Summary
وصفنا طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون خنازير غينيا المصطبغة الصغيرة. يسمح هذا الإجراء بمتابعة دراسات البيولوجيا الجزيئية على RPE المعزول ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني.
Abstract
يصف هذا البروتوكول عزل خلايا ظهارة الشبكية الصبغية (RPE) عن عيون صغار خنازير غينيا المصطبغة للتطبيق المحتمل في دراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليلات التعبير الجيني. في سياق تنظيم نمو العين وقصر النظر ، من المحتمل أن يلعب RPE دورا كمرحل خلوي للإشارات المعدلة للنمو ، حيث يقع بين شبكية العين وجداري العين ، مثل المشيمية والصلبة. في حين تم تطوير بروتوكولات لعزل RPE لكل من الكتاكيت والفئران ، فقد أثبتت هذه البروتوكولات أنها غير قابلة للترجمة مباشرة إلى خنزير غينيا ، الذي أصبح نموذجا مهما ومستخدما على نطاق واسع لقصر النظر في الثدييات. في هذه الدراسة ، تم استخدام أدوات البيولوجيا الجزيئية لفحص التعبير عن جينات معينة للتأكد من أن العينات كانت خالية من التلوث من الأنسجة المجاورة. وقد تم بالفعل إثبات قيمة هذا البروتوكول في دراسة RNA-Seq ل RPE من خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة المعرضة لإلغاء التركيز البصري الذي يحفز قصر النظر. بالإضافة إلى تنظيم نمو العين ، فإن هذا البروتوكول له تطبيقات محتملة أخرى في دراسات أمراض الشبكية ، بما في ذلك اعتلال البقعة قصير النظر ، وهو أحد الأسباب الرئيسية للعمى في myopes ، والذي تورط فيه RPE. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها بسيطة نسبيا وبمجرد إتقانها ، تنتج عينات RPE عالية الجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك تحليل الحمض النووي الريبي.
Introduction
يتكون RPE من طبقة أحادية فريدة من الخلايا المصطبغة الموجودة بين الشبكية العصبية والمشيمية الوعائية ، و RPE لها أدوار معترف بها جيدا في تطوير وصيانة وظيفة الشبكية الطبيعية ، بما في ذلك النقل الضوئي 1,2. في الآونة الأخيرة ، تم تكليف RPE بدور رئيسي إضافي في تنظيم نمو العين3 ، وبالتالي تطوير قصر النظر4. يعتمد هذا التعيين على الموقع الحرج ل RPE ، المتداخل بين شبكية العين والمشيمية والقبول الواسع الآن بأن نمو العين ، وبالتالي الأخطاء الانكسارية يتم تنظيمها محليا5. يعتقد أن RPE يلعب دورا رئيسيا كمتابع إشارة ، يربط شبكية العين ، المصدر المفترض للإشارات المعدلة للنمو ، بالمشيمية والصلبة ، وهما الهدفان للإشارات المنقولة6،7،8.
لا يمكن اعتبار الزيادة في الطول المحوري التي تميز معظم قصر النظر حميدة ، حيث تمثل التغيرات الفسيولوجية المرضية التي تشمل شبكية العين و / أو المشيمية و / أو الصلبة عواقب لا مفر منها ومعترف بها الآن لاستطالة العين المفرطة 7,9. في هذا السياق ، ربما يكون RPE هو الأكثر ضعفا ، لأنه ، كونه نسيجا غير ميتوتي ، فهو قادر فقط على استيعاب الغرفة الزجاجية المتوسعة عن طريق تمدد الخلايا الفردية وترققها. في حين أن دوره في الأمراض المرتبطة بقصر النظر ، مثل الضمور البقعي قصير النظر ، لم يتم فهمه بالكامل بعد ، فقد تورط RPE في التسبب في عدد من أمراض الشبكية الأخرى ، بما في ذلك الضمور الجغرافي ، أحد الأسباب الرئيسية للعمى ، والذي يرتبط بتشوهات موثقة في شبكية العين ، RPE ، والمشيمية10,11 ، 12.
من المحتمل أن يفتح العزل الناجح لخلايا RPE ، الخالية من التلوث من أنسجة العين المجاورة ، العديد من الفرص البحثية لاكتساب رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء مجموعة متنوعة من أمراض العين / الشبكية. ومع ذلك ، فقد ثبت أن عزل RPE يمثل تحديا ، حيث استخدمت العديد من الدراسات المنشورة عينات شبكية العين / RPE أو RPE / المشيمية المدمجة لهذا السبب13،14،15. اقتصرت الدراسات التي تنطوي على عزل ناجح ل RPE لجودة مناسبة لدراسات البيولوجيا الجزيئية على عيون الفرخ والفأر16,17. على سبيل المثال ، طريقة عزل RPE المتزامنة وتثبيت الحمض النووي الريبي (SRIRS) التي وصفها Wang et al.18. لا يبدو أن عزل خلايا RPE في الفئران يعمل بشكل جيد في عيون خنزير غينيا. يمثل البروتوكول الموصوف هنا تحسينا لنهج تم تصميمه في البداية بعيون زبابة الأشجار من قبل أحد المؤلفين (MF) وأثبت أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة ، مناسبة لتحليلات الحمض النووي الريبي والبيولوجيا الجزيئية الأخرى ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تتوافق جميع رعاية الحيوانات والعلاجات المستخدمة في هذه الدراسة مع بيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية. تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان بجامعة كاليفورنيا ، بيركلي.
1. استئصال عين خنزير غينيا
- القتل الرحيم لخنزير غينيا عن طريق الحقن داخل القلب من بنتوباربيتال الصوديوم الذي يتم تسليمه تحت التخدير (5٪ إيزوفلوران في الأكسجين).
- قم باستئصال العينين بمساعدة الملقط والمقص ، وانقلها على الفور إلى طبق بتري 10 سم مع محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) للغسيل. نقل العيون إلى حل PBS جديد.
ملاحظة: يوصى باستخدام لوحة 6 آبار تحتوي على 4 مل من المحلول لكل بئر.
2. عزل كأس العين الخلفي للعين ومجمع RPE / المشيمية / الصلبة
- بمساعدة مجهر تشريح ، استخدم إبرة 18 G لعمل شق صغير أولي في الصلبة ، حوالي 1.0 مم خلف الحدود القاحفية (أي بين القرنية والصلبة) (الشكل 1 أ) ؛ ثم استخدم المقص لإزالة الجزء الأمامي ، بما في ذلك القرنية والقزحية والجسم الهدبي والعدسة البلورية.
- بعد ذلك ، العمل مع كوب العين الخلفي المتبقي ، افصل شبكية العين عن مجمع RPE / المشيمية / الصلبة. استخدم الملقط للإمساك أولا ثم شد منطقة Zinn برفق ثم تقشير شبكية العين تدريجيا دون تجزئة (الشكل 1 ب).
ملاحظة: يجب عدم إمساك الشبكية مباشرة لتجنب تجزؤ الشبكية وعزل أنسجة الشبكية غير الكامل. استخدام المجهر ضروري لخطوة التشريح هذه.
3. عزل RPE عن المشيمية
- بعد إزالة الشبكية بالكامل ، اغمر كوب العين الخلفي المتبقي ، والذي يتضمن RPE والمشيمية والصلبة ، في كاشف تخزين الأنسجة لمدة 5 دقائق (انظر جدول المواد).
ملاحظة: استخدم صفيحة من 12 بئرا مع آبار محددة ، كل منها مملوء ب 2 مل من كاشف تخزين الأنسجة. - انقل كوب العين إلى بئر آخر مملوء ب 4 مل من PBS لمدة 10 ثوان قبل نقله إلى بئر ثالث مملوء ب 2 مل من PBS.
- قم بتوصيل إبرة 30 جم بحقنة سعة 1 مل مملوءة ب PBS لخطوة عزل RPE النهائية. اضغط برفق على المحقنة لإنشاء تيار نفاث من PBS ؛ أولا ، وجه هذا الدفق إلى RPE لعمل تمزق صغير أو ثقب فيه ، ثم قم بتوجيه تيار PBS إلى الفتحة التي تم إنشاؤها لفصل RPE كورقة من المشيمية (الشكل 1C).
ملاحظة: ينتج عن انفصال RPE كورقة أكبر عينة RPE. مرة أخرى ، يعد استخدام المجهر ضروريا لهذه الخطوة. - بعد فصل RPE عن المشيمية (الشكل 1D) ، اجمع أنسجة RPE في حقنة عديمة الإبر سعة 1 مل ، ثم انقل العينة المجمعة إلى أنبوب سعة 1.5 مل.
- جهاز طرد مركزي أنبوب 1.5 مل مع RPE المجمعة عند 8000 × جم لمدة دقيقة واحدة للحصول على حبيبات RPE (الشكل 2A).
- تخلص من محلول PBS ، واستبدله ب 350 مل من محلول التحلل ، كما هو مدرج في مجموعات عزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد) ؛ ماصة 20x لخلط ، وبالتالي الحفاظ على جودة العينة. للتخزين والحفظ على المدى الطويل ، انقل العينات إلى مجمد -80 درجة مئوية.
ملاحظة: المخزن المؤقت للتحلل هو مكون خاص بمجموعة عزل الحمض النووي الريبي لتحلل الخلايا والأنسجة قبل عزل الحمض النووي الريبي وعزل الحمض النووي الريبي / الحمض النووي / البروتين في وقت واحد. لتعطيل الحمض النووي الريبي في المحللة ، تأكد من إضافة β-mercaptoethanol إلى المخزن المؤقت للتحلل (10 ميكرولتر من β-mercaptoethanol لكل 1 مل من محلول التحلل).
4. استخراج RPE-RNA
- استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد) لعزل وجمع الحمض النووي الريبي من عينات RPE باتباع تعليمات الشركة المصنعة المقدمة. تقييم جودة العينة عن طريق الرحلان الكهربائي.
ملاحظة: أسفر البروتوكول الموصوف عن منتج عالي الجودة (أي رقم تكامل الحمض النووي الريبي [RIN] أكثر من 8.0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أظهر تحليل عينات RPE التي تم جمعها باستخدام البروتوكول أعلاه الحمض النووي الريبي المحفوظ جيدا (RIN >8.0 ، الشكل 2B) ، مع 240.2 نانوغرام ± 35.1 نانوغرام لكل عين (ن = 8 ، NanoDrop ، الشكل 2B). لمزيد من التقييم لجودة عينات RPE المعزولة ، لا سيما عدم وجود ملوثات المشيمية والصلبة ، قمنا بفحص التعبير عن الجينات التمثيلية لكل من الأنسجة الأخيرة في عينات RPE19. أظهرت عينات RPE تعبيرا أعلى بكثير عن Rpe65 (جين خاص ب RPE) مقارنة بمستويات تعبير Rpe65 في المشيمية والصلبة (الجدول 1 والشكل 2C). في المقابل ، أظهرت عينات RPE الحد الأدنى من التعبير عن Col1a1 ، الجين المحدد للمشيمية الصلبة (الشكل 2D).
الشكل 1: إجراء جمع صحائف قواعد الإجراءات والإثبات . (أ) عين خنزير غينيا البالغة من العمر أسبوعين مع الشق الأول. (ب) ثم يتم فصل الجزء الأمامي (القرنية والقزحية والعدسة) والجسم الزجاجي والشبكية عن كأس العين الخلفي (RPE والمشيمية والصلبة). (ج) يتم استخدام تيار نفاث من PBS ، يتم توصيله عبر إبرة 30 G ، لفصل RPE (D) كورقة (أسهم سوداء) من المشيمية. تستغرق العملية من الشق الأول إلى مجموعة RPE من 5 إلى 7 دقائق. اختصار: RPE = ظهارة صبغة الشبكية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إجراء تقييم جودة عينات RPE المعزولة . (أ) صورة تمثيلية لعينة RPE في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل بعد تدويرها. (ب) ناتج محلل حيوي تمثيلي للحمض النووي الريبي المستخرج من عينات RPE المجمعة. (ج، د) مستويات التعبير الجيني ل Rpe65 ، وهو جين خاص ب RPE ، و Col1a1 ، والذي لا يتم التعبير عنه أو الحد الأدنى منه في RPE ، مقاسا بواسطة RT-qPCR في عينات RPE والمشيمية والصلبة من n = 3 غير معالجة ؛ تم تطبيع مجموعتي البيانات إلى β-actin. ** P < 0.01; P < 0.001. تم تعديل هذا الرقم من Goto et al.19. الاختصارات: RPE = ظهارة الصباغ الشبكية. β-أكتين = بيتا أكتين ؛ Col1a1 = سلسلة الكولاجين من النوع الأول ألفا -1 ؛ Rpe65 = الريتينويد إيزوميروهيدرولاز ؛ RT-qPCR = تفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل للنسخ العكسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الجين | التمهيدي الأمامي (5 'إلى 3') | التمهيدي العكسي (5 'إلى 3') | ||||
| كول1أ1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| آر بي إي 65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β أكتين | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
الجدول 1: تسلسل النوكليوتيدات للبادئات المستخدمة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في تحليل جودة العينة. الاختصارات: β-أكتين = بيتا أكتين. Col1a1 = سلسلة الكولاجين من النوع الأول ألفا 1 ؛ Rpe65 = الريتينويد إيزوميروهيدرولاز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة ، نصف طريقة لعزل RPE ، مناسبة لتحليلات التعبير الجيني RPE ، من عيون خنازير غينيا الصغيرة المصطبغة. تتمثل مزايا هذا البروتوكول في أنه ينتج عينات RPE عالية الجودة وخالية نسبيا من التلوث ، مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي بشكل مناسب للتحليلات الخاصة بالحمض النووي الريبي ، ومع ذلك ، فهو بسيط وفعال نسبيا. بينما في المثال المقدم هنا ، تم جمع عينات RPE من عيون خنزير غينيا الصغير (2 أسابيع) ، كما تم استخدام البروتوكول بنجاح لجمع عينات RPE من الحيوانات الأكبر سنا (الشباب).
بالنسبة للباحثين الذين لديهم الحد الأدنى من الخبرة السابقة في جراحة العين أو تسلخها ، يمكن أن تكون الخطوة 2.1 والخطوة 2.2 من البروتوكول صعبة. التفاصيل الحرجة في الخطوة 2.1 هي موقع الشق الأولي في الصلبة ، والذي يجب وضعه بدقة 1.0 مم خلف الحافة بحيث تتم إزالة القزحية والعدسة مع القرنية عند فصل الجزء الأمامي. بدلا من ذلك ، إذا ظلت القزحية متصلة بالجزء الخلفي من العين ، فمن الصعب العثور على منطقة زين ، وهو أمر أساسي لفصل شبكية العين بنجاح في الخطوة التالية. كما هو مذكور في البروتوكول ، من أجل الانفصال الناجح للشبكية ، من الأهمية بمكان أيضا عدم إمساك شبكية العين مباشرة بالملقط لتجنب تجزئتها. تبدو شبكية عين خنزير غينيا أكثر هشاشة من شبكية الفأر ، على الأرجح بسبب طبيعتها اللاوعائية20. من الناحية المثالية ، يجب غمر كوب العين الخلفي المعزول ، الذي يتكون من RPE ، والمشيمية ، والصلبة ، في كاشف تخزين الأنسجة في غضون 5 دقائق من استئصال العين لضمان الحفاظ الكافي على الحمض النووي الريبي في عينة RPE المجمعة.
ويبدو أن طريقة SRIRS، التي وضعت لغرض محدد هو جمع عينات عالية الجودة من RPE من عيون الفئران، قد حققت هذا الهدف بالنسبة لعيون الفئران؛ وتفيد التقارير بأنها تتسم بالكفاءة والفعالية على حد سواء18. كما تم استخدام هذه التقنية بنجاح لجمع RPE من عيون المتبرعين البشريينالأصحاء 21. ومع ذلك ، استنادا إلى تجربة المؤلفين ، فإن طريقة SRIRS هذه ليست مناسبة لجمع RPE من عيون خنزير غينيا ، وزبابة الأشجار ، والأبوسوم ، على الرغم من أن الأسباب الكامنة وراء ذلك غير واضحة. من خلال الإبلاغ عن التقنية الموصوفة هنا لعزل وجمع RPE من عيون خنازير غينيا الصغيرة ، نأمل في تلبية حاجة مهمة غير ملباة في مجال أبحاث قصر النظر.
فيما يتعلق بقيود البروتوكول الموصوف ، فإن البروتوكول الرئيسي هو الحاجة إلى فترة من التدريب العملي لضمان الجمع الفعال للعينات ، حيث أن وقت الإكمال هو المفتاح ، بالإضافة إلى نقاء عينات RPE التي تم جمعها. الباحثون الذين ليس لديهم خبرة في تشريح العين المجهري أو الجراحة سيكونون في أمس الحاجة إلى التدريب. على الرغم من الإبلاغ عن العديد من طرق عزل RPE22,23 ، فإن الطريقة كما هو موضح هنا ليست مناسبة لمزارع خلايا RPE أو تحليلات البروتين بسبب استخدام كاشف تثبيت الحمض النووي الريبي.
منذ فترة طويلة من المسلم به أن RPE يلعب أدوارا حاسمة ليس فقط في الحفاظ على صحة ووظيفة شبكية العين ولكن أيضا في الأمراض ذات الصلة. حقيقة أن RPE معترف به الآن أيضا للعب دور رئيسي في تنظيم نمو العين وتطور قصر النظر قد وسعت بشكل كبير نطاق أسئلة البحث ، والتي قد تكون القدرة على جمع عينات RPE عالية الجودة من عيون خنازير غينيا ، كما هو موضح هنا ، أو الثدييات الأخرى المستخدمة كنماذج حيوانية أساسية لتوفير رؤى جديدة. قد تقدم هذه الدراسات أيضا رؤى جديدة حول المضاعفات المرضية لقصر النظر ، بما في ذلك اعتلال البقعة قصير النظر ، والذي من المتوقع أن ترتفع أرقام انتشاره بالتوازي مع أرقام انتشار قصر النظر في حد ذاته.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
هذه الدراسة مدعومة من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز زمالات أبحاث العلوم في الخارج (SG) ، وباحث ما بعد الدكتوراه لوريس وديفيد ريتش (SG) ، ومنحة من المعهد الوطني للعيون التابع للمعاهد الوطنية للصحة (R01EY012392; كف. و.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
