.
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ton-Hoang, B., et al. Single-Stranded DNA transposition is coupled to host replication. Cell. 142 (3), 398-408 (2010).
- Wang, P., et al.
