Summary
我们描述了一种从年轻色素豚鼠的眼睛中分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简单有效的方法。该程序允许对分离的RPE进行后续分子生物学研究，包括基因表达分析。
Abstract
该协议描述了从年轻色素豚鼠的眼睛中分离视网膜色素上皮（RPE）的细胞，以便在分子生物学研究中的潜在应用，包括基因表达分析。在眼睛生长调节和近视的背景下，RPE可能充当生长调节信号的细胞中继，因为它位于视网膜和眼睛的两壁（如脉络膜和巩膜）之间。虽然已经为小鸡和小鼠开发了分离RPE的方案，但这些方案已被证明不能直接转化为豚鼠，豚鼠已成为一种重要且广泛使用的哺乳动物近视模型。在这项研究中，分子生物学工具用于检查特定基因的表达，以确认样品没有来自邻近组织的污染。该方案的价值已经在暴露于近视诱导光学离焦的年轻色素豚鼠的 RPE 的 RNA-Seq 研究中得到证明。除了眼睛生长调节之外，该协议在视网膜疾病的研究中还有其他潜在的应用，包括近视性黄斑病变，这是近视失明的主要原因之一，其中与RPE有关。该技术的主要优点是相对简单，一旦完善，即可产生适合分子生物学研究（包括RNA分析）的高质量RPE样品。
Introduction
RPE包括位于神经视网膜和血管脉络膜之间的独特单层色素细胞，RPE在正常视网膜功能的发育和维持（包括光转导1，2）方面具有公认的作用。最近，RPE在眼睛生长调节3中被赋予了额外的关键作用，因此，近视4的发展。该分配基于RPE的关键位置，位于视网膜和脉络膜之间，以及现在广泛接受的眼睛生长以及因此屈光不正在局部调节5。RPE被认为作为信号中继起着关键作用，将视网膜（生长调节信号的假定来源）连接到脉络膜和巩膜，这是中继信号的两个目标6，7，8。
大多数近视的特征是轴向长度的增加不能被认为是良性的，涉及视网膜、脉络膜和/或巩膜的病理生理变化代表了不可避免的，现在公认的眼部过度伸长的后果7，9。在这种情况下，RPE可能是最脆弱的，因为作为非有丝分裂组织，它只能通过单个细胞的拉伸和变薄来容纳膨胀的玻璃体室。虽然RPE在近视相关病变（如近视性黄斑变性）中的作用尚未完全了解，但RPE与许多其他视网膜疾病的发病机制有关，包括地理萎缩，这是失明的主要原因之一，与记录的视网膜异常有关，RPE和脉络膜10，11，12.
成功分离RPE细胞，不受邻近眼组织的污染，可能开辟了许多研究机会，以获得对各种眼睛/视网膜疾病机制的新见解。然而，RPE的分离已被证明具有挑战性，许多已发表的研究因此使用组合视网膜/ RPE或RPE /脉络膜样本13，14，15。涉及成功分离适合分子生物学研究的质量的RPE的研究仅限于小鸡和小鼠眼睛16，17。例如，Wang等人描述的同步RPE分离和RNA稳定（SRIRS）方法18。在小鼠中分离RPE细胞似乎在豚鼠眼睛中效果不佳。这里描述的方案代表了一种方法的改进，该方法最初由其中一位作者（M.F.）用树鼩眼制作原型，并已被证明可以从年轻色素豚鼠的眼睛中产生高质量的RPE样品，适用于RNA和其他分子生物学分析19。
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Protocol
本研究中使用的所有动物护理和治疗均符合ARVO关于在眼科和视力研究中使用动物的声明。实验方案得到了加州大学伯克利分校动物护理和使用委员会的批准。
1.豚鼠眼摘除术
- 用心内注射在麻醉下递送的戊巴比妥钠（5%异氟醚氧溶液）对豚鼠实施安乐死。
- 借助镊子和剪刀将眼睛去核，并立即将它们转移到带有无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）的10厘米培养皿中进行洗涤。将眼睛转移到新鲜的PBS溶液中。
注意：建议使用每孔含有 4 mL 溶液的 6 孔板。
2.分离眼后眼杯和RPE/脉络膜/巩膜复合体
- 在解剖显微镜的帮助下，使用18 G针在巩膜上做一个初始小切口，在角膜缘边界后约1.0毫米（即角膜和巩膜之间）（图1A）;然后用剪刀去除前段，包括角膜、虹膜、睫状体和晶状体。
- 接下来，使用剩余的后眼节眼罩，将视网膜与 RPE/脉络膜/巩膜复合体分离;使用镊子首先抓住然后轻轻拉扯Zinn的带状体，然后逐渐剥离视网膜而不会碎裂（图1B）。
注意：不得直接抓住视网膜，以避免视网膜破碎和视网膜组织分离不完全。显微镜的使用对于该解剖步骤至关重要。
3. 将 RPE 与脉络膜隔离
- 完全去除视网膜后，将剩余的后眼杯（包括RPE，脉络膜和巩膜）浸入组织储存试剂中5分钟（参见 材料表）。
注意：使用带有已识别孔的 12 孔板，每个孔填充 2 mL 组织储存试剂。 - 将眼罩转移到另一个装有 4 mL PBS 的孔中 10 秒，然后将其移至装有 2 mL PBS 的第三个孔中。
- 将 30 G 针头连接到装有 PBS 的 1 mL 注射器上，以进行最后的 RPE 分离步骤。轻轻推动注射器以产生PBS喷射流;首先，将此流对准 RPE 以在其上留下一个小撕裂或孔，然后将 PBS 流引导到创建的开口中，将 RPE 作为片材从脉络膜上分离（图 1C）。
注意：将 RPE 分离为片材会产生最大的 RPE 样本。同样，使用显微镜对于此步骤至关重要。 - 将RPE从脉络膜上分离后（图1D），将RPE组织收集在无针1 mL注射器中，然后将收集的样品转移到1.5 mL管中。
- 将收集的RPE以8，000 × g 离心1.5 mL管以获得RPE沉淀（图2A）。
- 丢弃PBS溶液，并用RNA分离试剂盒中包含的350 mL裂解缓冲液替换（参见 材料表）;移液器20倍混合，从而保持样品的质量。为了长期储存和保存，将样品转移到-80°C冰箱中。
注意：裂解缓冲液是RNA分离试剂盒的专有成分，用于在RNA分离和同时RNA/DNA/蛋白质分离之前进行细胞和组织裂解。要灭活裂解物中的RNA酶，请务必向裂解缓冲液中加入β-巯基乙醇（每1 mL裂解缓冲液10 μL β-巯基乙醇）。
4. RPE-RNA提取
- 按照制造商提供的说明，使用 RNA 分离试剂盒（参见 材料表）从 RPE 样品中分离和收集 RNA。通过电泳 评估 样品的质量。
注意：所描述的方案产生了高质量的产品（即RNA完整性数[RIN]超过8.0）。
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Representative Results
使用上述方案收集的RPE样品的分析显示保存良好的RNA（RIN >8.0，图2B），每只眼睛240.2 ng±35.1 ng（n = 8，NanoDrop，图2B）。 为了进一步评估分离的RPE样品的质量，特别是没有脉络膜和巩膜污染物，我们检查了RPE样品中每种组织的代表性基因的表达19。与脉络膜和巩膜中的Rpe65表达水平相比，RPE样品显示出Rpe65（RPE特异性基因）的表达显着更高（表1和图2C）。相比之下，RPE样品显示Col1a1（选定的脉络膜 - 巩膜特异性基因）的表达最小（图2D）。
图 1：收集 RPE 表的过程 。 （A）2周大的豚鼠眼睛，第一个切口。（B）然后将前段（角膜，虹膜和晶状体），玻璃体和视网膜与后眼杯（RPE，脉络膜和巩膜）分开。（C）通过30G针 头输送 的PBS喷射流用于将RPE（D）作为片状（黑色箭头）从脉络膜中分离。从第一个切口到RPE收集的过程需要5-7分钟。缩写：RPE = 视网膜色素上皮。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：评估分离的 RPE 样品质量的程序。 （A） 旋转后 1.5 mL 微量离心管中 RPE 样品的代表性图像。（B）从收集的RPE样品中提取的RNA的代表性生物分析仪输出。（中，四）Rpe65（一种 RPE 特异性基因）和 Col1a1（在 RPE 中未表达或表达最少）的基因表达水平，通过 RT-qPCR 在 n = 3 只未经治疗的动物的 RPE、脉络膜和巩膜样品中测量;两个数据集均标准化为β-肌动蛋白。** P < 0.01;P < 0.001。该数字已从Goto等人19修改而来。缩写：RPE = 视网膜色素上皮;β-肌动蛋白=β-肌动蛋白;Col1a1 = 胶原蛋白 I 型 α-1 链;Rpe65 = 类视黄醇异构体水解酶;RT-qPCR = 逆转录定量聚合酶链反应。请点击此处查看此图的大图。
| 基因 | 正向底漆（5' 至 3'） | 反向底漆（5' 至 3'） | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| Rpe65 | GCCCTTCTGCAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-肌动蛋白 | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
表1：样品质量分析中用于PCR扩增的引物的核苷酸序列。 缩写：β-肌动蛋白=β-肌动蛋白;Col1a1 = I型胶原蛋白α 1链;Rpe65 = 类视黄醇异构体水解酶。
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Discussion
在本文中，我们描述了一种从年轻的色素有色豚鼠的眼睛中分离RPE的方法，适用于RPE基因表达分析。该协议的优点是它产生相对不受污染的高质量RPE样品，RNA适合RNA特异性分析，但相对简单有效。虽然在这里提供的示例中，RPE样本是从年轻（2周大）豚鼠的眼睛收集的，但该方案也已成功用于从老年（年轻成年）动物中收集RPE样本。
对于眼科手术或解剖经验很少的研究人员来说，方案步骤2.1和步骤2.2可能具有挑战性。步骤2.1中的关键细节是巩膜中初始切口的位置，应将其准确放置在角膜缘后方1.0毫米处，以便在分离前段时将虹膜和晶状体与角膜一起移除。相反，如果虹膜仍然附着在后眼段上，则很难找到Zinn的带状体，这是下一步成功分离视网膜的关键。如协议中所述，为了成功脱离视网膜，同样重要的是不要用镊子直接抓住视网膜以避免其破碎。豚鼠视网膜看起来比小鼠视网膜更脆弱，可能是因为它的无血管性质20。理想情况下，将分离的后眼杯（包括 RPE、脉络膜和巩膜）在眼部眼摘除后 5 分钟内浸入组织储存试剂中，以确保收集的 RPE 样品中 RNA 的充分保存。
SRIRS方法是为从小鼠眼睛收集高质量的RPE样本而开发的，似乎已经实现了小鼠眼睛的目标;据报道，它既高效又有效18.该技术也已成功用于从健康的人类供体眼睛中收集RPE21。然而，根据作者的经验，这种SRIRS方法不适合从豚鼠，树鼩和负鼠的眼睛中收集RPE，尽管其根本原因尚不清楚。通过报告这里描述的从幼小豚鼠眼睛中分离和收集RPE的技术，我们希望解决近视研究领域未满足的重要需求。
就所描述的协议的局限性而言，主要是需要一段时间的实践培训以确保有效收集样品，因为除了收集的RPE样品的纯度外，完成时间是关键。没有眼部显微解剖或手术经验的研究人员将最需要培训。尽管已经报道了几种RPE分离方法22，23，但由于使用了RNA稳定试剂，因此此处描述的方法不适用于RPE细胞培养或蛋白质分析。
长期以来，人们一直认为RPE不仅在维持视网膜的健康和功能方面，而且在相关疾病中也起着关键作用。RPE现在也被认为在眼部生长调节和近视发育中发挥关键作用，这一事实大大拓宽了研究问题的范围，为此，从豚鼠的眼睛收集高质量RPE样本的能力，如这里所述，或其他用作动物模型的哺乳动物可能是提供新见解的关键。这些研究也可能为近视的病理并发症提供新的见解，包括近视性黄斑病变，预计其患病率数字将与近视患病率数字 本身同步上升。
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Disclosures
作者声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究得到了日本科学促进会海外研究奖学金（S.G.），Loris和David Rich博士后学者（S.G.）以及国立卫生研究院国家眼科研究所（R01EY012392;C.F.W.）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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