Summary
我々は、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)細胞の細胞を単離するための簡単で効率的な方法を説明する。この手順により、遺伝子発現解析を含む、単離されたRPEに関するフォローアップ分子生物学的研究が可能になります。
Abstract
このプロトコルは、遺伝子発現分析を含む分子生物学研究への応用の可能性のために、若い色素性モルモットの目から網膜色素上皮(RPE)の細胞を単離することについて説明しています。眼の成長調節と近視の文脈では、RPEは網膜と脈絡膜や強膜などの眼の2つの壁の間に位置するため、成長調節シグナルの細胞リレーとしての役割を果たす可能性があります。RPEを単離するためのプロトコルは、ヒナとマウスの両方について開発されていますが、これらのプロトコルは、重要で広く使用されている哺乳類近視モデルとなっているモルモットに直接翻訳できないことが証明されています。この研究では、分子生物学的ツールを使用して特定の遺伝子の発現を調べ、サンプルに隣接組織からの汚染がないことを確認しました。このプロトコルの価値は、近視誘発性の光学的焦点ぼけにさらされた若い色素性モルモットからのRPEのRNA-Seq研究ですでに実証されています。眼の成長調節以外にも、このプロトコルは、RPEが関与している近視の失明の主な原因の1つである近視性黄斑症を含む網膜疾患の研究に他の潜在的な用途があります。この技術の主な利点は、比較的単純であり、一度完成すると、RNA分析を含む分子生物学研究に適した高品質のRPEサンプルが得られることです。
Introduction
RPEは、神経網膜と血管脈絡膜の間に位置する色素細胞のユニークな単層で構成されており、光伝達を含む正常な網膜機能の発生と維持においてよく認識されている役割を持っています1,2。最近では、RPEは眼の成長調節3、したがって近視4の発症において追加の重要な役割を割り当てられています。この割り当ては、網膜と脈絡膜の間に介在するRPEの重要な位置と、眼の成長、したがって屈折異常が局所的に調節されていることが広く受け入れられていることに基づいています5。RPEは、増殖調節信号の想定源である網膜を、中継信号の2つの標的である脈絡膜および強膜に連結する信号中継として重要な役割を果たすと考えられている6,7,8。
ほとんどの近視を特徴付ける軸長の増加は良性とは見なされず、網膜、脈絡膜、および/または強膜を含む病態生理学的変化は、過度の眼の伸長の避けられない、そして今ではよく認識されている結果を表しています7,9。これに関連して、RPEは、非有糸分裂組織であるため、個々の細胞の伸張および菲薄化によってのみ拡大する硝子体腔を収容することができるので、おそらく最も脆弱である。近視性黄斑変性症などの近視関連の病状におけるその役割はまだ完全には理解されていませんが、RPEは、網膜、RPE、および脈絡膜の文書化された異常に関連する失明の主な原因の1つである地図状萎縮を含む、他の多くの網膜疾患の病因に関与しています10,11、12.
隣接する眼組織からの汚染のないRPE細胞の単離に成功することで、さまざまな眼/網膜疾患の根底にあるメカニズムに関する新しい洞察を得るための多くの研究機会が開かれる可能性があります。しかし、RPEの分離は困難であることが証明されており、多くの発表された研究では、この理由から網膜/RPEまたはRPE/脈絡膜の組み合わせサンプルを利用しています13,14,15。分子生物学的研究に適した品質のRPEの単離の成功を含む研究は、ニワトリおよびマウスの眼に限定されてきた16,17。例えば、RPE単離とRNA安定化の同時進行(SRIRS)法は、Wangら18によって記載される。マウスでRPE細胞を単離することは、モルモットの目ではうまく機能しないようです。ここで説明するプロトコルは、著者の1人(M.F.)によって最初に木のじゃじゃ馬の目でプロトタイプ化されたアプローチの改良を表しており、若い色素性モルモットの目からRNAやその他の分子生物学的分析に適した高品質のRPEサンプルが得られることが証明されています19。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
この研究で使用されたすべての動物の世話と治療は、眼科および視覚研究における動物の使用に関するARVOステートメントに準拠していました。実験プロトコルは、カリフォルニア大学バークレー校の動物管理および使用委員会によって承認されました。
1.モルモットの目の除核
- 麻酔下で送達されたペントバルビタールナトリウム(酸素中の5%イソフルラン)の心臓内注射でモルモットを安楽死させる。
- 鉗子とはさみを使って目を除核し、すぐに滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れた10cmのペトリ皿に移して洗浄します。新鮮なPBS溶液に目を移します。
注:ウェルあたり4 mLの溶液を含む6ウェルプレートをお勧めします。
2.眼後眼カップとRPE/脈絡膜/強膜複合体の分離
- 解剖顕微鏡の助けを借りて、18 Gの針を使用して、辺縁部の境界の約1.0 mm後方(つまり、角膜と強膜の間)にある強膜を最初に小さな切開を行います(図1A)。次に、はさみを使用して、角膜、虹彩、毛様体、水晶体などの前部を取り除きます。
- 次に、残りの後眼セグメントアイカップを使用して、網膜をRPE /脈絡膜/強膜複合体から剥離します。鉗子を使用して、最初にジンの小帯をつかみ、次に穏やかに引っ張ってから、断片化せずに網膜を徐々に剥がします(図1B)。
注:網膜の断片化や不完全な網膜組織の分離を避けるために、網膜を直接把握してはなりません。この解剖ステップには顕微鏡の使用が不可欠です。
3. 脈絡膜からのRPEの分離
- 網膜が完全に除去されたら、RPE、脈絡膜、強膜を含む残りの後眼カップを組織保存試薬に5分間浸します( 材料の表を参照)。
注:識別されたウェルを備えた12ウェルプレートを使用し、それぞれに2mLの組織保存試薬を充填します。 - アイカップを4 mLのPBSで満たされた別のウェルに10秒間移してから、2 mLのPBSで満たされた3番目のウェルに移動します。
- 最後のRPE分離ステップのために、PBSで満たされた1 mLシリンジに30 Gの針を取り付けます。シリンジをそっと押して、PBSのジェットストリームを作成します。まず、このストリームをRPEに向け、小さな裂け目または穴を開けてから、PBSのストリームを作成した開口部に向け、RPEをシートとして脈絡膜から切り離します(図1C)。
注:RPEをシートとして切り離すと、最大のRPEサンプルが得られます。繰り返しになりますが、このステップには顕微鏡の使用が不可欠です。 - RPEを脈絡膜から剥離した後(図1D)、RPE組織を針のない1 mLシリンジに採取し、採取したサンプルを1.5 mLチューブに移します。
- 回収したRPEを入れた1.5 mLチューブを8,000 × g で1分間遠心分離し、RPEペレットを得ました(図2A)。
- PBS溶液を廃棄し、RNA分離キットに含まれている350 mLの溶解バッファーと交換します( 材料の表を参照)。ピペット20倍で混合し、サンプルの品質を維持します。長期保存および保存のために、サンプルを−80°Cの冷凍庫に移します。
注:溶解バッファーは、RNA単離およびRNA/DNA/タンパク質同時単離前の細胞および組織溶解用のRNA分離キットの独自のコンポーネントです。ライセート中のRNAsesを不活性化するには、必ずβ-メルカプトエタノールを溶解バッファーに添加してください(溶解バッファー1 mLあたり10 μLのβ-メルカプトエタノール)。
4. RPE-RNA抽出
- RNA分離キット( 材料表を参照)を使用して、提供されている製造元の指示に従ってRPEサンプルからRNAを分離および収集します。電気泳動 で サンプルの品質を評価します。
注:記載されたプロトコルは、高品質の製品(すなわち、8.0を超えるRNA完全性番号[RIN])を生み出しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
上記のプロトコルを使用して収集されたRPEサンプルの分析では、1眼あたり240.2 ng±35.1 ngのよく保存されたRNA(RIN >8.0、図2B)が示されました(n = 8、NanoDrop、図2B)。 単離されたRPEサンプルの品質、特に脈絡膜および強膜汚染物質の不在をさらに評価するために、RPEサンプル19における後者の組織のそれぞれについての代表遺伝子の発現を調べた。RPEサンプルは、脈絡膜および強膜におけるRpe65発現レベルと比較して、Rpe65(RPE特異的遺伝子)の有意に高い発現を示した(表1および図2C)。対照的に、RPEサンプルは、選択された脈絡膜強膜特異的遺伝子であるCol1a1の最小発現を示した(図2D)。
図1:RPEシートを収集する手順 。 (A)最初の切開を受けた2週齢のモルモットアイ。(B)次に、前部(角膜、虹彩、水晶体)、硝子体、網膜を後眼カップ(RPE、脈絡膜、強膜)から分離します。(C)30 G針 を介して 送達されるPBSのジェットストリームは、脈絡膜からシート(黒い矢印)としてRPE(D)を切り離すために使用されます。最初の切開からRPE収集までの手順は5〜7分かかります。略称:RPE =網膜色素上皮。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単離されたRPEサンプルの品質を評価する手順。 (A)スピンダウン後の1.5mLマイクロ遠心チューブ内のRPEサンプルの代表的な画像。(B)採取したRPEサンプルから抽出したRNAの代表的なバイオアナライザー出力。(C,D)RPE特異的遺伝子であるRpe65、およびRPEで発現していないか最小限に抑えられているCol1a1の遺伝子発現レベルを、n = 3の未処理動物からのRPE、脈絡膜、および強膜サンプルでRT-qPCRによって測定した。両方のデータセットをβ-アクチンに正規化した。** P < 0.01;P < 0.001この図は後藤ら19から修正されたものである。略語:RPE =網膜色素上皮;β-アクチン=ベータアクチン;Col1a1 =コラーゲンI型アルファ-1鎖;Rpe65 =レチノイドイソメロヒドロラーゼ;RT-qPCR = 逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 遺伝子 | フォワードプライマー(5'から3') | リバースプライマー(5フィートから3フィート) | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| Rpe65 | GCCCTTCTGCAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-アクチン | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
表1:サンプル品質分析におけるPCR増幅に用いたプライマーの塩基配列。 略語:β-アクチン=ベータアクチン;Col1a1 =コラーゲンI型アルファ1鎖;Rpe65 =レチノイドイソメロヒドロラーゼ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本稿では、若く色素性モルモットの目からRPE遺伝子発現解析に適したRPEを単離する方法について説明します。このプロトコルのメリットは、比較的汚染のない高品質のRPEサンプルが得られ、RNA特異的分析にRNAが適切に保存され、しかも比較的シンプルで効率的であることです。ここで提供される例では、RPEサンプルは若い(2週齢)モルモットの目から収集されましたが、このプロトコルは、年配の(若い成体)動物からRPEサンプルを収集するためにも成功裏に使用されています。
眼科手術や解剖の経験が最小限の研究者にとって、プロトコルステップ2.1とステップ2.2は困難な場合があります。ステップ2.1の重要な詳細は、強膜の最初の切開の位置であり、前部を剥離するときに虹彩と水晶体が角膜と一緒に除去されるように、辺縁部の1.0 mm後方に正確に配置する必要があります。代わりに、虹彩が後眼部に付着したままである場合、次のステップで網膜を正常に剥離するための鍵となるジンの小帯を見つけることは困難です。プロトコルに記載されているように、網膜の剥離を成功させるためには、網膜を鉗子で直接把持しないことも重要です。モルモットの網膜は、おそらくその無血管性のために、マウスの網膜よりも壊れやすいように見えます20。理想的には、RPE、脈絡膜、強膜を含む単離された後眼カップを、眼の除核から5分以内に組織保存試薬に浸して、収集したRPEサンプル中のRNAを適切に保存する必要があります。
マウスの目からRPEの高品質のサンプルを収集するという特定の目的のために開発されたSRIRS法は、マウスの目でその目標を達成したようです。効率的かつ効果的であると報告されています18。この技術は、健康なヒトドナー眼21からRPEを収集するためにも首尾よく使用されている。しかし、筆者らの経験から、このSRIRS法はモルモット、トガリネズミ、オポッサムの目からRPEを採取するのには適していないが、その根本的な理由は明らかではない。ここで紹介したモルモットの稚魚の目からRPEを分離・採取する技術を報告することで、近視研究分野における重要なアンメットニーズに応えたいと考えています。
説明されているプロトコルの制限に関して、主なものは、収集されたRPEサンプルの純度に加えて、完了までの時間が重要であるため、サンプルの効率的な収集を確実にするための実践的なトレーニングの期間の必要性です。眼の微小解離や手術の経験がない研究者が最もトレーニングを必要とします。いくつかのRPE単離法が報告されているが22,23、ここで説明する方法は、RNA安定化試薬を使用するため、RPE細胞培養またはタンパク質分析には適していない。
RPEは、網膜の健康と機能を維持するだけでなく、関連する疾患においても重要な役割を果たすことが長い間認識されてきました。RPEが眼の成長調節や近視の発達にも重要な役割を果たすことが認識されたことで、研究課題の範囲が大幅に広がり、ここで説明したモルモットの目や動物モデルとして使用される他の哺乳類から高品質のRPEサンプルを収集する能力が、新しい洞察を提供するための鍵となる可能性があります。このような研究はまた、近視性黄斑症を含む近視の病理学的合併症に関する新しい洞察を提供する可能性があり、有病率の数値は近視の有病率 自体と並行して上昇することが期待できます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。
Acknowledgments
本研究は、日本学術振興会海外特別研究員(S.G.)、ロリス&デイビッド・リッチ博士研究員(S.G.)、国立衛生研究所眼科研究所(R01EY012392;C.F.W.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
