Summary
Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull'RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.
Abstract
Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate per una potenziale applicazione negli studi di biologia molecolare, comprese le analisi di espressione genica. Nel contesto della regolazione della crescita oculare e della miopia, l'RPE svolge probabilmente un ruolo come relè cellulare per i segnali modulatori della crescita, poiché si trova tra la retina e le due pareti dell'occhio, come la coroide e la sclera. Mentre i protocolli per isolare l'RPE sono stati sviluppati sia per i pulcini che per i topi, questi protocolli hanno dimostrato di non essere direttamente traducibili nella cavia, che è diventata un modello di miopia di mammifero importante e ampiamente utilizzato. In questo studio, sono stati utilizzati strumenti di biologia molecolare per esaminare l'espressione di geni specifici per confermare che i campioni erano privi di contaminazione dai tessuti adiacenti. Il valore di questo protocollo è già stato dimostrato in uno studio RNA-Seq di RPE da giovani cavie pigmentate esposte a defocus ottico che induce miopia. Oltre alla regolazione della crescita oculare, questo protocollo ha altre potenziali applicazioni negli studi sulle malattie della retina, tra cui la maculopatia miopica, una delle principali cause di cecità nei miopi, in cui l'RPE è stato implicato. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice e, una volta perfezionata, produce campioni RPE di alta qualità adatti per studi di biologia molecolare, compresa l'analisi dell'RNA.
Introduction
L'RPE comprende un monostrato unico di cellule pigmentate situate tra la retina neurale e la coroide vascolare e l'RPE ha ruoli ben noti nello sviluppo e nel mantenimento della normale funzione retinica, compresa la fototrasduzione 1,2. Più recentemente, all'RPE è stato assegnato un ulteriore ruolo chiave nella regolazione della crescita oculare3 e, quindi, nello sviluppo della miopia4. Questa assegnazione si basa sulla posizione critica dell'RPE, interposta tra la retina e la coroide e sull'ormai ampia accettazione che la crescita dell'occhio e, quindi, gli errori di rifrazione sono regolati localmente5. Si ritiene che l'RPE svolga un ruolo chiave come relè di segnale, collegando la retina, la presunta fonte di segnali modulatori della crescita, alla coroide e alla sclera, i due bersagli dei segnali trasmessi 6,7,8.
L'aumento della lunghezza assiale che caratterizza la maggior parte della miopia non può essere considerato benigno, con alterazioni fisiopatologiche che coinvolgono la retina, la coroide e/o la sclera che rappresentano conseguenze inevitabili e ormai ben riconosciute di un eccessivo allungamento oculare 7,9. In questo contesto, l'RPE è forse il più vulnerabile, poiché, essendo un tessuto non mitotico, è in grado di ospitare la camera vitreale in espansione solo attraverso lo stiramento e l'assottigliamento delle singole cellule. Mentre il suo ruolo nelle patologie correlate alla miopia, come la degenerazione maculare miopica, deve ancora essere completamente compreso, l'RPE è stato implicato nella patogenesi di una serie di altre malattie della retina, tra cui l'atrofia geografica, una delle principali cause di cecità, che è associata ad anomalie documentate nella retina, RPE e coroide10,11, 12.
Il successo dell'isolamento delle cellule RPE, libere dalla contaminazione dai tessuti oculari adiacenti, apre potenzialmente molte opportunità di ricerca per ottenere nuove informazioni sui meccanismi alla base di una varietà di malattie oculari / retiniche. Tuttavia, l'isolamento dell'RPE si è dimostrato impegnativo, con molti studi pubblicati che utilizzano campioni combinati di retina / RPE o RPE / coroide per questo motivo13,14,15. Gli studi che prevedono l'isolamento riuscito dell'RPE di una qualità adatta agli studi di biologia molecolare sono stati limitati agli occhi di pulcino e topo16,17. Ad esempio, il metodo simultaneo di isolamento RPE e stabilizzazione dell'RNA (SRIRS) descritto da Wang et al.18. Isolare le cellule RPE nei topi non sembra funzionare bene negli occhi delle cavie. Il protocollo qui descritto rappresenta un perfezionamento di un approccio che è stato inizialmente prototipato con occhi di toporagno degli alberi da uno degli autori (M.F.) e ha dimostrato di produrre campioni RPE di alta qualità, appropriati per l'RNA e altre analisi di biologia molecolare, dagli occhi di giovani cavie pigmentate19.
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Protocol
Tutte le cure e i trattamenti degli animali utilizzati in questo studio sono conformi alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. I protocolli sperimentali sono stati approvati dall'Animal Care and Use Committee dell'Università della California, Berkeley.
1. Enucleazione dell'occhio di cavia
- Eutanasia di una cavia con un'iniezione intracardiaca di pentobarbital di sodio somministrato in anestesia (isoflurano al 5% in ossigeno).
- Enucleare gli occhi con l'aiuto di pinze e forbici e trasferirli immediatamente in una capsula di Petri di 10 cm con soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per il lavaggio. Trasferire gli occhi alla soluzione PBS fresca.
NOTA: Si consiglia una piastra a 6 pozzetti contenente 4 ml di soluzione per pozzetto.
2. Isolamento della coppa oculare posteriore dell'occhio e del complesso RPE/coroide/sclera
- Con l'aiuto di un microscopio da dissezione, utilizzare un ago da 18 G per praticare una piccola incisione iniziale nella sclera, circa 1,0 mm dietro il confine limbare (cioè tra la cornea e la sclera) (Figura 1A); Quindi utilizzare le forbici per rimuovere il segmento anteriore, compresa la cornea, l'iride, il corpo ciliare e il cristallino.
- Successivamente, lavorando con la restante coppa oculare del segmento oculare, staccare la retina dal complesso RPE / coroide / sclera; utilizzare una pinza per afferrare prima e poi tirare delicatamente la zonula di Zinn e poi per staccare progressivamente la retina senza frammentazione (Figura 1B).
NOTA: La retina non deve essere afferrata direttamente per evitare la frammentazione retinica e l'isolamento incompleto del tessuto retinico. L'uso di un microscopio è essenziale per questa fase di dissezione.
3. Isolamento dell'RPE dalla coroide
- Dopo che la retina è stata completamente rimossa, immergere la concia oculare posteriore rimanente, che include RPE, coroide e sclera, in un reagente di conservazione dei tessuti per 5 minuti (vedere la tabella dei materiali).
NOTA: Utilizzare una piastra a 12 pozzetti con pozzetti identificati, ciascuno riempito con 2 ml del reagente di stoccaggio dei tessuti. - Trasferire la concia oculare in un altro pozzetto riempito con 4 ml di PBS per 10 s prima di spostarlo in un terzo pozzetto riempito con 2 ml di PBS.
- Collegare un ago da 30 G a una siringa da 1 mL riempita con PBS per la fase finale di isolamento RPE. Spingere delicatamente sulla siringa per creare una corrente a getto di PBS; per prima cosa, punta questo flusso verso l'RPE per fare un piccolo strappo o un buco in esso, quindi dirigere il flusso di PBS nell'apertura creata per staccare l'RPE come un foglio dalla coroide (Figura 1C).
NOTA: il distacco dell'RPE come foglio produce il campione RPE più grande. Ancora una volta, l'uso di un microscopio è essenziale per questo passaggio. - Dopo aver staccato l'RPE dalla coroide (Figura 1D), raccogliere il tessuto RPE in una siringa senza ago da 1 ml, quindi trasferire il campione raccolto in una provetta da 1,5 ml.
- Centrifugare il tubo da 1,5 mL con l'RPE raccolto a 8.000 × g per 1 minuto per ottenere un pellet RPE (Figura 2A).
- Eliminare la soluzione PBS e sostituirla con 350 ml di tampone di lisi, come incluso nei kit di isolamento dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali); pipetta 20x per miscelare e, quindi, preservare la qualità del campione. Per una conservazione e una conservazione a lungo termine, trasferire i campioni in un congelatore a -80 °C.
NOTA: Il tampone di lisi è un componente proprietario del kit di isolamento dell'RNA per la lisi cellulare e tissutale prima dell'isolamento dell'RNA e dell'isolamento simultaneo di RNA/DNA/proteine. Per inattivare le RNA nel lisato, assicurarsi di aggiungere β-mercaptoetanolo al tampone di lisi (10 μL di β-mercaptoetanolo per 1 mL di tampone di lisi).
4. Estrazione RPE-RNA
- Utilizzare un kit di isolamento dell'RNA (vedere la Tabella dei materiali) per isolare e raccogliere l'RNA dai campioni RPE seguendo le istruzioni fornite dal produttore. Valutare la qualità del campione tramite elettroforesi.
NOTA: Il protocollo descritto ha prodotto un prodotto di buona qualità (cioè il numero di integrità dell'RNA [RIN] superiore a 8,0).
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Representative Results
L'analisi dei campioni RPE raccolti utilizzando il protocollo di cui sopra ha mostrato RNA ben conservato (RIN >8.0, Figura 2B), con 240,2 ng ± 35,1 ng per occhio (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Per valutare ulteriormente la qualità dei campioni RPE isolati, in particolare l'assenza di contaminanti coroideali e sclerali, abbiamo esaminato l'espressione di geni rappresentativi per ciascuno di questi ultimi tessuti nei campioni RPE19. I campioni RPE hanno dimostrato un'espressione significativamente più elevata di Rpe65 (un gene specifico per RPE) rispetto ai livelli di espressione di Rpe65 nella coroide e nella sclera (Tabella 1 e Figura 2C). Al contrario, i campioni RPE hanno mostrato un'espressione minima di Col1a1, il gene specifico della coroide-sclera selezionato (Figura 2D).
Figura 1: Procedura per la raccolta dei fogli RPE . (A) Un occhio di cavia di 2 settimane con la prima incisione. (B) Il segmento anteriore (cornea, iride e lente), il vitreo e la retina vengono quindi separati dalla coppa oculare posteriore (RPE, coroide e sclera). (C) Una corrente a getto di PBS, erogata tramite un ago da 30 G, viene utilizzata per staccare l'RPE (D) come un foglio (frecce nere) dalla coroide. La procedura dalla prima incisione alla raccolta RPE richiede 5-7 minuti. Abbreviazione: RPE = epitelio pigmentato retinico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Procedura per valutare la qualità dei campioni RPE isolati. (A) Immagine rappresentativa di un campione di RPE in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL dopo essere stato fatto girare. (B) Output rappresentativo del bioanalizzatore per l'RNA estratto dai campioni RPE raccolti. (C,D) I livelli di espressione genica di Rpe65, un gene specifico per RPE, e Col1a1, che non è o è minimamente espresso nell'RPE, misurato mediante RT-qPCR nei campioni RPE, coroidei e sclerali di n = 3 animali non trattati; Entrambi i set di dati sono stati normalizzati a β-actina. ** P < 0,01; P < 0,001. Questa cifra è stata modificata da Goto et al.19. Abbreviazioni: RPE = epitelio pigmentato retinico; β-actina = beta-actina; Col1a1 = catena alfa-1 di collagene di tipo I; Rpe65 = retinoide isomeroidrolasi; RT-qPCR = reazione a catena della polimerasi quantitativa a trascrizione inversa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Gene | Primer in avanti (da 5' a 3') | Reverse Primer (da 5' a 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| Rpe65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-actina | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabella 1: Sequenze nucleotidiche dei primer utilizzati per l'amplificazione della PCR nell'analisi della qualità del campione. Abbreviazioni: β-actina = beta-actina; Col1a1 = catena alfa 1 di collagene di tipo I; Rpe65 = retinoide isomeroidrolasi.
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Discussion
In questo articolo, descriviamo un metodo per isolare RPE, appropriato per le analisi di espressione genica RPE, dagli occhi di giovani cavie pigmentate. I meriti di questo protocollo sono che produce campioni RPE di alta qualità che sono relativamente privi di contaminazione, con RNA adeguatamente conservato per analisi specifiche dell'RNA e, tuttavia, è relativamente semplice ed efficiente. Mentre nell'esempio fornito qui, i campioni RPE sono stati raccolti dagli occhi di una cavia giovane (2 settimane), il protocollo è stato utilizzato con successo anche per raccogliere campioni di RPE da animali più anziani (giovani adulti).
Per i ricercatori con una minima esperienza precedente con la chirurgia oculare o la dissezione, la fase 2.1 e la fase 2.2 del protocollo possono essere impegnative. Il dettaglio critico nella fase 2.1 è la posizione dell'incisione iniziale nella sclera, che deve essere posizionata con precisione 1,0 mm dietro il limbus in modo che l'iride e la lente vengano rimosse insieme alla cornea quando si stacca il segmento anteriore. Se, invece, l'iride rimane attaccata al segmento oculare posteriore, è difficile trovare la zonula di Zinn, che è la chiave per staccare con successo la retina nella fase successiva. Come notato nel protocollo, per il successo del distacco della retina, è anche fondamentale che la retina non venga afferrata direttamente con il forcipe per evitare la sua frammentazione. La retina del porcellino d'India appare più fragile della retina del topo, probabilmente a causa della sua natura avascolare20. Idealmente, la coppa oculare posteriore isolata, comprendente l'RPE, la coroide e la sclera, dovrebbe essere immersa nel reagente di stoccaggio tissutale entro 5 minuti dall'enucleazione dell'occhio per garantire l'adeguata conservazione dell'RNA nel campione RPE raccolto.
Il metodo SRIRS, sviluppato allo scopo specifico di raccogliere campioni di RPE di alta qualità dagli occhi dei topi, sembra aver raggiunto questo obiettivo per gli occhi dei topi; Si dice che sia efficiente ed efficace18. Questa tecnica è stata utilizzata con successo anche per raccogliere RPE da occhi sani di donatori umani21. Tuttavia, sulla base dell'esperienza degli autori, questo metodo SRIRS non è adatto per raccogliere RPE dagli occhi della cavia, del toporagno arboricolo e dell'opossum, sebbene le ragioni sottostanti non siano chiare. Riportando la tecnica qui descritta per isolare e raccogliere RPE dagli occhi di giovani cavie, speriamo di affrontare un importante bisogno insoddisfatto nel campo della ricerca sulla miopia.
In termini di limitazioni del protocollo descritto, il principale è la necessità di un periodo di formazione pratica per garantire la raccolta efficiente dei campioni, poiché il tempo di completamento è fondamentale, oltre alla purezza dei campioni RPE raccolti. I ricercatori che non hanno esperienza con la micro-dissezione oculare o la chirurgia avranno più bisogno di formazione. Sebbene siano stati riportati diversi metodi di isolamento RPE22,23, il metodo qui descritto non è adatto per colture cellulari RPE o analisi proteiche a causa dell'uso di un reagente stabilizzante dell'RNA.
L'RPE è stato a lungo riconosciuto per svolgere ruoli critici non solo nel mantenimento della salute e della funzione della retina, ma anche nelle malattie correlate. Il fatto che l'RPE sia ora riconosciuto anche come un ruolo chiave nella regolazione della crescita oculare e nello sviluppo della miopia ha notevolmente ampliato la portata delle domande di ricerca, per le quali la capacità di raccogliere campioni di RPE di alta qualità dagli occhi delle cavie, come descritto qui, o da altri mammiferi utilizzati come modelli animali può essere la chiave per fornire nuove intuizioni. Tali studi possono anche offrire nuove informazioni sulle complicanze patologiche della miopia, compresa la maculopatia miopica, per la quale ci si può aspettare che i dati di prevalenza aumentino in parallelo con i dati di prevalenza della miopia di per sé.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo studio è supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (S.G.), da un Loris and David Rich Postdoctoral Scholar (S.G.) e da una sovvenzione del National Eye Institute del National Institutes of Health (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
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