Summary
हम युवा पिगमेंटेड गिनी सूअरों की आंखों से रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) कोशिकाओं की कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक सरल और कुशल विधि का वर्णन करते हैं। यह प्रक्रिया जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सहित पृथक आरपीई पर अनुवर्ती आणविक जीव विज्ञान अध्ययन की अनुमति देती है।
Abstract
यह प्रोटोकॉल जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सहित आणविक जीव विज्ञान अध्ययनों में संभावित अनुप्रयोग के लिए युवा पिगमेंटेड गिनी सूअरों की आंखों से रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) की कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन करता है। आंखों के विकास विनियमन और मायोपिया के संदर्भ में, आरपीई संभवतः विकास मॉड्यूलेटरी संकेतों के लिए एक सेलुलर रिले के रूप में एक भूमिका निभाता है, क्योंकि यह रेटिना और आंख की दो दीवारों के बीच स्थित है, जैसे कि कोरॉयड और स्क्लेरा। जबकि आरपीई को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल चूजों और चूहों दोनों के लिए विकसित किए गए हैं, ये प्रोटोकॉल सीधे गिनी पिग के लिए ट्रांसलेटेबल साबित नहीं हुए हैं, जो एक महत्वपूर्ण और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला स्तनधारी मायोपिया मॉडल बन गया है। इस अध्ययन में, आणविक जीव विज्ञान उपकरणों का उपयोग विशिष्ट जीनों की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए किया गया था ताकि यह पुष्टि की जा सके कि नमूने आसन्न ऊतकों से संदूषण से मुक्त थे। इस प्रोटोकॉल का मूल्य पहले से ही मायोपिया-उत्प्रेरण ऑप्टिकल डिफोकस के संपर्क में आने वाले युवा पिगमेंटेड गिनी सूअरों से आरपीई के आरएनए-सेक अध्ययन में प्रदर्शित किया गया है। आंखों के विकास विनियमन से परे, इस प्रोटोकॉल में रेटिना रोगों के अध्ययन में अन्य संभावित अनुप्रयोग हैं, जिनमें मायोपिक मैकुलोपैथी शामिल है, जो मायोप्स में अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है, जिसमें आरपीई को फंसाया गया है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत सरल है और एक बार परिपूर्ण होने के बाद, आरएनए विश्लेषण सहित आणविक जीव विज्ञान अध्ययन के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले आरपीई नमूने उत्पन्न करता है।
Introduction
आरपीई में तंत्रिका रेटिना और संवहनी कोरॉयड के बीच स्थित रंजित कोशिकाओं का एक अनूठा मोनोलेयर शामिल है, और आरपीई में फोटोट्रांसडक्शन 1,2 सहित सामान्य रेटिना फ़ंक्शन के विकास और रखरखाव में अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त भूमिकाएं हैं। हाल ही में, आरपीई को आंखों के विकास विनियमन3 में एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण भूमिका सौंपी गई है और इस प्रकार, मायोपिया4 का विकास। यह असाइनमेंट आरपीई के महत्वपूर्ण स्थान पर आधारित है, जो रेटिना और कोरॉइड के बीच जुड़ा हुआ है और अब व्यापक स्वीकृति है कि आंखों की वृद्धि और इस प्रकार, अपवर्तक त्रुटियों को स्थानीय रूप सेविनियमित किया जाता है। माना जाता है कि आरपीई सिग्नल रिले के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो रेटिना को जोड़ता है, विकास मॉड्यूलेटरी संकेतों का अनुमानित स्रोत, कोरॉयड और स्क्लेरा, रिले किए गए संकेतों के दो लक्ष्य 6,7,8।
अक्षीय लंबाई में वृद्धि जो अधिकांश मायोपिया की विशेषता है, को सौम्य नहीं माना जा सकता है, जिसमें रेटिना, कोरॉइड और / या स्क्लेरा से जुड़े पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तन अत्यधिक ओकुलर बढ़ाव 7,9 के अपरिहार्य और अब अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त परिणामों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस संदर्भ में, आरपीई शायद सबसे कमजोर है, क्योंकि, एक नॉनमाइटोटिक ऊतक होने के नाते, यह केवल व्यक्तिगत कोशिकाओं के खिंचाव और पतलेपन द्वारा विस्तारित विट्रियस कक्ष को समायोजित करने में सक्षम है। जबकि मायोपिया से संबंधित विकृति में इसकी भूमिका, जैसे कि मायोपिक मैकुलर अपघटन, अभी तक पूरी तरह से समझा नहीं गया है, आरपीई को भौगोलिक शोष सहित कई अन्य रेटिना रोगों के रोगजनन में फंसाया गया है, जो अंधापन के प्रमुख कारणों में से एक है, जो रेटिना, आरपीई और कोरॉयड10,11 में प्रलेखित असामान्यताओं से जुड़ा हुआ है। 12.
आसन्न ओकुलर ऊतकों से संदूषण से मुक्त आरपीई कोशिकाओं का सफल अलगाव, संभावित रूप से विभिन्न प्रकार के आंखों / रेटिना रोगों के अंतर्निहित तंत्र में नई अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए कई शोध अवसर खोलता है। हालांकि, आरपीई का अलगाव चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है, कई प्रकाशित अध्ययनों में इस कारण से संयुक्त रेटिना / आरपीई या आरपीई / कोरॉयड नमूनों का उपयोग किया गया है। आणविक जीव विज्ञान अध्ययन के लिए उपयुक्त गुणवत्ता के आरपीई के सफल अलगाव से जुड़े अध्ययन चूजे और माउस आंखों16,17 तक सीमित हैं। उदाहरण के लिए, वांग एट अल.18 द्वारा वर्णित एक साथ आरपीई अलगाव और आरएनए स्थिरीकरण (एसआरआईआरएस) विधि। चूहों में आरपीई कोशिकाओं को अलग करने के लिए गिनी पिग आंखों में अच्छी तरह से काम नहीं करता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक दृष्टिकोण के शोधन का प्रतिनिधित्व करता है जिसे शुरू में लेखकों (एमएफ) में से एक द्वारा पेड़ की आंखों के साथ प्रोटोटाइप किया गया था और युवा पिगमेंटेड गिनीसूअरों की आंखों से आरएनए और अन्य आणविक जीव विज्ञान विश्लेषण के लिए उपयुक्त उच्च गुणवत्ता वाले आरपीई नमूने प्राप्त करने के लिए साबित हुआ है।
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Protocol
इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले सभी पशु देखभाल और उपचार नेत्र और दृष्टि अनुसंधान में जानवरों के उपयोग के लिए एआरवीओ स्टेटमेंट के अनुरूप थे। प्रायोगिक प्रोटोकॉल कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, बर्कले की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
1. गिनी पिग आंख का न्यूक्लियेशन
- एनेस्थीसिया (ऑक्सीजन में 5% आइसोफ्लुरेन) के तहत दिए गए सोडियम पेंटोबार्बिटल के इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के साथ गिनी पिग को यूथेनाइज़ करें।
- आंखों को बल और कैंची की सहायता से एन्यूक्लिएट करें, और तुरंत उन्हें धोने के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। आंखों को ताजा पीबीएस समाधान में स्थानांतरित करें।
नोट: प्रति कुएं 4 एमएल समाधान युक्त एक 6-वेल प्लेट की सिफारिश की जाती है।
2. ओकुलर पश्चवर्ती आंख कप और आरपीई / कोरॉइड / स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स का अलगाव
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की सहायता से, स्क्लेरा में प्रारंभिक छोटा चीरा बनाने के लिए 18 जी सुई का उपयोग करें, लिम्बल सीमा से लगभग 1.0 मिमी पीछे (यानी, कॉर्निया और श्वेतपटल के बीच) (चित्रा 1 ए); फिर कॉर्निया, आईरिस, सिलियरी बॉडी और क्रिस्टलीय लेंस सहित पूर्ववर्ती खंड को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें।
- इसके बाद, शेष पश्चवर्ती ओकुलर सेगमेंट आई कप के साथ काम करते हुए, रेटिना को आरपीई / कोरॉयड / स्क्लेरा कॉम्प्लेक्स से अलग करें; पहले पकड़ने के लिए बल का उपयोग करें और फिर धीरे से ज़िन के ज़ोनुल पर खींचें और फिर विखंडन के बिना रेटिना को धीरे-धीरे छील दें (चित्रा 1 बी)।
नोट: रेटिना विखंडन और अपूर्ण रेटिना ऊतक अलगाव से बचने के लिए रेटिना को सीधे नहीं समझा जाना चाहिए। इस विच्छेदन चरण के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग आवश्यक है।
3. कोरॉयड से आरपीई का अलगाव
- रेटिना को पूरी तरह से हटा दिए जाने के बाद, शेष पश्चवर्ती आंख कप को डुबोएं, जिसमें आरपीई, कोरॉयड और स्क्लेरा शामिल हैं, 5 मिनट के लिए ऊतक भंडारण अभिकर्मक में ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: पहचाने गए कुओं के साथ 12-वेल प्लेट का उपयोग करें, प्रत्येक ऊतक भंडारण अभिकर्मक के 2 एमएल से भरा हुआ है। - आंख के कप को 10 सेकंड के लिए 4 एमएल पीबीएस से भरे दूसरे कुएं में स्थानांतरित करें और फिर इसे 2 एमएल पीबीएस से भरे तीसरे कुएं में ले जाएं।
- अंतिम आरपीई अलगाव चरण के लिए पीबीएस से भरे 1 एमएल सिरिंज में 30 जी सुई संलग्न करें। पीबीएस की जेट स्ट्रीम बनाने के लिए सिरिंज पर धीरे से धक्का दें; सबसे पहले, आरपीई में इस धारा को एक छोटा आंसू या छेद बनाने के लिए लक्षित करें, और फिर पीबीएस की धारा को कोरॉयड से शीट के रूप में आरपीई को अलग करने के लिए बनाए गए उद्घाटन में निर्देशित करें (चित्रा 1 सी)।
नोट: शीट के रूप में आरपीई की टुकड़ी सबसे बड़ा आरपीई नमूना देती है। फिर, इस कदम के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग आवश्यक है। - कोरॉयड (चित्रा 1 डी) से आरपीई को अलग करने के बाद, आरपीई ऊतक को सुई रहित 1 एमएल सिरिंज में इकट्ठा करें, और फिर एकत्र किए गए नमूने को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- आरपीई गोली प्राप्त करने के लिए 1 मिनट के लिए 8,000 × ग्राम पर एकत्रित आरपीई के साथ 1.5 एमएल ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें (चित्रा 2 ए)।
- पीबीएस समाधान को त्याग दें, और इसे 350 एमएल लाइसिस बफर के साथ बदलें, जैसा कि आरएनए आइसोलेशन किट में शामिल है ( सामग्री की तालिका देखें); मिश्रण करने के लिए पिपेट 20 गुना और इस प्रकार, नमूने की गुणवत्ता को संरक्षित करें। दीर्घकालिक भंडारण और संरक्षण के लिए, नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्थानांतरित करें।
नोट: लाइसिस बफर आरएनए अलगाव और एक साथ आरएनए / डीएनए / प्रोटीन अलगाव से पहले सेल और ऊतक लाइसिस के लिए आरएनए अलगाव किट का एक मालिकाना घटक है। लाइसेट में आरएनएस को निष्क्रिय करने के लिए, लाइसिस बफर में β-मर्काप्टोएथेनॉल जोड़ना सुनिश्चित करें (लाइसिस बफर के प्रति 1 एमएल β-मर्काप्टोएथेनॉल का 10 μL)।
4. आरपीई-आरएनए निष्कर्षण
- निर्माता के दिए गए निर्देशों के बाद आरपीई नमूनों से आरएनए को अलग करने और एकत्र करने के लिए एक आरएनए अलगाव किट का उपयोग करें (सामग्री की तालिका देखें)। वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से नमूने की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें।
नोट: वर्णित प्रोटोकॉल ने एक अच्छी गुणवत्ता वाले उत्पाद (यानी, आरएनए अखंडता संख्या [आरआईएन] 8.0 से अधिक) प्राप्त किया।
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Representative Results
उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकत्र किए गए आरपीई नमूनों के विश्लेषण ने अच्छी तरह से संरक्षित आरएनए (आरआईएन >8.0, चित्रा 2 बी) दिखाया, जिसमें 240.2 एनजी ± 35.1 एनजी प्रति आंख (एन = 8, नैनोड्रॉप, चित्रा 2 बी) था। पृथक आरपीई नमूनों की गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए, विशेष रूप से कोरॉयडल और स्क्लेरल दूषित पदार्थों की अनुपस्थिति, हमने आरपीई नमूने19 में बाद के प्रत्येक ऊतक के लिए प्रतिनिधि जीन की अभिव्यक्ति की जांच की। आरपीई नमूनों ने कोरॉयड और स्क्लेरा (तालिका 1 और चित्रा 2 सी) में आरपीई 65 अभिव्यक्ति स्तरों की तुलना में आरपीई 65 (एक आरपीई-विशिष्ट जीन) की काफी अधिक अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया। इसके विपरीत, आरपीई नमूनों ने कोल 1 ए 1, चयनित कोरॉयड-स्क्लेरा-विशिष्ट जीन (चित्रा 2 डी) की न्यूनतम अभिव्यक्ति दिखाई।
चित्र 1: आरपीई शीट एकत्र करने की प्रक्रिया। (ए) पहले चीरे के साथ 2 सप्ताह की गिनी पिग आंख। (बी) पूर्ववर्ती खंड (कॉर्निया, आईरिस और लेंस), विट्रियस, और रेटिना को तब पीछे की आंख कप (आरपीई, कोरॉइड और स्क्लेरा) से अलग किया जाता है। (सी) पीबीएस की एक जेट स्ट्रीम, जिसे 30 जी सुई के माध्यम से वितरित किया जाता है, का उपयोग कोरॉयड से शीट (काले तीर) के रूप में आरपीई (डी) को अलग करने के लिए किया जाता है। पहले चीरा से आरपीई संग्रह तक की प्रक्रिया में 5-7 मिनट लगते हैं। संक्षिप्त नाम: आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: पृथक आरपीई नमूनों की गुणवत्ता का आकलन करने की प्रक्रिया। (ए) नीचे काटे जाने के बाद 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में आरपीई नमूने की प्रतिनिधि छवि। (बी) एकत्र किए गए आरपीई नमूनों से निकाले गए आरएनए के लिए प्रतिनिधि बायोएनालाइजर आउटपुट। (C, D) आरपीई 65, एक आरपीई-विशिष्ट जीन, और कोल 1 ए 1 के जीन अभिव्यक्ति स्तर, जो आरपीई में व्यक्त नहीं किए जाते हैं या न्यूनतम रूप से व्यक्त किए जाते हैं, जिसे आरपीई, कोरॉइड और एन = 3 अनुपचारित जानवरों से स्क्लेरल नमूनों में आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा मापा जाता है; दोनों डेटा सेटों को β-एक्टिन के लिए सामान्यीकृत किया गया था। ** पी < 0.01; पी < 0.001. इस आंकड़े को गोटो एट अल.19 से संशोधित किया गया है। संक्षेप: आरपीई = रेटिना वर्णक उपकला; β-एक्टिन = बीटा-एक्टिन; Col1a1 = कोलेजन टाइप-I अल्फा -1 श्रृंखला; आरपीई 65 = रेटिनोइड आइसोमेरोहाइड्रोलेज; आरटी-क्यूपीसीआर = रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| जीन | फॉरवर्ड प्राइमर (5' से 3') | रिवर्स प्राइमर (5' से 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCCC | ||||
| Rpe65 | GCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-एक्टिन | GGCCGAGCGGGAATT | CCAGGGCACATAGCATAGCT | ||||
तालिका 1: नमूना गुणवत्ता विश्लेषण में पीसीआर प्रवर्धन के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमरों के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम। संक्षिप्तरूप: β-एक्टिन = बीटा-एक्टिन; Col1a1 = कोलेजन प्रकार I अल्फा 1 श्रृंखला; आरपीई 65 = रेटिनोइड आइसोमेरोहाइड्रोलेज।
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Discussion
इस लेख में, हम युवा, रंजित गिनी सूअरों की आंखों से आरपीई जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए उपयुक्त आरपीई को अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल की खूबियां यह हैं कि यह उच्च गुणवत्ता वाले आरपीई नमूने उत्पन्न करता है जो संदूषण से अपेक्षाकृत मुक्त होते हैं, आरएनए-विशिष्ट विश्लेषण के लिए उपयुक्त रूप से संरक्षित होते हैं और फिर भी, अपेक्षाकृत सरल और कुशल होते हैं। जबकि यहां दिए गए उदाहरण में, आरपीई नमूने एक युवा (2 सप्ताह के) गिनी पिग की आंखों से एकत्र किए गए थे, प्रोटोकॉल का उपयोग पुराने (युवा वयस्क) जानवरों से आरपीई नमूने एकत्र करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गया है।
ओकुलर सर्जरी या विच्छेदन के साथ न्यूनतम पूर्व अनुभव वाले शोधकर्ताओं के लिए, प्रोटोकॉल चरण 2.1 और चरण 2.2 चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। चरण 2.1 में महत्वपूर्ण विवरण श्वेतपटल में प्रारंभिक चीरा का स्थान है, जिसे लिम्बस के पीछे 1.0 मिमी सटीक रूप से रखा जाना चाहिए ताकि पूर्ववर्ती खंड को अलग करते समय आईरिस और लेंस को कॉर्निया के साथ हटा दिया जाए। यदि, इसके बजाय, आईरिस पश्चवर्ती ओकुलर सेगमेंट से जुड़ा रहता है, तो ज़िन के ज़ोनुल को ढूंढना चुनौतीपूर्ण है, जो अगले चरण में रेटिना को सफलतापूर्वक अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है। जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया गया है, रेटिना के सफल अलगाव के लिए, यह भी महत्वपूर्ण है कि रेटिना को इसके विखंडन से बचने के लिए सीधे बल के साथ नहीं समझा जाए। गिनी पिग रेटिना माउस रेटिना की तुलना में अधिक नाजुक दिखाई देता है, संभवतः इसकी संवहनी प्रकृति20 के कारण। आदर्श रूप से, पृथक पश्चवर्ती आंख कप, जिसमें आरपीई, कोरॉयड और स्क्लेरा शामिल हैं, को एकत्र किए गए आरपीई नमूने में आरएनए के पर्याप्त संरक्षण को सुनिश्चित करने के लिए आंखों के न्यूक्लियेशन के 5 मिनट के भीतर ऊतक भंडारण अभिकर्मक में डुबोया जाना चाहिए।
एसआरआईआरएस विधि, जिसे चूहों की आंखों से आरपीई के उच्च गुणवत्ता वाले नमूने एकत्र करने के विशिष्ट उद्देश्य के लिए विकसित किया गया था, माउस आंखों के लिए उस लक्ष्य को प्राप्त करता प्रतीत होता है; यह कुशल और प्रभावी दोनों बतायागया है। इस तकनीक का उपयोग स्वस्थ मानव दाता आंखों से आरपीई एकत्र करने के लिए भी सफलतापूर्वक किया गयाहै। हालांकि, लेखकों के अनुभव के आधार पर, यह एसआरआईआरएस विधि गिनी पिग, ट्री श्रेव और ओपोसम की आंखों से आरपीई एकत्र करने के लिए उपयुक्त नहीं है, हालांकि इसके अंतर्निहित कारण स्पष्ट नहीं हैं। युवा गिनी सूअरों की आंखों से आरपीई को अलग करने और इकट्ठा करने के लिए यहां वर्णित तकनीक की रिपोर्ट करके, हम मायोपिया अनुसंधान क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अपूर्ण आवश्यकता को संबोधित करने की उम्मीद करते हैं।
वर्णित प्रोटोकॉल की सीमाओं के संदर्भ में, मुख्य एक नमूने के कुशल संग्रह को सुनिश्चित करने के लिए हाथों पर प्रशिक्षण की अवधि की आवश्यकता है, क्योंकि एकत्र किए गए आरपीई नमूनों की शुद्धता के अलावा पूरा होने का समय महत्वपूर्ण है। जिन शोधकर्ताओं को ओकुलर माइक्रो-विच्छेदन या सर्जरी का कोई अनुभव नहीं है, उन्हें प्रशिक्षण की सबसे अधिक आवश्यकता होगी। यद्यपि कई आरपीई अलगाव विधियोंको 22,23 रिपोर्ट किया गया है, यहां वर्णित विधि आरएनए स्थिर अभिकर्मक के उपयोग के कारण आरपीई सेल संस्कृतियों या प्रोटीन विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है।
आरपीई को लंबे समय से न केवल रेटिना के स्वास्थ्य और कार्य को बनाए रखने में बल्कि संबंधित बीमारियों में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए मान्यता दी गई है। तथ्य यह है कि आरपीई को अब ओकुलर विकास विनियमन और मायोपिया विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए भी मान्यता प्राप्त है, जिसने अनुसंधान प्रश्नों के दायरे को काफी व्यापक बना दिया है, जिसके लिए गिनी सूअरों की आंखों से उच्च गुणवत्ता वाले आरपीई नमूने एकत्र करने की क्षमता, जैसा कि यहां वर्णित है, या पशु मॉडल के रूप में उपयोग किए जाने वाले अन्य स्तनधारी नई अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकते हैं। इस तरह के अध्ययन मायोपिया की पैथोलॉजिकल जटिलताओं में नई अंतर्दृष्टि भी प्रदान कर सकते हैं, जिसमें मायोपिक मैकुलोपैथी भी शामिल है, जिसके लिए प्रसार के आंकड़ों को मायोपिया प्रसार के आंकड़ों के समानांतर बढ़ने की उम्मीद की जा सकती है।
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Disclosures
लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
यह अध्ययन जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस ओवरसीज रिसर्च फैलोशिप (एसजी), एक लोरिस और डेविड रिच पोस्टडॉक्टरल स्कॉलर (एसजी) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (आर01ईवाई012392) के नेशनल आई इंस्टीट्यूट से अनुदान द्वारा समर्थित है। सी.एफ.डब्ल्यू.)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
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