Summary
We beschrijven een eenvoudige en efficiënte methode voor het isoleren van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) cellen uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's. Deze procedure maakt follow-up moleculair biologisch onderzoek naar de geïsoleerde RPE mogelijk, inclusief genexpressieanalyses.
Abstract
Dit protocol beschrijft de isolatie van cellen van het retinale pigmentepitheel (RPE) uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's voor mogelijke toepassing in moleculair biologische studies, inclusief genexpressieanalyses. In de context van ooggroeiregulatie en bijziendheid speelt de RPE waarschijnlijk een rol als een cellulair relais voor groeimodulerende signalen, omdat het zich bevindt tussen het netvlies en de twee wanden van het oog, zoals het vaatvlies en sclera. Hoewel er protocollen voor het isoleren van de RPE zijn ontwikkeld voor zowel kuikens als muizen, zijn deze protocollen niet direct vertaalbaar gebleken naar de cavia, die een belangrijk en veel gebruikt zoogdierbijziendheidsmodel is geworden. In deze studie werden moleculaire biologische hulpmiddelen gebruikt om de expressie van specifieke genen te onderzoeken om te bevestigen dat de monsters vrij waren van besmetting van de aangrenzende weefsels. De waarde van dit protocol is al aangetoond in een RNA-Seq-studie van RPE van jonge gepigmenteerde cavia's die zijn blootgesteld aan bijziendheid inducerende optische onscherpte. Naast ooggroeiregulatie heeft dit protocol andere potentiële toepassingen in studies van netvliesaandoeningen, waaronder myopische maculopathie, een van de belangrijkste oorzaken van blindheid bij myopes, waarbij de RPE betrokken is geweest. Het grote voordeel van deze techniek is dat het relatief eenvoudig is en eenmaal geperfectioneerd, hoogwaardige RPE-monsters oplevert die geschikt zijn voor moleculair-biologische studies, waaronder RNA-analyse.
Introduction
De RPE bestaat uit een unieke monolaag van gepigmenteerde cellen tussen het neurale netvlies en het vasculaire vaatvlies, en de RPE heeft een goed erkende rol in de ontwikkeling en het onderhoud van de normale retinale functie, waaronder fototransductie 1,2. Meer recent heeft de RPE een extra sleutelrol gekregen in ooggroeiregulatie3 en daarmee de ontwikkeling van bijziendheid4. Deze toewijzing is gebaseerd op de kritische locatie van de RPE, tussen het netvlies en het vaatvlies en de inmiddels brede acceptatie dat ooggroei en dus refractiefouten lokaal worden gereguleerd5. De RPE wordt verondersteld een sleutelrol te spelen als een signaalrelais, dat het netvlies, de veronderstelde bron van groeimodulatorische signalen, verbindt met het vaatvlies en sclera, de twee doelen van de relaissignalen 6,7,8.
De toename van de axiale lengte die de meeste bijziendheid kenmerkt, kan niet als goedaardig worden beschouwd, waarbij pathofysiologische veranderingen met betrekking tot het netvlies, het vaatvlies en / of de sclera onvermijdelijke en nu algemeen erkende gevolgen van overmatige oculaire rek vertegenwoordigen 7,9. In deze context is de RPE misschien wel het meest kwetsbaar, omdat het, als niet-mitotisch weefsel, alleen in staat is om de uitdijende glasachtige kamer te accommoderen door het uitrekken en dunner worden van individuele cellen. Hoewel zijn rol in myopie-gerelateerde pathologieën, zoals myopische maculaire degeneratie, nog niet volledig is begrepen, is de RPE betrokken bij de pathogenese van een aantal andere retinale ziekten, waaronder geografische atrofie, een van de belangrijkste oorzaken van blindheid, die geassocieerd is met gedocumenteerde afwijkingen in het netvlies, RPE en vaathol10,11, 12.
De succesvolle isolatie van RPE-cellen, vrij van besmetting uit aangrenzende oogweefsels, opent mogelijk veel onderzoeksmogelijkheden om nieuwe inzichten te krijgen in de mechanismen die ten grondslag liggen aan een verscheidenheid aan oog- / netvliesaandoeningen. De isolatie van de RPE is echter een uitdaging gebleken, met veel gepubliceerde studies die om deze reden gebruik maken van gecombineerde retina / RPE- of RPE / choroide-monsters13,14,15. Studies met betrekking tot de succesvolle isolatie van de RPE van een kwaliteit die geschikt is voor moleculair biologisch onderzoek zijn beperkt tot kuiken- en muizenogen16,17. Bijvoorbeeld de simultane RPE-isolatie en RNA-stabilisatie (SRIRS) methode beschreven door Wang et al.18. Het isoleren van RPE-cellen bij muizen lijkt niet goed te werken in caviaogen. Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een verfijning van een aanpak die aanvankelijk door een van de auteurs (M.F.) met boomspitsmuisogen werd geprototypeerd en waarvan is bewezen dat het hoogwaardige RPE-monsters oplevert, geschikt voor RNA en andere moleculaire biologische analyses, uit de ogen van jonge gepigmenteerde cavia's19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierverzorging en behandelingen die in dit onderzoek werden gebruikt, voldeden aan de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. De experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de University of California, Berkeley.
1. Enucleatie van het caviaoog
- Euthanaseer een cavia met een intracardiale injectie van natriumpentobarbital toegediend onder anesthesie (5% isofluraan in zuurstof).
- Enucleeer de ogen met behulp van een tang en een schaar en breng ze onmiddellijk over naar een petrischaal van 10 cm met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om te wassen. Breng de ogen over naar een verse PBS-oplossing.
OPMERKING: Een plaat met 6 putten met 4 ml oplossing per put wordt aanbevolen.
2. Isolatie van de oculaire achterste oogschelp en RPE / vaatvlies / sclera-complex
- Gebruik met behulp van een ontleedmicroscoop een naald van 18 G om een eerste kleine incisie in de sclera te maken, ongeveer 1,0 mm achter de limbale grens (d.w.z. tussen het hoornvlies en de sclera) (figuur 1A); Gebruik vervolgens een schaar om het voorste segment te verwijderen, inclusief het hoornvlies, de iris, het ciliaire lichaam en de kristallijne lens.
- Vervolgens, werkend met de resterende achterste oculaire segmentoogschelp, maak je het netvlies los van het RPE / vaatvlies / sclera-complex; gebruik een tang om eerst de zonule van Zinn vast te pakken en vervolgens voorzichtig aan te trekken en vervolgens het netvlies geleidelijk af te pellen zonder fragmentatie (figuur 1B).
OPMERKING: Het netvlies mag niet direct worden vastgepakt om retinale fragmentatie en onvolledige isolatie van het netvliesweefsel te voorkomen. Het gebruik van een microscoop is essentieel voor deze dissectiestap.
3. Isolatie van de RPE van het vaatvlies
- Nadat het netvlies volledig is verwijderd, dompelt u de resterende achterste oogcup, waaronder de RPE, het vaatstuk en de sclera, gedurende 5 minuten onder in weefselopslagreagens (zie de tabel met materialen).
OPMERKING: Gebruik een plaat met 12 putten met geïdentificeerde putjes, elk gevuld met 2 ml van het weefselopslagreagens. - Breng de oogbeker over naar een andere put gevuld met 4 ml PBS gedurende 10 s voordat u deze verplaatst naar een derde put gevuld met 2 ml PBS.
- Bevestig een naald van 30 G aan een spuit van 1 ml gevuld met PBS voor de laatste RPE-isolatiestap. Druk zachtjes op de spuit om een straalstroom van PBS te creëren; richt eerst deze stroom op de RPE om er een kleine scheur of gat in te maken en leid vervolgens de stroom PBS in de gecreëerde opening om de RPE als een vel van het vaatvlies los te maken (figuur 1C).
OPMERKING: Het loslaten van de RPE als vel levert het grootste RPE-monster op. Nogmaals, het gebruik van een microscoop is essentieel voor deze stap. - Nadat u de RPE van het vaatvlies hebt losgemaakt (figuur 1D), verzamelt u het RPE-weefsel in een naaldloze spuit van 1 ml en brengt u het verzamelde monster vervolgens over in een buis van 1,5 ml.
- Centrifugeer de buis van 1,5 ml met de verzamelde RPE op 8.000 × g gedurende 1 minuut om een RPE-pellet te verkrijgen (figuur 2A).
- Gooi de PBS-oplossing weg en vervang deze door 350 ml lysisbuffer, zoals opgenomen in RNA-isolatiekits (zie de tabel met materialen); pipet 20x om te mengen en zo de kwaliteit van het monster te behouden. Voor langdurige opslag en conservering brengt u de monsters over naar een vriezer van −80 °C.
OPMERKING: De lysisbuffer is een gepatenteerd onderdeel van de RNA-isolatiekit voor cel- en weefsellysis vóór RNA-isolatie en gelijktijdige RNA / DNA / eiwitisolatie. Om de RNA's in het lysaat te inactiveren, moet u β-mercaptoethanol toevoegen aan de lysisbuffer (10 μL β-mercaptoethanol per 1 ml lysisbuffer).
4. RPE-RNA extractie
- Gebruik een RNA-isolatiekit (zie de materiaaltabel) om het RNA uit de RPE-monsters te isoleren en te verzamelen volgens de instructies van de fabrikant. Evalueer de kwaliteit van het monster via elektroforese.
OPMERKING: Het beschreven protocol leverde een product van goede kwaliteit op (d.w.z. RNA-integriteitsnummer [RIN] van meer dan 8,0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De analyse van de RPE-monsters verzameld met behulp van het bovenstaande protocol toonde goed geconserveerd RNA (RIN >8.0, figuur 2B), met 240,2 ng ± 35,1 ng per oog (n = 8, NanoDrop, figuur 2B). Om de kwaliteit van de geïsoleerde RPE-monsters verder te evalueren, met name de afwezigheid van choroïdale en sclerale contaminanten, onderzochten we de expressie van representatieve genen voor elk van de laatste weefsels in de RPE-monsters19. De RPE-monsters toonden een significant hogere expressie van Rpe65 (een RPE-specifiek gen) in vergelijking met de Rpe65-expressieniveaus in het vaatvlies en de sclera (tabel 1 en figuur 2C). Daarentegen vertoonden de RPE-monsters minimale expressie van Col1a1, het geselecteerde choroid-sclera-specifieke gen (figuur 2D).
Figuur 1: Procedure voor het verzamelen van de RPE-vellen . (A) Een 2 weken oud caviaoog met de eerste incisie. (B) Het voorste segment (hoornvlies, iris en lens), glasvocht en netvlies worden dan gescheiden van de achterste oogschelp (RPE, vaatvlies en sclera). (C) Een straalstroom PBS, afgegeven via een naald van 30 G, wordt gebruikt om de RPE (D) los te maken als een vel (zwarte pijlen) van het vaatvlies. De procedure van de eerste incisie tot de RPE-collectie duurt 5-7 minuten. Afkorting: RPE = retinale pigmentepitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Procedure voor de beoordeling van de kwaliteit van de geïsoleerde RPE-monsters. (A) Representatief beeld van een RPE-monster in een microcentrifugebuis van 1,5 ml na te zijn gesponnen. (B) Representatieve bioanalysatoroutput voor RNA geëxtraheerd uit de verzamelde RPE-monsters. (C,D) De genexpressieniveaus van Rpe65, een RPE-specifiek gen, en Col1a1, dat niet of minimaal tot expressie komt in de RPE, gemeten met RT-qPCR in de RPE-, choroide- en sclerale monsters van n = 3 onbehandelde dieren; Beide datasets werden genormaliseerd naar β-actine. ** P < 0,01; P < 0,001. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Goto et al.19. Afkortingen: RPE = retinale pigmentepitheel; β-actine = bèta-actine; Col1a1 = collageen type-I alfa-1 keten; Rpe65 = retinoïde isomerohydrolase; RT-qPCR = kwantitatieve polymerasekettingreactie met omgekeerde transcriptie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gen | Forward Primer (5' tot 3') | Reverse Primer (5' tot 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-actine | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabel 1: Nucleotidesequenties van de primers die worden gebruikt voor PCR-amplificatie in de analyse van de monsterkwaliteit. Afkortingen: β-actine = Beta-actine; Col1a1 = collageen type I alfa 1 keten; Rpe65 = retinoïde isomerohydrolase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit artikel beschrijven we een methode voor het isoleren van RPE, geschikt voor RPE-genexpressieanalyses, uit de ogen van jonge, gepigmenteerde cavia's. De verdiensten van dit protocol zijn dat het hoogwaardige RPE-monsters oplevert die relatief vrij zijn van verontreiniging, waarbij RNA op de juiste manier wordt bewaard voor RNA-specifieke analyses en toch relatief eenvoudig en efficiënt is. Terwijl in het hier gegeven voorbeeld de RPE-monsters werden verzameld uit de ogen van een jonge (2 weken oude) cavia, is het protocol ook met succes gebruikt om RPE-monsters van oudere (jongvolwassen) dieren te verzamelen.
Voor onderzoekers met minimale eerdere ervaring met oogchirurgie of dissectie kunnen protocolstap 2.1 en stap 2.2 een uitdaging zijn. Het kritieke detail in stap 2.1 is de locatie van de initiële incisie in de sclera, die nauwkeurig 1,0 mm achter de limbus moet worden geplaatst, zodat de iris en de lens samen met het hoornvlies worden verwijderd bij het losmaken van het voorste segment. Als de iris in plaats daarvan aan het achterste oculaire segment blijft vastzitten, is het een uitdaging om de zonule van Zinn te vinden, wat de sleutel is tot het succesvol losmaken van het netvlies in de volgende stap. Zoals opgemerkt in het protocol, is het voor het succesvol loslaten van het netvlies ook van cruciaal belang dat het netvlies niet direct met de tang wordt vastgepakt om fragmentatie te voorkomen. Het netvlies van de cavia lijkt kwetsbaarder dan het netvlies van de muis, waarschijnlijk vanwege zijn avasculaire aard20. Idealiter moet de geïsoleerde achterste oogcup, bestaande uit de RPE, het vaatvlies en de sclera, binnen 5 minuten na de enucleatie van de ogen worden ondergedompeld in een weefselopslagreagens om de adequate bewaring van RNA in het verzamelde RPE-monster te waarborgen.
De SRIRS-methode, die is ontwikkeld met het specifieke doel om hoogwaardige monsters van RPE uit de ogen van muizen te verzamelen, lijkt dat doel voor muizenogen te hebben bereikt; Er wordt gemeld dat het zowel efficiënt als effectief is18. Deze techniek is ook met succes gebruikt om RPE te verzamelen van gezonde menselijke donorogen21. Op basis van de ervaring van de auteurs is deze SRIRS-methode echter niet geschikt voor het verzamelen van RPE uit de ogen van de cavia, boomspitsmuis en opossum, hoewel de onderliggende redenen hiervoor niet duidelijk zijn. Door de hier beschreven techniek te melden om RPE te isoleren en te verzamelen uit de ogen van jonge cavia's, hopen we tegemoet te komen aan een belangrijke onvervulde behoefte in het onderzoeksveld van bijziendheid.
In termen van de beperkingen van het beschreven protocol, is de belangrijkste de noodzaak van een periode van hands-on training om de efficiënte verzameling van monsters te garanderen, omdat de tijd tot voltooiing de sleutel is, naast de zuiverheid van de verzamelde RPE-monsters. Onderzoekers die geen ervaring hebben met oculaire microdissectie of chirurgie zullen het meest behoefte hebben aan training. Hoewel verschillende RPE-isolatiemethoden zijn gerapporteerd22,23, is de methode zoals hier beschreven niet geschikt voor RPE-celculturen of eiwitanalyses vanwege het gebruik van een RNA-stabiliserend reagens.
Van de RPE wordt al lang erkend dat deze een cruciale rol speelt, niet alleen bij het behoud van de gezondheid en functie van het netvlies, maar ook bij gerelateerde ziekten. Het feit dat de RPE nu ook wordt erkend als een sleutelrol in de regulatie van oculaire groei en de ontwikkeling van bijziendheid heeft de reikwijdte van onderzoeksvragen aanzienlijk verbreed, waarvoor het vermogen om hoogwaardige RPE-monsters te verzamelen van de ogen van cavia's, zoals hier beschreven, of andere zoogdieren die als diermodellen worden gebruikt, de sleutel kan zijn tot het bieden van nieuwe inzichten. Dergelijke studies kunnen ook nieuwe inzichten bieden in de pathologische complicaties van myopie, waaronder myopische maculopathie, waarvoor kan worden verwacht dat de prevalentiecijfers parallel met de prevalentiecijfers van bijziendheid op zich zullen stijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Deze studie wordt ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), een Loris en David Rich Postdoctoral Scholar (S.G.), en een beurs van het National Eye Institute van de National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
