Summary
우리는 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포의 세포를 분리하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. 이 절차를 통해 유전자 발현 분석을 포함하여 분리된 RPE에 대한 후속 분자 생물학 연구가 가능합니다.
Abstract
이 프로토콜은 유전자 발현 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 잠재적으로 적용하기 위해 어린 색소 기니피그의 눈에서 망막 색소 상피(RPE) 세포를 분리하는 것을 설명합니다. 눈 성장 조절 및 근시의 맥락에서 RPE는 망막과 맥락막 및 공막과 같은 눈의 두 벽 사이에 위치하기 때문에 성장 조절 신호에 대한 세포 중계자 역할을 할 가능성이 높습니다. RPE를 분리하기 위한 프로토콜은 병아리와 생쥐 모두를 위해 개발되었지만 이러한 프로토콜은 중요하고 널리 사용되는 포유류 근시 모델이 된 기니피그로 직접 번역할 수 없는 것으로 입증되었습니다. 이 연구에서는 분자 생물학 도구를 사용하여 특정 유전자의 발현을 검사하여 샘플에 인접 조직의 오염이 없는지 확인했습니다. 이 프로토콜의 가치는 근시를 유발하는 광학 디포커스에 노출된 어린 색소 기니피그의 RPE에 대한 RNA-Seq 연구에서 이미 입증되었습니다. 눈 성장 조절 외에도 이 프로토콜은 RPE가 연루된 근시 실명의 주요 원인 중 하나인 근시 황반병증을 포함하여 망막 질환 연구에 다른 잠재적인 응용 분야를 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 일단 완성되면 RNA 분석을 포함한 분자 생물학 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다.
Introduction
RPE는 신경 망막과 혈관 맥락막 사이에 위치한 색소 세포의 독특한 단층으로 구성되며, RPE는 광형질도입 1,2을 포함하여 정상적인 망막 기능의 발달 및 유지에 잘 알려진 역할을 합니다. 최근에, RPE는 눈 성장 조절3 및 근시 4의 발달에 추가적인 핵심 역할을 할당받았다. 이 할당은 망막과 맥락막 사이에 개재된 RPE의 중요한 위치와 눈의 성장과 굴절 이상이 국소적으로 조절된다는 현재 널리 받아들여지고 있는 것을 기반으로 합니다5. RPE는 성장 조절 신호의 원천으로 추정되는 망막을 중계 신호의 두 표적인 맥락막과 공막에 연결하는 신호 중계자로서 핵심적인 역할을 하는 것으로 여겨집니다(6,7,8).
대부분의 근시를 특징짓는 축 길이의 증가는 양성으로 간주될 수 없으며, 망막, 맥락막 및/또는 공막과 관련된 병태생리학적 변화는 과도한 안구 신장의 피할 수 없고 현재 잘 알려진 결과를 나타냅니다 7,9. 이러한 맥락에서 RPE는 비유사분열 조직이기 때문에 개별 세포의 스트레칭 및 얇아짐에 의해서만 확장되는 유리체실을 수용할 수 있기 때문에 아마도 가장 취약할 것입니다. 근시성 황반변성과 같은 근시 관련 병리에서의 역할은 아직 완전히 이해되지 않았지만, RPE는 망막, RPE 및 맥락막의 문서화된 이상과 관련된 실명의 주요 원인 중 하나인 지리적 위축을 포함한 여러 다른 망막 질환의 발병기전과 관련이 있습니다10,11, 12.
인접한 안구 조직의 오염이 없는 RPE 세포의 성공적인 분리는 잠재적으로 다양한 눈/망막 질환의 기본 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 많은 연구 기회를 열어줍니다. 그러나 RPE의 분리는 어려운 것으로 입증되었으며, 이러한 이유로 결합된 망막/RPE 또는 RPE/맥락막 샘플을 사용하는 많은 발표된 연구에서 13,14,15. 분자 생물학 연구에 적합한 품질의 RPE의 성공적인 분리와 관련된 연구는 병아리와 생쥐의 눈으로 제한되었다16,17. 예를 들어, Wang et al.18에 의해 기술된 동시 RPE 분리 및 RNA 안정화 (SRIRS) 방법. 생쥐에서 RPE 세포를 분리하는 것은 기니피그 눈에서 잘 작동하지 않는 것으로 보입니다. 여기에 설명된 프로토콜은 저자 중 한 명(M.F.)이 처음에 나무 뒤쥐 눈으로 프로토타입을 만든 접근 방식을 개선한 것으로, 어린 색소 기니피그의 눈에서 RNA 및 기타 분자 생물학 분석에 적합한 고품질 RPE 샘플을 산출하는 것으로 입증되었습니다19.
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Protocol
이 연구에 사용된 모든 동물 관리 및 치료는 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서를 준수했습니다. 실험 프로토콜은 University of California, Berkeley의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 기니피그 눈의 적출술
- 마취하에 전달되는 나트륨 펜토바르비탈의 심장 내 주사로 기니피그를 안락사시킵니다(산소 중 5% 이소플루란).
- 집게와 가위를 사용하여 눈을 적출하고 즉시 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)가 든 10cm 페트리 접시에 옮겨 세척합니다. 눈을 신선한 PBS 용액으로 옮깁니다.
참고: 웰당 6mL의 용액이 들어 있는 4웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.
2. 안구 후방 안구 및 RPE/맥락막/공막 복합체의 분리
- 해부 현미경의 도움으로 18G 바늘을 사용하여 윤부 경계(즉, 각막과 공막 사이) 뒤 약 1.0mm의 공막에 초기 작은 절개를 합니다(그림 1A). 그런 다음 가위를 사용하여 각막, 홍채, 모양체 및 수정체를 포함한 전방 부분을 제거합니다.
- 다음으로, 나머지 후방 안구 분절 안구 컵으로 작업하여 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 분리합니다. 집게를 사용하여 먼저 Zinn의 구역을 잡은 다음 부드럽게 잡아당긴 다음 조각화 없이 망막을 점진적으로 벗겨냅니다(그림 1B).
참고: 망막 단편화 및 불완전한 망막 조직 분리를 피하기 위해 망막을 직접 파악해서는 안 됩니다. 이 해부 단계에는 현미경을 사용하는 것이 필수적입니다.
3. 맥락막에서 RPE 분리
- 망막이 완전히 제거된 후 RPE, 맥락막 및 공막을 포함하는 나머지 후방 안구 컵을 조직 보관 시약에 5분 동안 담그십시오( 재료 표 참조).
참고: 각각 12mL의 조직 저장 시약으로 채워진 식별된 웰이 있는 2웰 플레이트를 사용합니다. - 아이컵을 4mL의 PBS로 채워진 다른 웰로 10초 동안 옮긴 후 2mL의 PBS로 채워진 세 번째 웰로 옮깁니다.
- 최종 RPE 격리 단계를 위해 PBS로 채워진 1mL 주사기에 30G 바늘을 부착합니다. 주사기를 부드럽게 눌러 PBS의 제트 기류를 만듭니다. 먼저 이 스트림을 RPE에 조준하여 작은 찢어짐이나 구멍을 만든 다음 PBS 스트림을 생성된 개구부로 향하게 하여 맥락막에서 시트로 RPE를 분리합니다(그림 1C).
알림: RPE를 시트로 분리하면 가장 큰 RPE 샘플이 생성됩니다. 다시 말하지만, 이 단계에서는 현미경을 사용하는 것이 필수적입니다. - 맥락막에서 RPE를 분리한 후(그림 1D) 바늘이 없는 1mL 주사기에 RPE 조직을 수집한 다음 수집된 샘플을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
- 수집된 RPE를 1.5 mL 튜브와 함께 8,000 × g 에서 1분 동안 원심분리하여 RPE 펠릿을 얻었다(도 2A).
- PBS 용액을 버리고, RNA 분리 키트에 포함된 바와 같이 350 mL의 용해 완충액으로 대체한다 ( 재료 표 참조); 피펫 20x를 사용하여 혼합하여 샘플의 품질을 보존합니다. 장기 보관 및 보존을 위해 샘플을 -80°C 냉동고로 옮깁니다.
참고: 용해 완충액은 RNA 분리 및 동시 RNA/DNA/단백질 분리 전 세포 및 조직 용해를 위한 RNA 분리 키트의 독점 구성 요소입니다. 용해물에서 RNAses를 비활성화하려면 용해 완충액에 β-메르캅토에탄올을 추가해야 합니다(용해 완충액 1mL당 β-메르캅토에탄올 10μL).
4. RPE-RNA 추출
- RNA 분리 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 제공된 제조업체의 지침에 따라 RPE 샘플에서 RNA를 분리하고 수집합니다. 전기영동을 통해 시료의 품질을 평가합니다.
참고: 설명된 프로토콜은 양질의 산물(즉, 8.0 이상의 RNA 무결성 수[RIN])을 생성했습니다.
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Representative Results
위의 프로토콜을 사용하여 수집된 RPE 샘플의 분석은 눈당 240.2ng ± 35.1ng(n = 8, NanoDrop, 그림 2B)으로 잘 보존된 RNA(RIN(RIN)>8.0, 그림 2B)를 보여주었습니다. 분리된 RPE 샘플의 품질, 특히 맥락막 및 공막 오염 물질의 부재를 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 RPE 샘플19에서 후자의 조직 각각에 대한 대표 유전자의 발현을 조사하였다. RPE 샘플은 맥락막 및 공막에서 Rpe65 발현 수준과 비교하여 Rpe65(RPE 특이적 유전자)의 발현이 유의하게 더 높은 것으로 나타났습니다(표 1 및 그림 2C). 대조적으로, RPE 샘플은 선택된 맥락막 공막 특이적 유전자인 Col1a1의 최소 발현을 보여주었습니다(그림 2D).
그림 1: RPE 시트 수집 절차 . (A) 첫 번째 절개를 한 2주 된 기니피그 눈. (B) 전안부(각막, 홍채 및 수정체), 유리체 및 망막은 후방 안구 컵(RPE, 맥락막 및 공막)에서 분리됩니다. (C) 30G 바늘을 통해 전달되는 PBS의 제트 기류를 사용하여 맥락막에서 시트(검은색 화살표)로 RPE(D)를 분리합니다. 첫 번째 절개에서 RPE 수집까지의 절차는 5-7분이 소요됩니다. 약어: RPE = 망막 색소 상피. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 분리된 RPE 샘플의 품질을 평가하는 절차. (A) RPE의 대표 이미지amp회전된 후 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 담겨 있습니다. (B) 수집된 RPE 샘플에서 추출한 RNA에 대한 대표적인 바이오분석기 출력. (씨, 디) RPE에서 발현되지 않거나 최소한으로 발현되는 Rpe65, RPE 특이적 유전자 및 Col1a1의 유전자 발현 수준을, n=3 미처리 동물로부터의 RPE, 맥락막 및 공막 샘플에서 RT-qPCR에 의해 측정하고; 두 데이터 세트 모두 β-액틴으로 정규화되었습니다. ** P < 0.01; P < 0.001입니다. 이 수치는 Goto et al.19에서 수정되었습니다. 약어: RPE = 망막 색소 상피; β-액틴 = 베타-액틴; Col1a1 = 콜라겐 유형 I 알파-1 사슬; Rpe65 = 레티노이드 이소메로하이드롤라제; RT-qPCR = 역전사 정량 중합효소 연쇄 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 유전자 | 포워드 프라이머 (5' to 3') | 리버스 프라이머(5' to 3') | ||||
| 콜1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β액틴 | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
표 1: 시료 품질 분석에서 PCR 증폭에 사용된 프라이머의 염기서열. 약어: β-액틴 = 베타-액틴; Col1a1 = 콜라겐 타입 I 알파 1 사슬; Rpe65 = 레티노이드 이소메로하이드롤라아제.
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Discussion
이 기사에서는 어린 색소 기니피그의 눈에서 RPE 유전자 발현 분석에 적합한 RPE를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 RNA가 RNA 특이적 분석에 적합하게 보존되어 상대적으로 오염이 없는 고품질 RPE 샘플을 생성하면서도 비교적 간단하고 효율적이라는 것입니다. 여기에 제공된 예에서 RPE 샘플은 어린(2주령) 기니피그의 눈에서 수집되었지만 프로토콜은 나이가 많은(젊은 성인) 동물로부터 RPE 샘플을 수집하는 데에도 성공적으로 사용되었습니다.
안과 수술 또는 해부에 대한 사전 경험이 거의 없는 연구자의 경우 프로토콜 2.1단계 및 2.2단계가 어려울 수 있습니다. 2.1 단계의 중요한 세부 사항은 공막의 초기 절개 위치이며, 전방 부분을 분리 할 때 홍채와 수정체가 각막과 함께 제거되도록 윤부 뒤쪽 1.0mm에 정확하게 배치해야합니다. 대신 홍채가 후방 안구 분절에 붙어 있으면 다음 단계에서 망막을 성공적으로 분리하는 데 중요한 Zinn의 구역을 찾기가 어렵습니다. 프로토콜에서 언급했듯이 망막의 성공적인 박리를 위해서는 망막의 단편화를 피하기 위해 집게로 망막을 직접 잡지 않는 것도 중요합니다. 기니피그 망막은 쥐의 망막보다 더 연약한 것으로 보이는데, 이는 무혈성 특성 때문일 가능성이 높다20. 이상적으로, RPE, 맥락막 및 공막으로 구성된 분리된 후방 안구 컵은 수집된 RPE 샘플에서 RNA의 적절한 보존을 보장하기 위해 안구 적출 후 5분 이내에 조직 저장 시약에 담가야 합니다.
생쥐의 눈에서 고품질 RPE 샘플을 수집하는 특정 목적을 위해 개발된 SRIRS 방법은 생쥐의 눈에 대한 목표를 달성한 것으로 보입니다. 효율적이고 효과적인 것으로 보고되었다18. 이 기술은 또한 건강한 인간 기증자의 눈으로부터 RPE를 수집하는데 성공적으로 사용되었다21. 그러나 저자의 경험에 따르면 이 SRIRS 방법은 기니피그, 뒤쥐, 주머니쥐의 눈에서 RPE를 수집하는 데 적합하지 않지만 근본적인 이유는 명확하지 않습니다. 어린 기니피그의 눈에서 RPE를 분리하고 수집하기 위해 여기에 설명된 기술을 보고함으로써 근시 연구 분야에서 충족되지 않은 중요한 요구 사항을 해결하기를 희망합니다.
설명된 프로토콜의 한계 측면에서 가장 중요한 것은 수집된 RPE 샘플의 순도 외에도 완료 시간이 중요하기 때문에 샘플의 효율적인 수집을 보장하기 위한 실습 교육 기간이 필요하다는 것입니다. 안구 미세 해부나 수술에 대한 경험이 없는 연구원은 교육이 가장 필요할 것입니다. 여러 RPE 분리 방법이 보고되었지만22,23, 여기에 설명된 방법은 RNA 안정화 시약의 사용으로 인해 RPE 세포 배양 또는 단백질 분석에 적합하지 않습니다.
RPE는 망막의 건강과 기능을 유지하는 것뿐만 아니라 관련 질병에서도 중요한 역할을 하는 것으로 오랫동안 인식되어 왔습니다. RPE가 이제 안구 성장 조절 및 근시 발달에 핵심적인 역할을 하는 것으로 인식되고 있다는 사실은 연구 질문의 범위를 상당히 넓혔으며, 이에 대해 여기에 설명된 기니피그의 눈이나 동물 모델로 사용되는 다른 포유류의 눈에서 고품질 RPE 샘플을 수집할 수 있는 능력이 새로운 통찰력을 제공하는 열쇠가 될 수 있습니다. 이러한 연구는 또한 근시 유병증 수치가 근시 유병률 수치 자체와 병행하여 상승할 것으로 예상할 수 있는 근시성 황반병증을 포함한 근시의 병리학적 합병증에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 해외 연구 펠로우십(S.G.), Loris and David Rich 박사후 연구원(S.G.) 및 국립 보건원 국립 안과 연구소(R01EY012392; C.F.W.)입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
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