Summary
我们描述了一种从年轻色素豚鼠的眼睛中分离视网膜色素上皮(RPE)细胞的简单有效的方法。该程序允许对分离的RPE进行后续分子生物学研究,包括基因表达分析。
Abstract
该协议描述了从年轻色素豚鼠的眼睛中分离视网膜色素上皮(RPE)的细胞,以便在分子生物学研究中的潜在应用,包括基因表达分析。在眼睛生长调节和近视的背景下,RPE可能充当生长调节信号的细胞中继,因为它位于视网膜和眼睛的两壁(如脉络膜和巩膜)之间。虽然已经为小鸡和小鼠开发了分离RPE的方案,但这些方案已被证明不能直接转化为豚鼠,豚鼠已成为一种重要且广泛使用的哺乳动物近视模型。在这项研究中,分子生物学工具用于检查特定基因的表达,以确认样品没有来自邻近组织的污染。该方案的价值已经在暴露于近视诱导光学离焦的年轻色素豚鼠的 RPE 的 RNA-Seq 研究中得到证明。除了眼睛生长调节之外,该协议在视网膜疾病的研究中还有其他潜在的应用,包括近视性黄斑病变,这是近视失明的主要原因之一,其中与RPE有关。该技术的主要优点是相对简单,一旦完善,即可产生适合分子生物学研究(包括RNA分析)的高质量RPE样品。
Introduction
RPE包括位于神经视网膜和血管脉络膜之间的独特单层色素细胞,RPE在正常视网膜功能的发育和维持(包括光转导1,2)方面具有公认的作用。最近,RPE在眼睛生长调节3中被赋予了额外的关键作用,因此,近视4的发展。该分配基于RPE的关键位置,位于视网膜和脉络膜之间,以及现在广泛接受的眼睛生长以及因此屈光不正在局部调节5。RPE被认为作为信号中继起着关键作用,将视网膜(生长调节信号的假定来源)连接到脉络膜和巩膜,这是中继信号的两个目标6,7,8。
大多数近视的特征是轴向长度的增加不能被认为是良性的,涉及视网膜、脉络膜和/或巩膜的病理生理变化代表了不可避免的,现在公认的眼部过度伸长的后果7,9。在这种情况下,RPE可能是最脆弱的,因为作为非有丝分裂组织,它只能通过单个细胞的拉伸和变薄来容纳膨胀的玻璃体室。虽然RPE在近视相关病变(如近视性黄斑变性)中的作用尚未完全了解,但RPE与许多其他视网膜疾病的发病机制有关,包括地理萎缩,这是失明的主要原因之一,与记录的视网膜异常有关,RPE和脉络膜10,11,12.
成功分离RPE细胞,不受邻近眼组织的污染,可能开辟了许多研究机会,以获得对各种眼睛/视网膜疾病机制的新见解。然而,RPE的分离已被证明具有挑战性,许多已发表的研究因此使用组合视网膜/ RPE或RPE /脉络膜样本13,14,15。涉及成功分离适合分子生物学研究的质量的RPE的研究仅限于小鸡和小鼠眼睛16,17。例如,Wang等人描述的同步RPE分离和RNA稳定(SRIRS)方法18。在小鼠中分离RPE细胞似乎在豚鼠眼睛中效果不佳。这里描述的方案代表了一种方法的改进,该方法最初由其中一位作者(M.F.)用树鼩眼制作原型,并已被证明可以从年轻色素豚鼠的眼睛中产生高质量的RPE样品,适用于RNA和其他分子生物学分析19。
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Protocol
本研究中使用的所有动物护理和治疗均符合ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。实验方案得到了加州大学伯克利分校动物护理和使用委员会的批准。
1.豚鼠眼摘除术
- 用心内注射在麻醉下递送的戊巴比妥钠(5%异氟醚氧溶液)对豚鼠实施安乐死。
- 借助镊子和剪刀将眼睛去核,并立即将它们转移到带有无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)的10厘米培养皿中进行洗涤。将眼睛转移到新鲜的PBS溶液中。
注意:建议使用每孔含有 4 mL 溶液的 6 孔板。
2.分离眼后眼杯和RPE/脉络膜/巩膜复合体
- 在解剖显微镜的帮助下,使用18 G针在巩膜上做一个初始小切口,在角膜缘边界后约1.0毫米(即角膜和巩膜之间)(图1A);然后用剪刀去除前段,包括角膜、虹膜、睫状体和晶状体。
- 接下来,使用剩余的后眼节眼罩,将视网膜与 RPE/脉络膜/巩膜复合体分离;使用镊子首先抓住然后轻轻拉扯Zinn的带状体,然后逐渐剥离视网膜而不会碎裂(图1B)。
注意:不得直接抓住视网膜,以避免视网膜破碎和视网膜组织分离不完全。显微镜的使用对于该解剖步骤至关重要。
3. 将 RPE 与脉络膜隔离
- 完全去除视网膜后,将剩余的后眼杯(包括RPE,脉络膜和巩膜)浸入组织储存试剂中5分钟(参见 材料表)。
注意:使用带有已识别孔的 12 孔板,每个孔填充 2 mL 组织储存试剂。 - 将眼罩转移到另一个装有 4 mL PBS 的孔中 10 秒,然后将其移至装有 2 mL PBS 的第三个孔中。
- 将 30 G 针头连接到装有 PBS 的 1 mL 注射器上,以进行最后的 RPE 分离步骤。轻轻推动注射器以产生PBS喷射流;首先,将此流对准 RPE 以在其上留下一个小撕裂或孔,然后将 PBS 流引导到创建的开口中,将 RPE 作为片材从脉络膜上分离(图 1C)。
注意:将 RPE 分离为片材会产生最大的 RPE 样本。同样,使用显微镜对于此步骤至关重要。 - 将RPE从脉络膜上分离后(图1D),将RPE组织收集在无针1 mL注射器中,然后将收集的样品转移到1.5 mL管中。
- 将收集的RPE以8,000 × g 离心1.5 mL管以获得RPE沉淀(图2A)。
- 丢弃PBS溶液,并用RNA分离试剂盒中包含的350 mL裂解缓冲液替换(参见 材料表);移液器20倍混合,从而保持样品的质量。为了长期储存和保存,将样品转移到-80°C冰箱中。
注意:裂解缓冲液是RNA分离试剂盒的专有成分,用于在RNA分离和同时RNA/DNA/蛋白质分离之前进行细胞和组织裂解。要灭活裂解物中的RNA酶,请务必向裂解缓冲液中加入β-巯基乙醇(每1 mL裂解缓冲液10 μL β-巯基乙醇)。
4. RPE-RNA提取
- 按照制造商提供的说明,使用 RNA 分离试剂盒(参见 材料表)从 RPE 样品中分离和收集 RNA。通过电泳 评估 样品的质量。
注意:所描述的方案产生了高质量的产品(即RNA完整性数[RIN]超过8.0)。
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Representative Results
使用上述方案收集的RPE样品的分析显示保存良好的RNA(RIN >8.0,图2B),每只眼睛240.2 ng±35.1 ng(n = 8,NanoDrop,图2B)。 为了进一步评估分离的RPE样品的质量,特别是没有脉络膜和巩膜污染物,我们检查了RPE样品中每种组织的代表性基因的表达19。与脉络膜和巩膜中的Rpe65表达水平相比,RPE样品显示出Rpe65(RPE特异性基因)的表达显着更高(表1和图2C)。相比之下,RPE样品显示Col1a1(选定的脉络膜 - 巩膜特异性基因)的表达最小(图2D)。
图 1:收集 RPE 表的过程 。 (A)2周大的豚鼠眼睛,第一个切口。(B)然后将前段(角膜,虹膜和晶状体),玻璃体和视网膜与后眼杯(RPE,脉络膜和巩膜)分开。(C)通过30G针 头输送 的PBS喷射流用于将RPE(D)作为片状(黑色箭头)从脉络膜中分离。从第一个切口到RPE收集的过程需要5-7分钟。缩写:RPE = 视网膜色素上皮。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:评估分离的 RPE 样品质量的程序。 (A) 旋转后 1.5 mL 微量离心管中 RPE 样品的代表性图像。(B)从收集的RPE样品中提取的RNA的代表性生物分析仪输出。(中,四)Rpe65(一种 RPE 特异性基因)和 Col1a1(在 RPE 中未表达或表达最少)的基因表达水平,通过 RT-qPCR 在 n = 3 只未经治疗的动物的 RPE、脉络膜和巩膜样品中测量;两个数据集均标准化为β-肌动蛋白。** P < 0.01;P < 0.001。该数字已从Goto等人19修改而来。缩写:RPE = 视网膜色素上皮;β-肌动蛋白=β-肌动蛋白;Col1a1 = 胶原蛋白 I 型 α-1 链;Rpe65 = 类视黄醇异构体水解酶;RT-qPCR = 逆转录定量聚合酶链反应。请点击此处查看此图的大图。
基因 | 正向底漆(5' 至 3') | 反向底漆(5' 至 3') | ||||
Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
Rpe65 | GCCCTTCTGCAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
β-肌动蛋白 | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT |
表1:样品质量分析中用于PCR扩增的引物的核苷酸序列。 缩写:β-肌动蛋白=β-肌动蛋白;Col1a1 = I型胶原蛋白α 1链;Rpe65 = 类视黄醇异构体水解酶。
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Discussion
在本文中,我们描述了一种从年轻的色素有色豚鼠的眼睛中分离RPE的方法,适用于RPE基因表达分析。该协议的优点是它产生相对不受污染的高质量RPE样品,RNA适合RNA特异性分析,但相对简单有效。虽然在这里提供的示例中,RPE样本是从年轻(2周大)豚鼠的眼睛收集的,但该方案也已成功用于从老年(年轻成年)动物中收集RPE样本。
对于眼科手术或解剖经验很少的研究人员来说,方案步骤2.1和步骤2.2可能具有挑战性。步骤2.1中的关键细节是巩膜中初始切口的位置,应将其准确放置在角膜缘后方1.0毫米处,以便在分离前段时将虹膜和晶状体与角膜一起移除。相反,如果虹膜仍然附着在后眼段上,则很难找到Zinn的带状体,这是下一步成功分离视网膜的关键。如协议中所述,为了成功脱离视网膜,同样重要的是不要用镊子直接抓住视网膜以避免其破碎。豚鼠视网膜看起来比小鼠视网膜更脆弱,可能是因为它的无血管性质20。理想情况下,将分离的后眼杯(包括 RPE、脉络膜和巩膜)在眼部眼摘除后 5 分钟内浸入组织储存试剂中,以确保收集的 RPE 样品中 RNA 的充分保存。
SRIRS方法是为从小鼠眼睛收集高质量的RPE样本而开发的,似乎已经实现了小鼠眼睛的目标;据报道,它既高效又有效18.该技术也已成功用于从健康的人类供体眼睛中收集RPE21。然而,根据作者的经验,这种SRIRS方法不适合从豚鼠,树鼩和负鼠的眼睛中收集RPE,尽管其根本原因尚不清楚。通过报告这里描述的从幼小豚鼠眼睛中分离和收集RPE的技术,我们希望解决近视研究领域未满足的重要需求。
就所描述的协议的局限性而言,主要是需要一段时间的实践培训以确保有效收集样品,因为除了收集的RPE样品的纯度外,完成时间是关键。没有眼部显微解剖或手术经验的研究人员将最需要培训。尽管已经报道了几种RPE分离方法22,23,但由于使用了RNA稳定试剂,因此此处描述的方法不适用于RPE细胞培养或蛋白质分析。
长期以来,人们一直认为RPE不仅在维持视网膜的健康和功能方面,而且在相关疾病中也起着关键作用。RPE现在也被认为在眼部生长调节和近视发育中发挥关键作用,这一事实大大拓宽了研究问题的范围,为此,从豚鼠的眼睛收集高质量RPE样本的能力,如这里所述,或其他用作动物模型的哺乳动物可能是提供新见解的关键。这些研究也可能为近视的病理并发症提供新的见解,包括近视性黄斑病变,预计其患病率数字将与近视患病率数字 本身同步上升。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了日本科学促进会海外研究奖学金(S.G.),Loris和David Rich博士后学者(S.G.)以及国立卫生研究院国家眼科研究所(R01EY012392;C.F.W.)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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