Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og minimalt invasiv metode for transplantasjon og avbildning av NIT-1-celler i ikke-overvektige diabetiske (NOD) -alvorlige kombinerte immundefekte mus utfordret med splenocytter renset fra spontant diabetiske NOD-mus.
Abstract
Type 1 diabetes er preget av autoimmun ødeleggelse av insulinproducerende beta-celler i bukspyttkjertelen. En lovende behandling for denne sykdommen er transplantasjon av stamcelleavledede betaceller. Genetiske modifikasjoner kan imidlertid være nødvendig for å beskytte de transplanterte cellene mot vedvarende autoimmunitet. Diabetiske musemodeller er et nyttig verktøy for foreløpig evaluering av strategier for å beskytte transplanterte celler mot autoimmunt angrep. Beskrevet her er en minimalt invasiv metode for transplantasjon og avbildning av celletransplantater i en adoptiv overføringsmodell av diabetes hos mus. I denne protokollen transplanteres celler fra murine pankreas betacellelinje NIT-1 som uttrykker firefly luciferase transgene luc2 subkutant i immundefekte ikke-overvektige diabetiske (NOD)-alvorlige kombinerte immundefekte (scid) mus. Disse musene injiseres samtidig intravenøst med splenocytter fra spontant diabetiske NOD-mus for å overføre autoimmunitet. Transplantatene avbildes med jevne mellomrom via ikke-invasiv bioluminescerende avbildning for å overvåke celleoverlevelsen. Overlevelsen til mutante celler sammenlignes med overlevelsen til kontrollceller transplantert i samme mus.
Introduction
Type 1 diabetes (T1D) er forårsaket av autoimmun ødeleggelse av insulinproduserende betaceller i bukspyttkjertelen. Tapet av beta-cellemasse resulterer i insulinmangel og hyperglykemi. T1D-pasienter er avhengige av flere daglige injeksjoner av eksogent insulin og opplever episoder med alvorlig hyperglykemi og hypoglykemi gjennom hele livet. Komplikasjonene knyttet til disse episodene inkluderer diabetisk retinopati, nedsatt nyrefunksjon og nevropati1.
Insulininjeksjoner er en behandling, men ikke en kur for T1D. Erstatning av den tapte beta-cellemassen har imidlertid potensial til å reversere sykdommen ved å gjøre det mulig for pasienter å produsere sitt eget insulin. Tilgangen på kadaveriske donorholmer er imidlertid begrenset2. Stamcelleavledede øyer (SC-holmer) kan gi en tilnærmet ubegrenset tilførsel av betaceller for transplantasjon. Flere grupper har vist at humane embryonale stamceller (ESC) og induserte pluripotente stamceller (iPSCs) kan differensieres for å generere funksjonelle beta-lignende celler 3,4,5. Lovende data fra tidlige kliniske studier indikerer at disse cellene opprettholder sin funksjon etter transplantasjonen og kan gjøre det mulig for pasienter å bli insulinuavhengige6. Kronisk immunsuppresjon er nødvendig, imidlertid, og dermed øke deres mottakelighet for kreft og infeksjon. I tillegg kan immunsuppressive midler være cytotoksiske for transplantater på lang sikt7. For å eliminere behovet for immunsuppresjon, kan SC-øyer bli genetisk modifisert for å beskytte dem mot tilbakevendende autoimmunitet samt alloimmunitet etter transplantasjon.
Stamcelleforskning er svært krevende i kostnader og arbeidskraft. Musecellelinjer og dyremodeller er nyttige verktøy for første identifisering og eksperimentell validering av strategier for å beskytte transplanterte celler mot autoimmunitet. NOD-musen utvikler spontan autoimmun diabetes med mange likheter med human T1D8, og NIT-1 insulinomcellelinjen deler en genetisk bakgrunn med denne musestammen9. Diabetes kan overføres adoptivt til den relaterte immundefekte NOD-scid-musestammen via injeksjon av diabetiske splenocytter fra NOD-mus for å tidsmessig synkronisere utbruddet av diabetes i replikere eksperimentelle mus10. Denne modellen kan brukes til å identifisere genetiske mål relativt raskt og billig for videre validering i SC-øyer. Nylig ble metoden brukt til å identifisere og validere RNLS, et mål som ble funnet å beskytte primære menneskelige øyer fra autoimmunitet in vivo og iPSC-avledede øyer fra betacellestress in vitro11. Beskrevet her er en enkel protokoll for å transplantere genetisk konstruerte NIT-1-celler og ikke-invasivt overvåke deres overlevelse i en adoptivoverføringsmodell av autoimmun diabetes hos mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1: Arbeidsflyten for transplantasjon og avbildning av transplantater i en adoptivoverføringsmodell av diabetes hos mus. NIT-1-celler som uttrykker firefly transgene luciferase (luc2) transplanteres subkutant i NOD-scid-mus. Musene injiseres samtidig med autoreaktive splenocytter isolert fra en spontant diabetisk NOD-mus. Transplantatene avbildes med jevne mellomrom ved ikke-invasiv bioluminescerende avbildning. Figur laget av BioRender.com. Forkortelser: NOD = ikke-overvektig diabetiker; SCID = alvorlig kombinert immunsvikt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Alle dyrepleie- og studieprotokoller ble godkjent av og utført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Joslin Diabetes Center. NOD og NOD-scid mus kan lett fås fra kommersielle kilder. Alle musene i denne studien vedlikeholdes i et sentinal-overvåket anlegg. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, dyr, instrumenter og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Prosjektering og vedlikehold av NIT-1 cellelinjer
- Opprettholde NIT-1-cellelinjer, som deler en genetisk bakgrunn med NOD-mus, og 293FT-celler i vevskulturbehandlede retter i DMEM som inneholder 4,5 g / l glukose supplert med 10% føtal bovint serum og 1% penicillin / streptomycin i en 37 ° C inkubator med 5% CO2.
- Voks 293FT-cellene til 70% -80% sammenløp for transfeksjon.
- Per 10 cm tallerken med 293FT-celler, kombiner 10 μg pLenti-luciferase-blast (se tilleggsfil 1), som uttrykker firefly luciferase-transgenet (luc2) under kontroll av den konstitutivt aktive EF1α-promotoren , 2 μg hver av emballasjeplasmidene pMD2.G, pMDLg / pRRE og pRSV-Rev, 4 μg av konvoluttproteinplasmidet pCMV-VSV-G og 60 mikrogram lineær polyetylenimin (PEI) i 1 ml serumfri DMEM. Juster mengdene basert på antall celler som skal transfekteres.
- La DNA, PEI og DMEM stå i romtemperatur (RT) i 20 minutter, og legg dem deretter til 293FT-cellene.
- Samle mediet som inneholder lentivirale partikler 48 timer etter transfeksjon.
- Transduce NIT-1-cellene ved ~ 80% konfluens med 1 ml medium som inneholder lentivirale partikler per 106 celler i 48-72 timer.
- Velg luciferase-uttrykkende celler med 5 μg / ml blasticidin i 48 timer.
- Videre genetisk modifisere luciferase-uttrykkende celler for å passe til det eksperimentelle spørsmålet. Inkluder en luciferase-uttrykkende villtype- eller ikke-målrettingskontrollcellelinje for sammenligning.
MERK: Eksempler på målgenmodifikasjoner inkluderer CRISPR-knockout, CRISPRa/i, shRNA-knockdown og overuttrykk.
2. Fremstilling av NIT-1-celler for transplantasjon
- Voks luciferase-uttrykkende celler til de er 80% -90% sammenflytende.
- Fjern vekstmediet og vask cellene med fosfatbufret saltvann (PBS, 5 ml for en 10 cm tallerken).
- Tilsett 1 ml 0,05% trypsin-EDTA til hver tallerken i 2 minutter.
- Nøytraliser trypsinet med 5 ml vekstmedium.
- Bruk en pipette til å vaske cellene av fatet og overfør dem til et konisk rør.
MERK: Celler fra flere retter av samme cellelinje kan kombineres. - Telle cellene ved hjelp av en flekk som trypan blå manuelt med et hemocytometer eller automatisk med en automatisk celleteller.
- Sentrifuge ved 250 × g i 5 min ved RT og fjern supernatanten med en aspirasjonspipette.
- Resuspender cellepelleten i PBS i en konsentrasjon på 5 × 10 7 celler/ml (107 celler per cellelinje per mus vil bli transplantert i et volum på 200 μL).
- Hold cellene på is (i opptil 3 timer) til transplantasjon.
3. Transplantasjon av NIT-1 celler i NOD-scid mus
- Bedøve mottakermusene (8-10 uker gamle NOD-scid mus av samme kjønn som musene som brukes til å isolere splenocytter) ved isofluran innånding i et knockdownkammer. Lever 2,5 % isofluran inn i kammeret med en strømningshastighet på 1,5 l/min og en evakueringshastighet på 9 l/min.
- Smør dyrets øyne med oftalmisk salve for å forhindre tørking.
- Bruk en elektrisk barbermaskin med en vakt, fjern håret fra baksiden (dorsalsiden) av musene for å eksponere huden. Det barberte transplantasjonsområdet vil være omtrent 1 i x 2 tommer. Sett de barberte musene tilbake til knockdown-kammeret til transplantasjonen.
- Overfør musene en om gangen til en ren overflate med en isofluran nesekegle. Før musens hode forsiktig inn i nesekeglen. Bruk en strømningshastighet i isofluran på 0,25 l/min for å opprettholde anestesien under transplantasjonen.
- Tørk transplantasjonsområdet med en isopropylalkohol prep pad for å fjerne løst hår og desinfisere huden.
- Forsikre deg om at cellene er fullstendig resuspendert før sprøyten fylles. Trekk opp et overflødig volum (>300 μL) celler i en 1 ml steril sprøyte med en 26 G kanyle. Fjern eventuelle bobler; Deretter returnerer overskytende celler til røret slik at 300 μL cellesuspensjon forblir i sprøyten.
- Bruk en buet tang som holdes i den ikke-dominerende hånden, og løft huden forsiktig på den ene siden (venstre eller høyre) av musens rygg for å gi lettere tilgang til det subkutane rommet.
- Bruk den dominerende hånden til å plassere sprøyten parallelt med korona- og sagittalplanet på musens kropp. Med nålen pekende mot musens hode, stikk nålen inn i huden nær bakparten, og før den forsiktig inn i det subkutane rommet. Pass på at hele nålen forblir under huden og ikke stikker gjennom.
- Juster tangen slik at den forsiktig holder huden rundt nåleroten. Dispenser langsomt en liten mengde cellesuspensjon (<50 μL) og bekreft at det dannes en liten bule under huden på injeksjonsstedet. Fortsett å injisere cellesuspensjonen til 200 mikrol er levert til det subkutane rommet.
- Hold tangen på plass og hold nålen parallelt med musens kropp, trekk langsomt ut nålen. Etter at nålen er fjernet, hold huden lukket med tang i noen sekunder for å forhindre at cellene lekker ut av stikksåret.
- Hvis en genetisk modifikasjon blir evaluert, gjenta transplantasjonen på motsatt side av musen ved hjelp av en annen sprøyte slik at både mutant- og kontrollceller injiseres i hver mus, med en cellelinje til venstre og den andre til høyre. Hvis bare en cellelinje blir transplantert, injiser cellene bare på den ene siden.
- Etter transplantasjonen, overfør hver mus til et nytt bur. La hver mus komme seg helt fra anestesien før du legger til flere mus i buret.
MERK: Mus blir gjenopprettet når de gjenopptar normale aktiviteter og viser ikke tegn på sløvhet eller nedsatt bevegelse. - Evaluer musens helsestatus daglig i løpet av forsøket etter transplantasjonen. Hvis transplantatene danner en stor bule eller musene blir svake og sløve, måler du blodsukkeret og gir 10% (w / w) sukrosevann ad libitum til alle hypoglykemiske mus. Følg alle veterinæranbefalinger og avlive mus med fortsatt dårlig kroppstilstand i henhold til institusjonelle retningslinjer. I denne studien ble mus avlivet ved CO2 -innånding etterfulgt av cervikal dislokasjon.
4. Isolering og rensing av autoreaktive splenocytter
- Identifiser 10-16 uker gamle mannlige eller kvinnelige NOD-mus med nylig diabetes (mindre enn 10 dager) ved å bruke urin (eller blod) glukoseteststrimler. NOD-mus regnes som diabetiker når de har urin / blodsukker ≥250 mg / dL i minst 2 påfølgende dager.
MERK: For hver NOD-scid-mus er det nødvendig med 10 millioner splenocytter; En milt gir vanligvis 50 millioner til 150 millioner splenocytter. Splenocytter ble isolert fra patogenfrie mus plassert i et sentinal-overvåket anlegg. - Avlive riktig antall diabetiske NOD-mus.
MERK: I denne studien ble musene avlivet ved CO2 -innånding etterfulgt av livmorhalsforstyrrelse for å sikre døden. - Med musen på ryggen, gjør et vertikalt snitt ca 2 i lengde i huden med kirurgisk saks. Åpne høyre side av musen fra forskerens synspunkt og finn den knallrøde milten. Skjær milten forsiktig vekk fra den rosa bukspyttkjertelen og overfør den til en steril 10 cm petriskål inneholdende 5 ml steril PBS. Gjenta disseksjonen med så mange mus som nødvendig.
MERK: Milt fra flere mus kan kombineres i en tallerken. Utfør følgende trinn ved hjelp av sterile reagenser og utstyr i en steril hette. - Mos milten(e) med den flate toppen av et sterilt sprøytestempel.
- Plasser en 40 μm eller 70 μm sil i et 50 ml konisk rør og vask silen med 5 ml PBS for å prime den. Overfør milten (e) suspensjonen inn i silen og fortsett forsiktig mosing gjennom silen. Vask fatet med 10 ml PBS og overfør vasken til silen. Fortsett å mose til den røde fargen er borte fra silen.
- Kast silen og spinn røret ved 500 × g i 5 minutter ved RT. Fjern supernatanten med en aspirasjonspipette.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml (for opptil tre milt) ACK-lysebuffer forvarmet til RT og lyse de røde blodcellene i 4 minutter. Øk volumet med 1-2 ml per milt hvis det er behov for ytterligere milt.
- Stopp reaksjonen med 5 ml NIT-1 cellemedier (beskrevet ovenfor) per 5 ml lysisbuffer. Før cellesuspensjonen gjennom en ny sil for å fjerne klumper. Kast silen, og spinn ved 500 × g i 5 min ved RT.
- Resuspender cellepelleten i 20 ml PBS, og tell cellene. Spinn ved 500 × g i 5 minutter ved RT. Resuspender cellene i steril PBS i en konsentrasjon på 1 × 108 celler/ml (injeksjonsvolumet er 0,1 ml/mus) i et 1,5 ml safe-lock reaksjonsrør.
- Oppbevar cellene på is (i ikke mer enn 1 time) eller hold cellene på RT, og fortsett til haleveneinjeksjonen umiddelbart.
5. Intravenøs injeksjon av diabetiske miltocytter via lateral haleven
- Varm opp kroppen til den voksne mottakeren NOD-scid mus (f.eks ved å bruke en varmelampe for ~ 5-10 min) for å vasodilate venene (dette bidrar til visualisering og injeksjon i venen).
NOTAT: For å unngå overoppheting av musene, ikke overskride denne tiden. Overvåk alltid helsestatusen. Hvis musene virker utmattet eller immobile, må du slå av varmelampen umiddelbart. - Varm opp cellesuspensjonen. Klargjør en steril sprøyte (0,3-1,0 ml) med en steril nål (27-30 G, 0,3 mm/0,5 tommer eller mindre), eller bruk en steril 0,5 ml insulinsprøyte med en 0,3 mm (0,5 tommer) kanyle. Hold alltid nålen steril og bruk et sterilt brett dersom sprøyten må settes ned mellom injeksjonene.
- Juster miltocyttoppløsningen før hver injeksjon. For hver mus trekkes 100 μL av den forvarmede og blandede miltocyttsuspensjonen inn i sprøyten. Forsikre deg om at det ikke er luftbobler i sprøyten eller i suspensjonen.
MERK: Sørg for å ha alt utstyr og forsyninger forberedt (alkoholservietter for desinfeksjon, en sprøyte lastet med splenocytter som skal injiseres, og et nytt bur for å skille injiserte mus) før du plasserer musen i fastholdelsesenheten. - Plasser musen i fastholdelsesenheten. Fang halen med den ikke-dominerende hånden og finn en av de to laterale haleårene. Roter halen forsiktig om nødvendig. Tørk halen med en desinfeksjonsserviett (70% isopropylalkohol) for å rengjøre huden og øke synligheten av venen.
- Sett nålen i skarp vinkel inn i det sentrale området av halen med den dominerende hånden. Med nålens skråkant vendt oppover, skyv nålen noen få millimeter gjennom huden.
MERK: Forsikre deg om at nålen er parallell med venen og plassert litt under huden. Vær forberedt på plutselige bevegelser av musen/halen rett etter penetrering av huden/åreveggen. En vellykket innsetting av nålen skal føles som et "glatt lysbilde" i venen. Hvis et nytt forsøk er nødvendig, flytt lenger opp halen mot kroppen. - Påfør forsiktig trykk på sprøyten for å injisere miltocyttsuspensjonen. La ikke nålen bevege seg lenger inn eller ut når du injiserer. Vellykkede injeksjoner er glatte uten å føle mottrykk under injeksjon og indikeres av en gjennomsiktig/hvit blodstrøm umiddelbart etter injeksjon.
- Slipp forsiktig nålen ut av venen, og trykk lett på halen med en desinfeksjonsserviett til blødningen stopper. Slipp musen fra fastholdelsesenheten, og overfør den forsiktig til et nylaget bur.
MERK: Injiser to til tre kontrollmus som ikke mottar en NIT-1-celletransplantasjon med splenocytter for å bekrefte potensialet til de autoreaktive splenocytter for å indusere diabetes, noe som tar omtrent 2-4 uker etter injeksjon.
6. In vivo bioluminescerende avbildning av NIT-1 transplantater
MERK: Bilde grafts en til to ganger per uke. På transplantasjonsdagen, vent minst 2 timer etter transplantasjonen for å la transplantatene sette seg og sikre stabilt luciferaseuttrykk. Hvis tid er en begrensende faktor, kan den første målingen tas på dag 1 i stedet. En anbefalt første bildebehandlingsplan er dag 0 eller dag 1 etter injeksjon, dag 5, dag 10, dag 14, dag 18 og dag 25. Juster tidsplanen, men basert på fremdriften av autoimmunitet som dømt av tap av bioluminescerende signal.
- Lag en 15 mg/ml D-luciferinoppløsning i Dulbeccos PBS. Agiter ved RT for å oppløse, og sterilt filter (0,22 μm). Oppbevar 1 ml alikoter ved -20 °C, og tine etter behov.
MERK: Alikotene kan fryses på nytt. - Minst 5 minutter før avbildning, injiser musene intraperitonealt med en 1 ml sprøyte og en 26 G kanyle med D-luciferin oppløsning i en dose på 150 mg/kg.
MERK: Bruk en ny sprøyte og kanyle til hver mus. - Bedøve musene ved innånding av isofluran i henhold til institusjonelle retningslinjer. De anbefalte forholdene er 2,5 % isofluran med en strømningshastighet på 1,5 l/min inn i utslagskammeret og en evakueringshastighet på 9 l/min.
- Smør dyrets øyne med oftalmisk salve for å forhindre tørking.
- Åpne programvaren som er tilknyttet bildebehandlingsinstrumentet. Opprett en ny bruker og/eller logg inn. På kontrollpanelet nederst til høyre velger du Initialiser (figur 2A). Hvis du vil lagre bildedataene automatisk, oppretter du de riktige mappene på datamaskinen, og deretter velger du Anskaffelse | Lagre automatisk til... (Figur 2A). Når instrumentet er ferdig initialisert, setter du eksponeringstiden til 1 min.
MERK: De komplette bildeparametrene er vist i figur 2B. - Overfør musene en om gangen fra knockdownkammeret til bildeinstrumentet. Plasser musen på magen med lemmene spurt, og før hodet forsiktig inn i nesekeglen. En isofluran strømningshastighet på 0,25 l/min levert via en nesekjegle er hensiktsmessig for å opprettholde anestesi under avbildning. Flat musen forsiktig ved å trykke midt på ryggen med begge hender og deretter spre hendene utover og fra hverandre.
- Velg Hent (figur 2B). Registrer eventuelle relevante detaljer om eksperimentet i popup-vinduet (figur 2C).
MERK: Se figur 3A for representative bilder av tre 8 uker gamle kvinnelige NOD-scid mus transplantert med to transplantater på forskjellige tidspunkter.
Figur 2: Skjermbilder av programvarekommandoene for avbildning av bioluminescerende transplantater . (A) Velg Initialiser før avbildning for å klargjøre instrumentet. Bildene kan lagres automatisk i en valgfri mappe ved å velge Oppkjøp | Lagre automatisk til... (B) Oversikt over avbildningsparametrene. Når musen er plassert i instrumentet, velger du Hent. (C) Skjermbilde av dialogboksen som dukker opp under avbildning. Detaljer som tidspunkt og musebelastning kan legges inn her. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
7. Dataanalyse
- Kvantifiser det bioluminescerende signalet når som helst etter avbildning. Åpne programvaren som er tilknyttet bildebehandlingsinstrumentet. Velg Fil | Åpne og velg ClickInfo.txt filen som er tilknyttet musen som skal analyseres.
- I verktøypaletten velger du ROI-verktøy (figur 3B, trinn 1). Fra den ovale rullegardinmenyen (figur 3B, trinn 1, rød pil) velger du antall transplantater som ble transplantert inn i musen.
- Beveg ovalene slik at de inneholder det bioluminescerende signalet fra hvert transplantat, og velg Mål avkastning (figur 3B, trinn 2).
- Registrer totalantallet for hvert transplantat (figur 3B, trinn 3).
- For hvert transplantat, del det bioluminescerende signalet målt ved hvert tidspunkt med signalet målt ved det første tidspunktet. Rapporter transplantatoverlevelse som andel eller prosentandel av gjenværende bioluminescerende signal i forhold til det opprinnelige bioluminescerende signalet.
MERK: Hvis transplantatene utvides etter transplantasjonen, vil forholdet eller prosentandelen av transplantatoverlevelse være større enn henholdsvis 1 eller 100 %. Alle musene som får transplantasjoner bør overvåkes for negative helseeffekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over protokollen er skissert i figur 1. Overlevelsen av to cellelinjer, for eksempel en mutant og en ikke-målrettingskontroll, kan sammenlignes, eller overlevelsen av en cellelinje kan måles i flere grupper av mus, for eksempel narkotikabehandlede mus versus kjøretøybehandlede kontroller. Figur 3A viser tre 8 uker gamle kvinnelige NOD-scid mus transplantert med en ikke-målrettende kontroll (venstre) og en mutant (høyre) cellelinje. Musene ble også injisert intravenøst med autoreaktive splenocytter for å overføre diabetes.
Musene ble avbildet på dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 og dag 18 etter injeksjon. Hos to av de tre musene ble kontrolltransplantatet ødelagt innen dag 18, noe som fremgår av tapet av bioluminescerende signal, mens det muterte transplantatet var beskyttet. I den ene musen ble det muterte transplantatet, men ikke kontrolltransplantatet, ødelagt, noe som fremhever den biologiske variasjonen mellom dyr. Det bioluminescerende signalet ble kvantifisert som beskrevet i figur 3B. Transplantatoverlevelsen angis som prosentandel av gjenværende bioluminescerende signal sammenlignet med første tidspunkt (figur 3C). Det er også nyttig å beregne forholdet mellom mutant for å kontrollere luminescerende signaler for hver mus for å visualisere variasjonen mellom dyr (figur 3D). På slutten av datainnsamlingsperioden ble musene avlivet ved CO2 -innånding etterfulgt av cervikal dislokasjon.
Før sykdomsoverføring kan de transplanterte cellene replikere, noe som resulterer i utvidede transplantater som er synlige gjennom huden (figur 4A). Disse transplantatene vil ha mettede bioluminescerende signaler når de avbildes (figur 4B), som kanskje ikke er nøyaktig kvantifisert.
Figur 3: Representative bilder og kvantifisering av det bioluminescerende signalet . (A) Tre 8 uker gamle kvinnelige NOD-scid-mus ble transplantert med ikke-målrettende kontroll (høyre) og mutante celler (venstre) og intravenøst injisert med autoreaktive splenocytter for å indusere diabetes. Musene ble ikke-invasivt avbildet på dag 0, dag 5, dag 10, dag 14 og dag 18 etter injeksjon. Det bioluminescerende signalet illustreres av et fargespekter som spenner fra lav intensitet (blå) til høy intensitet (rød). (B) Instruksjoner for kvantifisering av det bioluminescerende signalet. (C) Gjennomsnittlig prosentandel av transplantatluminescens som gjenstår over tid. (D) Forholdet mellom prosentandelen av transplantatluminescens over tid for muterte versus ikke-målrettede kontrolltransplantater for hver mus. Ratio = 1 indikerer tidspunkter hvor prosentandelen av gjenværende signal er lik for begge transplantatene. Forkortelser: NOD = ikke-overvektig diabetiker; SCID = alvorlig kombinert immundefekt; NTC = ikke-målrettingskontroll; Mut = mutant. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på transplantater som er overdrevent utvidet. (A) Utvidede transplantater kan bule gjennom musens hud (indikert med den røde pilen). (B) Utvidede transplantater kan gi mettede bioluminescerende signaler. Det bioluminescerende signalet illustreres av et fargespekter som spenner fra lav intensitet (blå) til høy intensitet (rød). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: pLenti-luciferase-blast sekvens. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
T1D er en ødeleggende sykdom som det for tiden ikke finnes noen kur for. Betacelleerstatningsterapi tilbyr en lovende behandling for pasienter med denne sykdommen, men den kritiske barrieren for denne strategien er potensialet for tilbakevendende autoimmunt angrep mot de transplanterte betacellene. Genteknologien til SC-beta-celler for å redusere immunsynligheten eller følsomheten er en potensiell løsning på dette problemet. Beskrevet her er en protokoll for ikke-invasivt avbildning transplanterte beta-celler for å måle overlevelse i en adoptiv overføringsmodell av autoimmun diabetes hos mus.
En viktig fordel med denne metoden er tilpasningsevnen til protokollen. Metoden brukes her for å sammenligne en mutert cellelinje med en ikke-målrettende kontroll (figur 3), men protokollen kan romme en rekke eksperimentelle spørsmål. De beskyttende effektene av et bredt spekter av genetiske modifikasjoner, medisiner eller andre behandlinger mot autoimmunt angrep kan utforskes. Ved evaluering av effekten av et legemiddel eller annen behandling for å beskytte mot autoimmunitet, er det bare celler som uttrykker luciferase uten ytterligere genetiske modifikasjoner nødvendig. Mens syngene transplantasjoner for å teste autoimmun beskyttelse brukes i dette papiret, kan metoden også tilpasses for å evaluere alloimmun avstøtning ved å bruke en kombinasjon av en cellelinje og en musestamme som ikke er syngene, for eksempel NIT-1-celler og C57BL / 6J-mus. Protokollen kan også modifiseres for å utforske immuninfiltrasjon i transplantatene. Ytterligere mus som det hentes transplantater fra ved ulike tidspunkt kan inkluderes, og de infiltrerende immuncellene kan profileres ved immunhistokjemi eller flowcytometri.
En stor begrensning ved anvendelsen av denne metoden er svikt i resultatene oppnådd hos mus for å oversette til humane celler og pasienter. Over 500 strategier for autoimmun beskyttelse har blitt implementert med suksess i diabetiske musemodeller, men flertallet har ikke klart å demonstrere klinisk nytte7. Primære menneskelige øyer er imidlertid en begrenset ressurs, og stamcellearbeid har høye økonomiske og lønnskostnader. Protokollen beskrevet her er et verktøy for foreløpig identifisering av potensielle terapeutiske mål ved hjelp av en relativt billig og enkel museteknikk. Påfølgende forsøk bør utføres med primære og/eller SC-øyer, som vanligvis transplanteres under nyrekapselen hos mus. Metoden beskrevet her kan tilpasses for å evaluere effekten av terapeutiske strategier i humane celler. Både primære og SC-øyer kan konstrueres for å uttrykke luciferase, og deres overlevelse kan måles ved bioluminescerende avbildning etter transplantasjon under nyrekapselen til humaniserte musemodeller12,13. Metoder for ikke-invasiv overvåking av overlevelse av øytransplantater transplantert på øyets iris ved konfokalmikroskopi er også rapportert14.
En ytterligere begrensning knyttet til metoden beskrevet i denne artikkelen er variasjonen i det autoreaktive potensialet til isolerte splenocytter. Selv om frekvensen av sykdomsoverføring er høy10, kan tidslinjen for diabetesutbrudd etter miltinjeksjon variere fra 2 uker til 4 uker. I løpet av denne tiden kan de transplanterte cellene ekspandere (figur 4), noe som resulterer i hyperinsulinemi og alvorlig hypoglykemi. Kombinere miltocytter fra flere diabetiske donormus kan redusere variasjonen mellom eksperimenter.
Til tross for disse begrensningene er metoden et greit og informativt verktøy for å teste strategier for autoimmun beskyttelse. Protokollen benytter grunnleggende kloning og cellekulturteknikker, en enkel og minimalt invasiv musekirurgi og ikke-invasiv bildebehandling, slik at brukeren kan maksimere datainnsamlingen samtidig som antall dyr som trengs per eksperiment, minimeres. Som et alternativ til in vivo bioluminescerende avbildning, kan transplantater gjenvinnes på forskjellige tidspunkter, veies, fotograferes og videre behandles for immuncellekarakterisering. Denne strategien krever større antall mus, da gjenoppretting av transplantat krever avlivning, og det er ønskelig å ha replikater på hvert tidspunkt. I tillegg tillater grafthentingsmetoden at det bare tas en størrelsesmåling per transplantat. Siden tidslinjen for betacelledrap av autoreaktive splenocytter varierer mellom individer, kan det være vanskelig å bestemme det optimale tidspunktet for gjenoppretting av transplantat. Tilnærmingen beskrevet i dette papiret gjør det mulig for forskeren å overvåke fremdriften av autoimmunitet hos levende mus og få en komplett tidslinje for graftdestruksjon. Så lenge mus opprettholder euglykemi, kan beskyttede transplantater bli igjen i musene og avbildet over lange perioder for å belyse graden av beskyttelse.
Beskrevet her er en enkel protokoll for transplantasjon og ikke-invasiv avbildning beta celle grafts i en adoptiv overføring mus modell av autoimmun diabetes. Denne metoden gjør det mulig å bruke et minimalt antall dyr og tillater fleksibilitet i tidspunktet for transplantatanalyse, noe som er kritisk gitt variasjonen i fremdriften av autoimmunitet. Protokollen kan også lett tilpasses for å løse et bredt spekter av eksperimentelle spørsmål. Musemodeller er kritiske i oppdagelsen og valideringen av nye terapeutiske strategier, og denne metoden er et verdifullt verktøy for å fremme betacelleutskiftningsterapifeltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Erica P. Cai og Dr. Yuki Ishikawa for å ha utviklet metoden beskrevet i denne protokollen (se ref. 11). Forskning i SK og PY laboratorier støttes av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, Harvard Stem Cell Institute og Beatson Foundation. TS ble støttet av et postdoktorstipend fra National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), og KB ble støttet delvis av et stipend fra Mary K. Iacocca Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
| CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
| D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
| Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
| GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
| Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
| Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
| Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
| NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
| Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
| Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |
References
- Katsarou, A., et al.
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C.
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO Journal. 34 (13), 1759-1772 (2015).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Vertex Announces Positive Day 90 Data for the First Patient in the Phase 1_2 Clinical Trial Dosed With VX-880, a Novel Investigational Stem Cell-Derived Therapy for the Treatment of Type 1 Diabetes. Businesswire. , Available from: https://www.businesswire.com/news/home/20211018005226/en/Vertex-Announces-Positive-Day-90-Data-for-the-First-Patient-in-the-Phase-12-Clinical-Trial-Dosed-With-VX-880-a-Novel-Investigational-Stem-Cell-Derived-Therapy-for-the-Treatment-of-Type-1-Diabetes (2021).
- Gamble, A., Pepper, A. R., Bruni, A., Shapiro, A. M. J. The journey of islet cell transplantation and future development. Islets. 10 (2), 80-94 (2018).
- Pearson, J. A., Wong, F. S., Wen, L. The importance of the Non Obese Diabetic (NOD) mouse model in autoimmune diabetes. Journal of Autoimmunity. 66, 76-88 (2016).
- Hamaguchi, K., Gaskins, R. H., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic β-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40 (7), 842-849 (1991).
- Christianson, S. W., Shultz, L. D., Leiter, E. D. Adoptive transfer of diabetes into immunodeficient NOD-scid/scid mice: Relative contribution of CD4+ and CD8+ T-cells from diabetogenic versus prediabetic NOD.NON-Thy1a donors. Diabetes. 42 (1), 44-55 (1993).
- Cai, E. P., et al. Genome-scale in vivo CRISPR screen identifies RNLS as a target for beta cell protection in type 1 diabetes. Nature Metabolism. 2 (9), 934-945 (2020).
- Parent, A. V., et al. Selective deletion of human leukocyte antigens protects stem cell-derived islets from immune rejection. Cell Reports. 36 (7), 109538 (2021).
- Brehm, M. A., et al. Lack of acute xenogeneic graft-versus-host disease, but retention of T-cell function following engraftment of human peripheral blood mononuclear cells in NSG mice deficient in MHC class I and II expression. FASEB Journal. 33 (3), 3137-3151 (2019).
- Abdulreda, M. H., et al. In vivo imaging of type 1 diabetes immunopathology using eye-transplanted islets in NOD mice. Diabetologia. 62 (7), 1237-1250 (2019).
