Summary
Vi beskriver en enkel og effektiv metode for å isolere celler i retinalpigmentepitelceller (RPE) fra øynene til unge pigmenterte marsvin. Denne prosedyren muliggjør oppfølgende molekylærbiologiske studier på den isolerte RPE, inkludert genuttrykksanalyser.
Abstract
Denne protokollen beskriver isolering av celler i retinalpigmentepitelet (RPE) fra øynene til unge pigmenterte marsvin for potensiell anvendelse i molekylærbiologiske studier, inkludert genuttrykksanalyser. I sammenheng med øyevekstregulering og nærsynthet spiller RPE sannsynligvis en rolle som et cellulært relé for vekstmodulerende signaler, da det ligger mellom netthinnen og øyets to vegger, som choroid og sclera. Mens protokoller for isolering av RPE er utviklet for både kyllinger og mus, har disse protokollene vist seg å ikke være direkte oversettbare til marsvinet, som har blitt en viktig og mye brukt pattedyrmyopimodell. I denne studien ble molekylærbiologiske verktøy brukt til å undersøke uttrykket av spesifikke gener for å bekrefte at prøvene var fri for forurensning fra tilstøtende vev. Verdien av denne protokollen har allerede blitt demonstrert i en RNA-Seq-studie av RPE fra unge pigmenterte marsvin utsatt for myopi-induserende optisk defokus. Utover øyevekstregulering har denne protokollen andre potensielle anvendelser i studier av retinale sykdommer, inkludert myopisk makulopati, en av de viktigste årsakene til blindhet i myopes, der RPE har vært involvert. Den største fordelen med denne teknikken er at den er relativt enkel og når den er perfeksjonert, gir høykvalitets RPE-prøver egnet for molekylærbiologiske studier, inkludert RNA-analyse.
Introduction
RPE består av et unikt monolag av pigmenterte celler som ligger mellom nevrale retina og vaskulær choroid, og RPE har anerkjente roller i utvikling og vedlikehold av normal retinal funksjon, inkludert fototransduksjon 1,2. Mer nylig har RPE fått en ekstra nøkkelrolle i øyevekstregulering3 og dermed utviklingen av nærsynthet4. Denne oppgaven er basert på RPEs kritiske lokalisering, plassert mellom netthinnen og årehinnen og den nå brede aksepten for at øyevekst og dermed brytningsfeil reguleres lokalt5. RPE antas å spille en nøkkelrolle som et signalrelé, som forbinder netthinnen, den antatte kilden til vekstmodulerende signaler, til choroid og sclera, de to målene for de videresendte signalene 6,7,8.
Økningen i aksial lengde som karakteriserer mest nærsynthet kan ikke betraktes som godartet, med patofysiologiske endringer som involverer retina, choroid og / eller sclera som representerer uunngåelige og nå anerkjente konsekvenser av overdreven okulær forlengelse 7,9. I denne sammenheng er RPE kanskje den mest sårbare, siden det er et ikke-mitotisk vev, er det bare i stand til å imøtekomme det ekspanderende glasskammeret ved strekking og tynning av individuelle celler. Mens dens rolle i nærsynthet-relaterte patologier, som myopisk makuladegenerasjon, ennå ikke er fullt ut forstått, har RPE vært involvert i patogenesen av en rekke andre retinale sykdommer, inkludert geografisk atrofi, en av de viktigste årsakene til blindhet, som er forbundet med dokumenterte abnormiteter i netthinnen, RPE og choroid10,11, 12.
Den vellykkede isoleringen av RPE-celler, fri for forurensning fra tilstøtende okulært vev, åpner potensielt mange forskningsmuligheter for å få ny innsikt i mekanismene som ligger til grunn for en rekke øye / retinale sykdommer. Imidlertid har isolasjonen av RPE vist seg utfordrende, med mange publiserte studier som bruker kombinert retina / RPE eller RPE / choroid-prøver av denne grunn13,14,15. Studier som involverer vellykket isolering av RPE av en kvalitet som er egnet for molekylærbiologiske studier, har vært begrenset til kylling- og museøyne16,17. For eksempel den samtidige RPE-isolasjons- og RNA-stabiliseringsmetoden (SRIRS) beskrevet av Wang et al.18. Å isolere RPE-celler hos mus ser ikke ut til å fungere bra i marsvin øyne. Protokollen beskrevet her representerer en forbedring av en tilnærming som opprinnelig ble prototypet med trespisse øyne av en av forfatterne (M.F.) og har vist seg å gi RPE-prøver av høy kvalitet, egnet for RNA og andre molekylærbiologiske analyser, fra øynene til unge pigmenterte marsvin19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All dyrepleie og behandlinger som ble brukt i denne studien, var i samsvar med ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og synsforskning. De eksperimentelle protokollene ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved University of California, Berkeley.
1. Enukleasjon av marsvinøyet
- Avlive et marsvin med intrakardial injeksjon av natriumpentobarbital levert i narkose (5 % isofluran i oksygen).
- Enucleate øynene ved hjelp av tang og saks, og overfør dem umiddelbart til en 10 cm petriskål med sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) for vask. Overfør øynene til frisk PBS-løsning.
MERK: En 6-brønns plate inneholdende 4 ml oppløsning per brønn anbefales.
2. Isolering av den okulære bakre øyekoppen og RPE / choroid / sclera kompleks
- Ved hjelp av et dissekerende mikroskop, bruk en 18 G nål for å lage et første lite snitt i sclera, ca. 1,0 mm bak limbalgrensen (dvs. mellom hornhinnen og sclera) (figur 1A); Bruk deretter saks for å fjerne det fremre segmentet, inkludert hornhinnen, iris, ciliary kropp og krystallinsk linse.
- Deretter arbeider du med den gjenværende bakre okulære segmentøyekoppen, løsner netthinnen fra RPE / choroid / sclera-komplekset; bruk tang til først å gripe og deretter forsiktig dra i Zinns zonule og deretter gradvis skrelle bort netthinnen uten fragmentering (figur 1B).
MERK: Netthinnen må ikke gripes direkte for å unngå retinal fragmentering og ufullstendig retinal vevsisolering. Bruken av et mikroskop er viktig for dette disseksjonstrinnet.
3. Isolering av RPE fra årehinnen
- Etter at netthinnen er helt fjernet, senk den gjenværende bakre øyekoppen, som inkluderer RPE, choroid og sclera, i vevslagringsreagens i 5 minutter (se materialtabellen).
MERK: Bruk en 12-brønns plate med identifiserte brønner, hver fylt med 2 ml av vevslagringsreagenset. - Overfør øyekoppen til en annen brønn fylt med 4 ml PBS i 10 sekunder før du flytter den til en tredje brønn fylt med 2 ml PBS.
- Fest en 30 G kanyle til en 1 ml sprøyte fylt med PBS for det siste RPE-isolasjonstrinnet. Trykk forsiktig på sprøyten for å skape en jetstrøm av PBS; først må du rette denne strømmen mot RPE for å lage en liten rift eller hull i den, og deretter lede strømmen av PBS inn i den opprettede åpningen for å løsne RPE som et ark fra årehinnen (figur 1C).
MERK: Løsningen av RPE som et ark gir den største RPE-prøven. Igjen er bruk av et mikroskop viktig for dette trinnet. - Etter å ha løsnet RPE fra årehinnen (figur 1D), samle RPE-vevet i en nålefri 1 ml sprøyte, og overfør deretter den oppsamlede prøven til et 1,5 ml rør.
- Sentrifuge 1,5 ml røret med den oppsamlede RPE ved 8,000 × g i 1 min for å oppnå en RPE-pellet (figur 2A).
- Kast PBS-oppløsningen og erstatt den med 350 ml lysisbuffer, som inkludert i RNA-isolasjonssett (se materialtabellen); pipette 20x for å blande og dermed bevare kvaliteten på prøven. For lengre tids oppbevaring og konservering, overfør prøvene til en fryser på −80 °C.
MERK: Lysisbufferen er en proprietær komponent i RNA-isolasjonssettet for celle- og vevslyse før RNA-isolering og samtidig RNA / DNA / proteinisolering. For å inaktivere RNAene i lysatet, må du legge til β-merkaptoetanol til lyseringsbufferen (10 μL β-merkaptoetanol per 1 ml lysisbuffer).
4. RPE-RNA-ekstraksjon
- Bruk et RNA-isolasjonssett (se materialfortegnelsen) for å isolere og samle RNA fra RPE-prøvene i henhold til produsentens instruksjoner. Evaluer kvaliteten på prøven via elektroforese.
MERK: Den beskrevne protokollen ga et produkt av god kvalitet (dvs. RNA-integritetsnummer [RIN] over 8.0).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen av RPE-prøvene samlet inn ved hjelp av protokollen ovenfor viste godt bevart RNA (RIN >8.0, figur 2B), med 240.2 ng ± 35.1 ng per øye (n = 8, NanoDrop, figur 2B). For ytterligere å evaluere kvaliteten på de isolerte RPE-prøvene, spesielt fraværet av koroidale og sklerale forurensninger, undersøkte vi uttrykket av representative gener for hvert av de sistnevnte vevene i RPE-prøvene19. RPE-prøvene viste signifikant høyere ekspresjon av Rpe65 (et RPE-spesifikt gen) sammenlignet med Rpe65-ekspresjonsnivåene i årehinnen og sclera (tabell 1 og figur 2C). I kontrast viste RPE-prøvene minimal ekspresjon av Col1a1, det valgte choroid-sclera-spesifikke genet (figur 2D).
Figur 1: Prosedyre for innsamling av RPE-arkene . (A) Et 2 uker gammelt marsvinøye med det første snittet. (B) Det fremre segmentet (hornhinnen, iris og linsen), glasslegemet og retina skilles deretter fra den bakre øyekoppen (RPE, choroid og sclera). (C) En jetstrøm av PBS, levert via en 30 G nål, brukes til å løsne RPE (D) som et ark (svarte piler) fra årehinnen. Prosedyren fra første snitt til RPE-samlingen tar 5-7 min. Forkortelse: RPE = retinal pigmentepitel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Prosedyre for vurdering av kvaliteten på de isolerte RPE-prøvene. (A) Representativt bilde av en RPE-prøve i et 1,5 ml mikrosentrifugerør etter å ha blitt spunnet ned. (B) Representativ bioanalysatorutgang for RNA ekstrahert fra de innsamlede RPE-prøvene. (C,D) Genuttrykksnivåene av Rpe65, et RPE-spesifikt gen, og Col1a1, som ikke eller minimalt uttrykkes i RPE, målt ved RT-qPCR i RPE-, choroid- og skleralprøver fra n = 3 ubehandlede dyr; Begge datasettene ble normalisert til β-aktin. ** P < 0,01; P < 0,001. Denne figuren er modifisert fra Goto et al.19. Forkortelser: RPE = retinal pigmentepitel; β-aktin = beta-aktin; Col1a1 = kollagen type-I alfa-1 kjede; Rpe65 = retinoid isomerohydrolase; RT-qPCR = revers-transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Gen | Forward Primer (5 'til 3') | Omvendt grunning (5' til 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-aktin | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabell 1: Nukleotidsekvenser av primere brukt til PCR-amplifikasjon i prøvekvalitetsanalysen. Forkortelser: β-actin = Beta-aktin; Col1a1 = kollagen type I alfa 1 kjede; Rpe65 = retinoid isomerohydrolase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen beskriver vi en metode for å isolere RPE, egnet for RPE-genuttrykksanalyser, fra øynene til unge, pigmenterte marsvin. Fordelene ved denne protokollen er at den gir høykvalitets RPE-prøver som er relativt fri for forurensning, med RNA passende bevart for RNA-spesifikke analyser, og likevel er relativt enkel og effektiv. Mens i eksemplet som er gitt her, ble RPE-prøvene samlet fra øynene til en ung (2 uker gammel) marsvin, har protokollen også blitt brukt med hell til å samle RPE-prøver fra eldre (unge voksne) dyr.
For forskere med minimal tidligere erfaring med øyekirurgi eller disseksjon kan protokolltrinn 2.1 og trinn 2.2 være utfordrende. Den kritiske detaljen i trinn 2.1 er plasseringen av det første snittet i sclera, som skal plasseres nøyaktig 1,0 mm bak limbus slik at iris og linse fjernes sammen med hornhinnen når det fremre segmentet løsnes. Hvis iris i stedet forblir festet til det bakre okulære segmentet, er det utfordrende å finne zonule av Zinn, som er nøkkelen til å lykkes med å løsne netthinnen i neste trinn. Som nevnt i protokollen, for vellykket løsrivelse av netthinnen, er det også kritisk at netthinnen ikke gripes direkte med tangen for å unngå fragmentering. Marsvin retina virker mer skjøre enn musens netthinne, sannsynligvis på grunn av sin avaskulære natur20. Ideelt sett bør den isolerte bakre øyekoppen, bestående av RPE, choroid og sclera, nedsenkes i vevslagringsreagens innen 5 minutter etter øyeenukleasjon for å sikre tilstrekkelig bevaring av RNA i den oppsamlede RPE-prøven.
SRIRS-metoden, som ble utviklet for det spesifikke formål å samle høykvalitetsprøver av RPE fra musens øyne, ser ut til å ha oppnådd dette målet for museøyne; Det rapporteres å være både effektivt og effektivt18. Denne teknikken har også blitt brukt til å samle RPE fra friske menneskelige donorøyne21. Basert på forfatternes erfaring er denne SRIRS-metoden imidlertid ikke egnet til å samle RPE fra øynene til marsvin, trespissmus og opossum, selv om de underliggende årsakene til dette ikke er klare. Ved å rapportere teknikken beskrevet her for å isolere og samle RPE fra øynene til unge marsvin, håper vi å løse et viktig udekket behov i myopi-forskningsfeltet.
Når det gjelder begrensningene i protokollen som er beskrevet, er den viktigste behovet for en periode med praktisk opplæring for å sikre effektiv innsamling av prøver, da tiden til ferdigstillelse er nøkkelen, i tillegg til renheten til de innsamlede RPE-prøvene. Forskere som ikke har erfaring med okulær mikrodisseksjon eller kirurgi vil ha størst behov for opplæring. Selv om flere RPE-isolasjonsmetoder har blitt rapportert22,23, er metoden som beskrevet her ikke egnet for RPE-cellekulturer eller proteinanalyser på grunn av bruk av et RNA-stabiliserende reagens.
RPE har lenge vært anerkjent for å spille kritiske roller, ikke bare for å opprettholde helsen og funksjonen til netthinnen, men også i relaterte sykdommer. Det faktum at RPE nå også er anerkjent for å spille en nøkkelrolle i okulær vekstregulering og myopiutvikling, har betydelig utvidet omfanget av forskningsspørsmål, for hvilke evnen til å samle høykvalitets RPE-prøver fra enten øynene til marsvin, som beskrevet her, eller andre pattedyr som brukes som dyremodeller, kan være nøkkelen til å gi ny innsikt. Slike studier kan også gi ny innsikt i patologiske komplikasjoner ved nærsynthet, inkludert myopisk makulopati, der prevalenstallene kan forventes å stige parallelt med prevalenstallene for nærsynthet i seg selv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien støttes av Japan Society for the Promotion of Science Overseas Research Fellowships (SG), en Loris og David Rich postdoktor (SG), og et stipend fra National Eye Institute of National Institutes of Health (R01EY012392; CFW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
