Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение пигментных эпителиальных клеток сетчатки из глаз морской свинки

3.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/64837

⸱

9 мая 2023 г.

 ,  , 
1Herbert Wertheim School Optometry and Vision Science, University of California, Berkeley, 2Department of Ophthalmology, Osaka University Graduate School of Medicine, 3Department of Ophthalmology, Tokyo Medical Center, National Hospital Organization, 4Department of Optometry and Vision Science, School of Optometry, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

Описан простой и эффективный метод выделения клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз молодых пигментированных морских свинок. Эта процедура позволяет проводить последующие молекулярно-биологические исследования изолированного RPE, включая анализ экспрессии генов.

Аннотация

Этот протокол описывает выделение клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) из глаз молодых пигментированных морских свинок для потенциального применения в исследованиях молекулярной биологии, включая анализ экспрессии генов. В контексте регуляции роста глаз и близорукости RPE, вероятно, играет роль клеточного реле для сигналов модуляции роста, поскольку он расположен между сетчаткой и двумя стенками глаза, такими как сосудистая оболочка и склера. Хотя протоколы изоляции RPE были разработаны как для цыплят, так и для мышей, оказалось, что эти протоколы не могут быть напрямую перенесены на морскую свинку, которая стала важной и широко используемой моделью близорукости млекопитающих. В этом исследовании инструменты молекулярной биологии использовались для изучения экспрессии специфических генов, чтобы подтвердить, что образцы не были загрязнены соседними тканями. Ценность этого протокола уже была продемонстрирована в исследовании RNA-Seq RPE молодых пигментированных морских свинок, подвергшихся оптическому расфокусированию, вызывающему близорукость. Помимо регуляции роста глаз, этот протокол имеет и другие потенциальные применения в исследованиях заболеваний сетчатки, включая миопическую макулопатию, одну из основных причин слепоты при миопах, в которую был вовлечен RPE. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост и после совершенствования дает высококачественные образцы RPE, подходящие для исследований молекулярной биологии, включая анализ РНК.

Введение

RPE содержит уникальный монослой пигментированных клеток, расположенных между нервной сетчаткой и сосудистой сосудистой сосудистой оболочкой, и RPE играет хорошо известную роль в развитии и поддержании нормальной функции сетчатки, включая фототрансдукцию 1,2. Совсем недавно РПЭ была отведена дополнительная ключевая роль в регуляции ростаглаз 3 и, таким образом, в развитии близорукости4. Это назначение основано на критическом расположении RPE, расположенном между сетчаткой и сосудистой оболочкой, и в настоящее время широко распространенном признании того, что рост глаз и, следовательно, аномалии рефракции регулируются локально5. Считается, что RPE играет ключевую роль в качестве сигнального реле, связывающего сетчатку, предполагаемый источник сигналов модуляции роста, с сосудистой оболочкой и склерой, двумя мишенями ретранслируемых сигналов 6,7,8.

Увеличение осевой длины, которое характеризует большинство близорукости, не может считаться доброкачественным, при этом патофизиологические изменения, затрагивающие сетчатку, сосудистую оболочку и/или склеру, представляют собой неизбежные и в настоящее время хорошо известные последствия чрезмерного удлинения глаза 7,9. В этом контексте RPE, пожалуй, наиболее уязвим, поскольку, будучи немитотической тканью, он способен приспосабливаться к расширяющейся стекловидной камере только за счет растяжения и истончения отдельных клеток. Хотя его роль в патологиях, связанных с близорукостью, таких как миопическая макулярная дегенерация, еще предстоит полностью понять, RPE был вовлечен в патогенез ряда других заболеваний сетчатки, включая географическую атрофию, одну из основных причин слепоты, которая связана с документально подтвержденными аномалиями сетчатки, RPE и сосудистой оболочки10,11, Статья 12.

Успешная изоляция клеток RPE, свободных от загрязнения из соседних тканей глаза, потенциально открывает множество исследовательских возможностей для получения нового понимания механизмов, лежащих в основе различных заболеваний глаз / сетчатки. Тем не менее, выделение РПЭ оказалось сложной задачей, и по этой причине во многих опубликованных исследованиях использовались комбинированные образцы сетчатки/РПЭ или РПЭ/сосудистой оболочки13,14,15. Исследования, связанные с успешным выделением RPE качества, подходящего для исследований молекулярной биологии, были ограничены глазами цыплят и мышей16,17. Например, метод одновременной изоляции RPE и стабилизации РНК (SRIRS), описанный Wang et al.18. Выделение клеток RPE у мышей, по-видимому, не очень хорошо работает в глазах морских свинок. Описанный здесь протокол представляет собой усовершенствование подхода, который был первоначально прототипирован с глазами землеройки одним из авторов (М.Ф.) и доказал, что дает высококачественные образцы RPE, подходящие для анализа РНК и других молекулярной биологии, из глаз молодых пигментированных морских свинок19.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Весь уход за животными и лечение, используемые в этом исследовании, соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и офтальмологических исследованиях. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Беркли.

1. Энуклеация глаза морской свинки

  1. Усыпить морскую свинку внутрисердечной инъекцией пентобарбитала натрия, вводимого под наркозом (5% изофлурана в кислороде).
  2. Энуклеируйте глаза с помощью щипцов и ножниц и немедленно перенесите их в 10-сантиметровую чашку Петри со стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для промывания. Перенесите глаза в свежий раствор PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 6-луночная пластина, содержащая 4 мл раствора на лунку.

2. Изоляция заднего глазного стакана глаза и комплекса РПЭ/сосудистая/склера

  1. С помощью рассекающего микроскопа используйте иглу 18 G, чтобы сделать начальный небольшой разрез в склере, примерно на 1,0 мм позади лимбальной границы (т. е. между роговицей и склерой) (рис. 1A); Затем с помощью ножниц удалите передний сегмент, включая роговицу, радужную оболочку, цилиарное тело и хрусталик.
  2. Затем, работая с оставшимся задним глазным сегментом, отсоедините сетчатку от комплекса РПЭ/сосудистая оболочка/склера; используйте щипцы, чтобы сначала захватить, а затем осторожно потянуть за зонулу Зинна, а затем постепенно отслаивать сетчатку без фрагментации (рис. 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатку нельзя захватывать напрямую, чтобы избежать фрагментации сетчатки и неполной изоляции тканей сетчатки. Использование микроскопа необходимо для этого этапа вскрытия.

3. Изоляция СИЗОД от сосудистой оболочки

  1. После того, как сетчатка будет полностью удалена, погрузите оставшуюся заднюю чашку глаза, которая включает РПЭ, сосудистую оболочку и склеру, в реагент для хранения тканей на 5 минут (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 12-луночную пластину с идентифицированными лунками, каждая из которых заполнена 2 мл реагента для хранения тканей.
  2. Перенесите наглазник в другую лунку, заполненную 4 мл PBS, в течение 10 с, прежде чем переместить его в третью лунку, заполненную 2 мл PBS.
  3. Прикрепите иглу 30 г к шприцу объемом 1 мл, наполненному PBS, для заключительного этапа изоляции RPE. Осторожно надавите на шприц, чтобы создать струю PBS; сначала направьте этот поток на СИЗОД, чтобы сделать в нем небольшой разрыв или отверстие, а затем направьте поток ПБС в созданное отверстие, чтобы отсоединить РПЭ как лист от сосудистой оболочки (рис. 1С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отсоединение СИЗОД в виде листа дает самый большой образец СИЗО. Опять же, использование микроскопа необходимо для этого шага.
  4. После отделения РПЭ от сосудистой оболочки (рис. 1D) соберите ткань РПЭ в безыгольный шприц объемом 1 мл, а затем перенесите собранный образец в пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Центрифугируют пробирку объемом 1,5 мл с собранным РПЭ в дозе 8 000 × г в течение 1 мин, чтобы получить гранулу РПЭ (рис. 2А).
  6. Откажитесь от раствора PBS и замените его 350 мл буфера для лизиса, включенного в наборы для выделения РНК (см. Таблицу материалов); Пипеткой 20 раз перемешать и, таким образом, сохранить качество образца. Для более длительного хранения и консервации перенесите образцы в морозильную камеру с температурой -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса является запатентованным компонентом набора для выделения РНК для лизиса клеток и тканей перед выделением РНК и одновременной изоляцией РНК/ДНК/белка. Чтобы инактивировать РНК в лизате, обязательно добавьте β-меркаптоэтанол в буфер для лизиса (10 мкл β-меркаптоэтанола на 1 мл буфера для лизиса).

4. Выделение RPE-РНК

  1. Используйте набор для выделения РНК (см. Таблицу материалов) для выделения и сбора РНК из образцов RPE в соответствии с инструкциями производителя. Оцените качество образца с помощью электрофореза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол дал продукт хорошего качества (т.е. номер целостности РНК [RIN] более 8,0).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ образцов RPE, собранных с использованием вышеуказанного протокола, показал хорошо сохранившуюся РНК (RIN >8.0, рис. 2B) с 240,2 нг ± 35,1 нг на глаз (n = 8, NanoDrop, рис. 2B). Для дальнейшей оценки качества выделенных образцов RPE, в частности, отсутствия контаминантов хориоидеи и склеры, мы исследовали экспрессию репрезентативных генов для каждой из последних тканей в образцах RPE19. Образцы RPE продемонстрировали значительно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы описываем метод выделения RPE, подходящий для анализа экспрессии генов RPE, из глаз молодых пигментированных морских свинок. Достоинства этого протокола заключаются в том, что он дает высококачественные образцы RPE, которые относительно свободны от загрязнения, с РНК, соответствующим образом сохраненной для анализа РНК-специфической и, тем не менее, относительно простой и эффективной. В то время как в приведенном здесь примере образцы RPE были собраны из глаз молодой (2-недельной) морской свинки, протоко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование поддержано стипендиями Японского общества содействия науке за рубежом (S.G.), докторантом Лориса и Дэвида Рича (S.G.) и грантом Национального глазного института Национальных институтов здравоохранения (R01EY012392; К.Ф.В.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 мл шприц со скользящим наконечникомBd Vacutainer Labware Medical22-253-260
2-меркаптоэтанолInvitrogen21985-023
6-луночный планшет для культуры тканей с крышкой, плоское дно, стерильнаягрудная клетка Chemical Mfg. Corp970-95008
12-луночный планшет для культуры тканей с крышкой, индивидуальный, стерильныйThomas Scientific LLC1198D72
Agilent 2100 Биоанализаторэлектрофорез для проверки качества РНК
Сбалансированные солевые растворыGibco10010031
Бонн Микрощипцы, прямые гладкие, наконечник 0,3 мм, 7 смFine Science Tools, Inc.11083-07
Пинцет Dumont No5ROBOZRS-5045
Иглы одноразовые для подкожных инъекцийExelint International, Co.26419
Иглы одноразовые для подкожных инъекцийExelint International, Co.26437
Микроцентрифуги MiniSpinEppendorf540108макс. скорость: 8 000 г
РНК Раствор для стабилизациипозже Реагент для хранения тканей InvitrogenAM7020Реагент для хранения тканей
RNeasy Mini наборыQiagen74104Набор для выделения РНК
Student Vannas Spring ScissorsFine Science Tools, Inc.91500-09
автоматизированный

Ссылки

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
  3. Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358(2018).
  4. Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
  5. Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
  6. Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
  7. Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
  8. Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118(2021).
  9. Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
  10. Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. New England Journal of Medicine. 358 (24), 2606-2617 (2008).
  11. McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982(2009).
  12. Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
  13. Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
  14. Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
  15. He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
  16. Nickla, D. L., Wallman, J. The multifunctional choroid. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 144-168 (2010).
  17. Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
  18. Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
  19. Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25(2022).
  20. De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
  21. Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
  22. Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
  23. Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Ретинальный пигментный эпителийвыделение РПЭрегуляция роста глазамодель миопиианализ РНКэкспрессия геновзаболевания сетчаткикультура клетокдиссекция тканей
Выделение пигментных эпителиальных клеток сетчатки из глаз морской свинки
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.