Summary
Описан простой и эффективный метод выделения клеток пигментного эпителия сетчатки (РПЭ) из глаз молодых пигментированных морских свинок. Эта процедура позволяет проводить последующие молекулярно-биологические исследования изолированного RPE, включая анализ экспрессии генов.
Abstract
Этот протокол описывает выделение клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) из глаз молодых пигментированных морских свинок для потенциального применения в исследованиях молекулярной биологии, включая анализ экспрессии генов. В контексте регуляции роста глаз и близорукости RPE, вероятно, играет роль клеточного реле для сигналов модуляции роста, поскольку он расположен между сетчаткой и двумя стенками глаза, такими как сосудистая оболочка и склера. Хотя протоколы изоляции RPE были разработаны как для цыплят, так и для мышей, оказалось, что эти протоколы не могут быть напрямую перенесены на морскую свинку, которая стала важной и широко используемой моделью близорукости млекопитающих. В этом исследовании инструменты молекулярной биологии использовались для изучения экспрессии специфических генов, чтобы подтвердить, что образцы не были загрязнены соседними тканями. Ценность этого протокола уже была продемонстрирована в исследовании RNA-Seq RPE молодых пигментированных морских свинок, подвергшихся оптическому расфокусированию, вызывающему близорукость. Помимо регуляции роста глаз, этот протокол имеет и другие потенциальные применения в исследованиях заболеваний сетчатки, включая миопическую макулопатию, одну из основных причин слепоты при миопах, в которую был вовлечен RPE. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он относительно прост и после совершенствования дает высококачественные образцы RPE, подходящие для исследований молекулярной биологии, включая анализ РНК.
Introduction
RPE содержит уникальный монослой пигментированных клеток, расположенных между нервной сетчаткой и сосудистой сосудистой сосудистой оболочкой, и RPE играет хорошо известную роль в развитии и поддержании нормальной функции сетчатки, включая фототрансдукцию 1,2. Совсем недавно РПЭ была отведена дополнительная ключевая роль в регуляции ростаглаз 3 и, таким образом, в развитии близорукости4. Это назначение основано на критическом расположении RPE, расположенном между сетчаткой и сосудистой оболочкой, и в настоящее время широко распространенном признании того, что рост глаз и, следовательно, аномалии рефракции регулируются локально5. Считается, что RPE играет ключевую роль в качестве сигнального реле, связывающего сетчатку, предполагаемый источник сигналов модуляции роста, с сосудистой оболочкой и склерой, двумя мишенями ретранслируемых сигналов 6,7,8.
Увеличение осевой длины, которое характеризует большинство близорукости, не может считаться доброкачественным, при этом патофизиологические изменения, затрагивающие сетчатку, сосудистую оболочку и/или склеру, представляют собой неизбежные и в настоящее время хорошо известные последствия чрезмерного удлинения глаза 7,9. В этом контексте RPE, пожалуй, наиболее уязвим, поскольку, будучи немитотической тканью, он способен приспосабливаться к расширяющейся стекловидной камере только за счет растяжения и истончения отдельных клеток. Хотя его роль в патологиях, связанных с близорукостью, таких как миопическая макулярная дегенерация, еще предстоит полностью понять, RPE был вовлечен в патогенез ряда других заболеваний сетчатки, включая географическую атрофию, одну из основных причин слепоты, которая связана с документально подтвержденными аномалиями сетчатки, RPE и сосудистой оболочки10,11, Статья 12.
Успешная изоляция клеток RPE, свободных от загрязнения из соседних тканей глаза, потенциально открывает множество исследовательских возможностей для получения нового понимания механизмов, лежащих в основе различных заболеваний глаз / сетчатки. Тем не менее, выделение РПЭ оказалось сложной задачей, и по этой причине во многих опубликованных исследованиях использовались комбинированные образцы сетчатки/РПЭ или РПЭ/сосудистой оболочки13,14,15. Исследования, связанные с успешным выделением RPE качества, подходящего для исследований молекулярной биологии, были ограничены глазами цыплят и мышей16,17. Например, метод одновременной изоляции RPE и стабилизации РНК (SRIRS), описанный Wang et al.18. Выделение клеток RPE у мышей, по-видимому, не очень хорошо работает в глазах морских свинок. Описанный здесь протокол представляет собой усовершенствование подхода, который был первоначально прототипирован с глазами землеройки одним из авторов (М.Ф.) и доказал, что дает высококачественные образцы RPE, подходящие для анализа РНК и других молекулярной биологии, из глаз молодых пигментированных морских свинок19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Весь уход за животными и лечение, используемые в этом исследовании, соответствовали Заявлению ARVO об использовании животных в офтальмологических и офтальмологических исследованиях. Экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского университета в Беркли.
1. Энуклеация глаза морской свинки
- Усыпить морскую свинку внутрисердечной инъекцией пентобарбитала натрия, вводимого под наркозом (5% изофлурана в кислороде).
- Энуклеируйте глаза с помощью щипцов и ножниц и немедленно перенесите их в 10-сантиметровую чашку Петри со стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для промывания. Перенесите глаза в свежий раствор PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется 6-луночная пластина, содержащая 4 мл раствора на лунку.
2. Изоляция заднего глазного стакана глаза и комплекса РПЭ/сосудистая/склера
- С помощью рассекающего микроскопа используйте иглу 18 G, чтобы сделать начальный небольшой разрез в склере, примерно на 1,0 мм позади лимбальной границы (т. е. между роговицей и склерой) (рис. 1A); Затем с помощью ножниц удалите передний сегмент, включая роговицу, радужную оболочку, цилиарное тело и хрусталик.
- Затем, работая с оставшимся задним глазным сегментом, отсоедините сетчатку от комплекса РПЭ/сосудистая оболочка/склера; используйте щипцы, чтобы сначала захватить, а затем осторожно потянуть за зонулу Зинна, а затем постепенно отслаивать сетчатку без фрагментации (рис. 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сетчатку нельзя захватывать напрямую, чтобы избежать фрагментации сетчатки и неполной изоляции тканей сетчатки. Использование микроскопа необходимо для этого этапа вскрытия.
3. Изоляция СИЗОД от сосудистой оболочки
- После того, как сетчатка будет полностью удалена, погрузите оставшуюся заднюю чашку глаза, которая включает РПЭ, сосудистую оболочку и склеру, в реагент для хранения тканей на 5 минут (см. Таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 12-луночную пластину с идентифицированными лунками, каждая из которых заполнена 2 мл реагента для хранения тканей. - Перенесите наглазник в другую лунку, заполненную 4 мл PBS, в течение 10 с, прежде чем переместить его в третью лунку, заполненную 2 мл PBS.
- Прикрепите иглу 30 г к шприцу объемом 1 мл, наполненному PBS, для заключительного этапа изоляции RPE. Осторожно надавите на шприц, чтобы создать струю PBS; сначала направьте этот поток на СИЗОД, чтобы сделать в нем небольшой разрыв или отверстие, а затем направьте поток ПБС в созданное отверстие, чтобы отсоединить РПЭ как лист от сосудистой оболочки (рис. 1С).
ПРИМЕЧАНИЕ: Отсоединение СИЗОД в виде листа дает самый большой образец СИЗО. Опять же, использование микроскопа необходимо для этого шага. - После отделения РПЭ от сосудистой оболочки (рис. 1D) соберите ткань РПЭ в безыгольный шприц объемом 1 мл, а затем перенесите собранный образец в пробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируют пробирку объемом 1,5 мл с собранным РПЭ в дозе 8 000 × г в течение 1 мин, чтобы получить гранулу РПЭ (рис. 2А).
- Откажитесь от раствора PBS и замените его 350 мл буфера для лизиса, включенного в наборы для выделения РНК (см. Таблицу материалов); Пипеткой 20 раз перемешать и, таким образом, сохранить качество образца. Для более длительного хранения и консервации перенесите образцы в морозильную камеру с температурой -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса является запатентованным компонентом набора для выделения РНК для лизиса клеток и тканей перед выделением РНК и одновременной изоляцией РНК/ДНК/белка. Чтобы инактивировать РНК в лизате, обязательно добавьте β-меркаптоэтанол в буфер для лизиса (10 мкл β-меркаптоэтанола на 1 мл буфера для лизиса).
4. Выделение RPE-РНК
- Используйте набор для выделения РНК (см. Таблицу материалов) для выделения и сбора РНК из образцов RPE в соответствии с инструкциями производителя. Оцените качество образца с помощью электрофореза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Описанный протокол дал продукт хорошего качества (т.е. номер целостности РНК [RIN] более 8,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ образцов RPE, собранных с использованием вышеуказанного протокола, показал хорошо сохранившуюся РНК (RIN >8.0, рис. 2B) с 240,2 нг ± 35,1 нг на глаз (n = 8, NanoDrop, рис. 2B). Для дальнейшей оценки качества выделенных образцов RPE, в частности, отсутствия контаминантов хориоидеи и склеры, мы исследовали экспрессию репрезентативных генов для каждой из последних тканей в образцах RPE19. Образцы RPE продемонстрировали значительно более высокую экспрессию Rpe65 (RPE-специфического гена) по сравнению с уровнями экспрессии Rpe65 в сосудистой оболочке и склере (таблица 1 и рисунок 2C). Напротив, образцы RPE показали минимальную экспрессию Col1a1, выбранного гена сосудистой оболочки и склеры (рис. 2D).
Рисунок 1: Порядок сбора листов СИЗОД . (А) 2-недельный глаз морской свинки с первым разрезом. (B) Передний сегмент (роговица, радужная оболочка и хрусталик), стекловидное тело и сетчатка затем отделяются от задней чашки глаза (RPE, сосудистой оболочки и склеры). (C) Струйная струя PBS, доставляемая через иглу 30 G, используется для отделения RPE (D) в виде листа (черные стрелки) от сосудистой оболочки. Процедура от первого разреза до забора РПЭ занимает 5-7 минут. Аббревиатура: RPE = пигментный эпителий сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Процедура оценки качества выделенных образцов СИЗОЭ. (A) Репрезентативное изображение образца РПЭ в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл после вращения. (B) Репрезентативный выход биоанализатора для РНК, выделенной из собранных образцов RPE. (С,Д) Уровни экспрессии генов Rpe65, специфического для RPE, и Col1a1, который не экспрессируется или минимально экспрессируется в RPE, измерялись с помощью ОТ-кПЦР в образцах RPE, сосудистой оболочки и склеры от n = 3 необработанных животных; Оба набора данных были нормализованы к β-актину. ** P < 0,01; P < 0,001. Эта цифра была изменена по сравнению с Goto et al.19. Сокращения: RPE = пигментный эпителий сетчатки; β-актин = бета-актин; Col1a1 = альфа-1 цепь коллагена I типа; Rpe65 = ретиноидная изомерогидролаза; ОТ-кПЦР = количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Ген | Передний праймер (от 5 до 3 футов) | Обратная грунтовка (от 5 до 3 футов) | ||||
| Кол1а1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| РПЭ65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-актин | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Таблица 1: Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для ПЦР-амплификации при анализе качества образца. Сокращения: β-актин = бета-актин; Col1a1 = альфа-1 цепь коллагена I типа; Rpe65 = ретиноидная изомерогидролаза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой статье мы описываем метод выделения RPE, подходящий для анализа экспрессии генов RPE, из глаз молодых пигментированных морских свинок. Достоинства этого протокола заключаются в том, что он дает высококачественные образцы RPE, которые относительно свободны от загрязнения, с РНК, соответствующим образом сохраненной для анализа РНК-специфической и, тем не менее, относительно простой и эффективной. В то время как в приведенном здесь примере образцы RPE были собраны из глаз молодой (2-недельной) морской свинки, протокол также успешно использовался для сбора образцов RPE у пожилых (молодых взрослых) животных.
Для исследователей с минимальным опытом работы с глазной хирургией или вскрытием протокольные шаги 2.1 и 2.2 могут быть сложными. Важной деталью на этапе 2.1 является расположение начального разреза в склере, который должен быть точно размещен на расстоянии 1,0 мм позади лимба, чтобы радужная оболочка и хрусталик были удалены вместе с роговицей при отрыве переднего сегмента. Если вместо этого радужная оболочка остается прикрепленной к заднему сегменту глаза, сложно найти зонулу Зинна, которая является ключом к успешному отсоединению сетчатки на следующем этапе. Как отмечается в протоколе, для успешного отслоения сетчатки также важно, чтобы сетчатка не захватывалась непосредственно щипцами, чтобы избежать ее фрагментации. Сетчатка морской свинки кажется более хрупкой, чем сетчатка мыши, вероятно, из-за ее аваскулярной природы20. В идеале изолированная задняя чашка глаза, состоящая из РПЭ, сосудистой оболочки и склеры, должна быть погружена в реагент для хранения тканей в течение 5 минут после энуклеации глаза, чтобы обеспечить адекватную сохранность РНК в собранном образце РПЭ.
Метод SRIRS, который был разработан с конкретной целью сбора высококачественных образцов RPE из глаз мышей, по-видимому, достиг этой цели для глаз мышей; Сообщается, что он является как эффективным, так и действенным18. Этот метод также был успешно использован для сбора РПЭ из здоровых человеческих донорских глаз21. Однако, исходя из опыта авторов, этот метод SRIRS не подходит для сбора RPE из глаз морской свинки, древесной землеройки и опоссума, хотя основные причины этого не ясны. Сообщая о методе, описанном здесь, для выделения и сбора СИЗО из глаз молодых морских свинок, мы надеемся удовлетворить важную неудовлетворенную потребность в области исследований близорукости.
С точки зрения ограничений описанного протокола, основным из них является необходимость периода практического обучения для обеспечения эффективного сбора образцов, поскольку время до завершения является ключевым, в дополнение к чистоте собранных образцов RPE. Исследователи, которые не имеют опыта работы с микродиссекцией или хирургией глаза, больше всего нуждаются в обучении. Несмотря на то, что сообщалось о нескольких методах выделения РПЭ22,23, описанный здесь способ не подходит для культур клеток РПЭ или анализа белков из-за использования РНК-стабилизирующего реагента.
Уже давно признано, что СИЗО играет решающую роль не только в поддержании здоровья и функции сетчатки, но и в связанных с этим заболеваниях. Тот факт, что в настоящее время также признано, что RPE играет ключевую роль в регуляции роста глаз и развитии близорукости, значительно расширил круг исследовательских вопросов, для которых возможность сбора высококачественных образцов RPE либо из глаз морских свинок, как описано здесь, либо из других млекопитающих, используемых в качестве моделей животных, может быть ключом к получению новых идей. Такие исследования могут также дать новое представление о патологических осложнениях близорукости, включая миопическую макулопатию, для которой можно ожидать, что показатели распространенности будут расти параллельно с показателями распространенности близорукости как таковой.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Это исследование поддержано стипендиями Японского общества содействия науке за рубежом (S.G.), докторантом Лориса и Дэвида Рича (S.G.) и грантом Национального глазного института Национальных институтов здравоохранения (R01EY012392; К.Ф.В.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
