Summary
Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.
Abstract
Este protocolo describe el aislamiento de células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes para su posible aplicación en estudios de biología molecular, incluidos los análisis de expresión génica. En el contexto de la regulación del crecimiento ocular y la miopía, el EPR probablemente desempeña un papel como un relé celular para las señales moduladoras del crecimiento, ya que se encuentra entre la retina y las dos paredes del ojo, como la coroides y la esclerótica. Si bien se han desarrollado protocolos para aislar el EPR tanto para polluelos como para ratones, estos protocolos han demostrado no ser directamente traducibles al conejillo de indias, que se ha convertido en un modelo de miopía de mamíferos importante y ampliamente utilizado. En este estudio, se utilizaron herramientas de biología molecular para examinar la expresión de genes específicos para confirmar que las muestras estaban libres de contaminación de los tejidos adyacentes. El valor de este protocolo ya se ha demostrado en un estudio RNA-Seq de EPR de conejillos de indias pigmentados jóvenes expuestos a un desenfoque óptico inductor de miopía. Más allá de la regulación del crecimiento ocular, este protocolo tiene otras aplicaciones potenciales en estudios de enfermedades de la retina, incluida la maculopatía miópica, una de las principales causas de ceguera en miopes, en la que se ha implicado el EPR. La principal ventaja de esta técnica es que es relativamente simple y una vez perfeccionada, produce muestras de EPR de alta calidad adecuadas para estudios de biología molecular, incluido el análisis de ARN.
Introduction
El EPR comprende una monocapa única de células pigmentadas ubicadas entre la retina neural y la coroides vascular, y el EPR tiene funciones bien reconocidas en el desarrollo y mantenimiento de la función normal de la retina, incluida la fototransducción 1,2. Más recientemente, al EPR se le ha asignado un papel clave adicional en la regulación del crecimiento ocular3 y, por lo tanto, en el desarrollo de la miopía4. Esta asignación se basa en la ubicación crítica del EPR, interpuesta entre la retina y la coroides y la ahora amplia aceptación de que el crecimiento ocular y, por lo tanto, los errores refractivos están regulados localmente5. Se cree que el EPR desempeña un papel clave como relé de señal, vinculando la retina, la fuente asumida de señales moduladoras del crecimiento, con la coroides y la esclerótica, los dos objetivos de las señales transmitidas 6,7,8.
El aumento de la longitud axial que caracteriza a la mayoría de la miopía no puede considerarse benigno, con cambios fisiopatológicos que involucran retina, coroides y/o esclerótica que representan consecuencias inevitables y ahora bien reconocidas del alargamiento ocular excesivo 7,9. En este contexto, el EPR es quizás el más vulnerable, ya que, al ser un tejido no mitótico, solo puede acomodar la cámara vítrea en expansión mediante el estiramiento y adelgazamiento de células individuales. Si bien su papel en las patologías relacionadas con la miopía, como la degeneración macular miópica, aún no se comprende completamente, el EPR se ha implicado en la patogénesis de una serie de otras enfermedades de la retina, incluida la atrofia geográfica, una de las principales causas de ceguera, que se asocia con anomalías documentadas en la retina, el EPR y la coroides10,11, 12.
El aislamiento exitoso de las células del EPR, libres de contaminación de los tejidos oculares adyacentes, abre potencialmente muchas oportunidades de investigación para obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos subyacentes a una variedad de enfermedades oculares / retinianas. Sin embargo, el aislamiento del EPR ha demostrado ser un desafío, con muchos estudios publicados que utilizan muestras combinadas de retina/EPR o EPR/coroides por esta razón13,14,15. Los estudios que implican el aislamiento exitoso del EPR de una calidad adecuada para estudios de biología molecular se han limitado a ojos de pollo y ratón16,17. Por ejemplo, el método simultáneo de aislamiento de EPR y estabilización de ARN (SRIRS) descrito por Wang et al.18. Aislar las células del EPR en ratones no parece funcionar bien en los ojos de conejillo de indias. El protocolo descrito aquí representa un refinamiento de un enfoque que fue inicialmente prototipado con ojos de musaraña de árbol por uno de los autores (M.F.) y ha demostrado producir muestras de EPR de alta calidad, apropiadas para ARN y otros análisis de biología molecular, de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes19.
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Protocol
Todos los cuidados y tratamientos con animales utilizados en este estudio se ajustaron a la Declaración ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Berkeley.
1. Enucleación del ojo de cobaya
- Eutanasia a un conejillo de indias con una inyección intracardíaca de pentobarbital sódico administrada bajo anestesia (isoflurano al 5% en oxígeno).
- Enuclear los ojos con la ayuda de fórceps y tijeras, e inmediatamente transferirlos a una placa de Petri de 10 cm con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) para lavar. Transfiera los ojos a una solución fresca de PBS.
NOTA: Se recomienda una placa de 6 pocillos que contenga 4 ml de solución por pocillo.
2. Aislamiento de la copa ocular posterior y del complejo EPR/coroides/esclerótica
- Con la ayuda de un microscopio de disección, use una aguja de 18 G para hacer una pequeña incisión inicial en la esclerótica, aproximadamente 1.0 mm detrás del límite limbal (es decir, entre la córnea y la esclerótica) (Figura 1A); Luego use tijeras para extirpar el segmento anterior, incluyendo la córnea, el iris, el cuerpo ciliar y el cristalino.
- A continuación, trabajando con la copa ocular del segmento ocular posterior restante, separe la retina del complejo RPE/coroides/esclerótica; usar fórceps para agarrar primero y luego tirar suavemente de la zonula de Zinn y luego pelar progresivamente la retina sin fragmentación (Figura 1B).
NOTA: La retina no debe ser agarrada directamente para evitar la fragmentación de la retina y el aislamiento incompleto del tejido retiniano. El uso de un microscopio es esencial para este paso de disección.
3. Aislamiento del EPR de la coroides
- Después de que la retina se haya extirpado por completo, sumerja la copa ocular posterior restante, que incluye el EPR, la coroides y la esclerótica, en un reactivo de almacenamiento de tejido durante 5 minutos (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Use una placa de 12 pocillos con pocillos identificados, cada uno lleno con 2 ml del reactivo de almacenamiento de tejido. - Transfiera la copa ocular a otro pozo lleno con 4 ml de PBS durante 10 s antes de moverlo a un tercer pocillo lleno con 2 ml de PBS.
- Conecte una aguja de 30 G a una jeringa de 1 ml llena de PBS para el paso final de aislamiento del EPR. Empuje suavemente la jeringa para crear una corriente en chorro de PBS; primero, apunte esta corriente al EPR para hacer un pequeño desgarro o agujero en él, y luego dirija el flujo de PBS hacia la abertura creada para separar el EPR como una hoja de la coroides (Figura 1C).
NOTA: El desprendimiento del EPR como una hoja produce la muestra más grande del EPR. Una vez más, el uso de un microscopio es esencial para este paso. - Después de separar el EPR de la coroides (Figura 1D), recoja el tejido del EPR en una jeringa sin aguja de 1 ml y luego transfiera la muestra recolectada a un tubo de 1,5 ml.
- Centrifugar el tubo de 1,5 ml con el EPR recogido a 8.000 × g durante 1 minuto para obtener un pellet de EPR (Figura 2A).
- Deseche la solución de PBS y reemplácela con 350 ml de tampón de lisis, como se incluye en los kits de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales); pipetear 20x para mezclar y, así, preservar la calidad de la muestra. Para un almacenamiento y conservación a largo plazo, transfiera las muestras a un congelador de -80 °C.
NOTA: El tampón de lisis es un componente patentado del kit de aislamiento de ARN para la lisis celular y tisular antes del aislamiento de ARN y el aislamiento simultáneo de ARN/ADN/proteína. Para inactivar las ARNas en el lisado, asegúrese de agregar β-mercaptoetanol al tampón de lisis (10 μL de β-mercaptoetanol por 1 ml de tampón de lisis).
4. Extracción de RPE-ARN
- Use un kit de aislamiento de ARN (consulte la Tabla de materiales) para aislar y recolectar el ARN de las muestras de EPR siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Evaluar la calidad de la muestra mediante electroforesis.
NOTA: El protocolo descrito produjo un producto de buena calidad (es decir, número de integridad de ARN [RIN] superior a 8.0).
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Representative Results
El análisis de las muestras de EPR recogidas utilizando el protocolo anterior mostró ARN bien conservado (RIN >8,0, Figura 2B), con 240,2 ng ± 35,1 ng por ojo (n = 8, NanoDrop, Figura 2B). Para evaluar aún más la calidad de las muestras aisladas de EPR, particularmente la ausencia de contaminantes coroideos y esclerales, examinamos la expresión de genes representativos para cada uno de estos últimos tejidos en las muestras de EPR19. Las muestras de EPR demostraron una expresión significativamente mayor de Rpe65 (un gen específico de EPR) en comparación con los niveles de expresión de Rpe65 en la coroides y la esclerótica (Tabla 1 y Figura 2C). En contraste, las muestras de EPR mostraron una expresión mínima de Col1a1, el gen específico de la esclerótica coroidea seleccionado (Figura 2D).
Figura 1: Procedimiento para recoger las hojas de EPR . (A) Un ojo de conejillo de indias de 2 semanas de edad con la primera incisión. (B) El segmento anterior (córnea, iris y cristalino), vítreo y retina se separan de la copa ocular posterior (EPR, coroides y esclerótica). (C) Se utiliza una corriente en chorro de PBS, administrada a través de una aguja de 30 G, para separar el RPE (D) como una lámina (flechas negras) de la coroides. El procedimiento desde la primera incisión hasta la recolección de RPE dura de 5 a 7 minutos. Abreviatura: RPE = epitelio pigmentario de la retina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Procedimiento para evaluar la calidad de las muestras aisladas de EPR. (A) Imagen representativa de una muestra de EPR en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml después de ser hilada. (B) Salida representativa del bioanalizador para el ARN extraído de las muestras de EPR recogidas. (C,D) Los niveles de expresión génica de Rpe65, un gen específico del EPR, y Col1a1, que no se expresa o se expresa mínimamente en el EPR, medidos por RT-qPCR en las muestras de EPR, coroides y esclerales de n = 3 animales no tratados; Ambos conjuntos de datos se normalizaron a β-actina. ** P < 0,01; P < 0,001. Esta figura ha sido modificada de Goto et al.19. Abreviaturas: EPR = epitelio pigmentario de la retina; β-actina = beta-actina; Col1a1 = cadena alfa-1 de colágeno tipo I; Rpe65 = isomerohidrolasa retinoide; RT-qPCR = reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Gen | Imprimación directa (5' a 3') | Cebador inverso (5' a 3') | ||||
| Col1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| RPE65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-actina | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tabla 1: Secuencias de nucleótidos de los cebadores utilizados para la amplificación por PCR en el análisis de calidad de la muestra. Abreviaturas: β-actina = beta-actina; Col1a1 = colágeno tipo I cadena alfa 1; Rpe65 = isomerohidrolasa retinoide.
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Discussion
En este artículo, describimos un método para aislar el EPR, apropiado para los análisis de expresión génica del EPR, de los ojos de conejillos de indias jóvenes y pigmentados. Los méritos de este protocolo son que produce muestras de EPR de alta calidad que están relativamente libres de contaminación, con ARN adecuadamente preservado para análisis específicos de ARN y, sin embargo, es relativamente simple y eficiente. Mientras que en el ejemplo proporcionado aquí, las muestras de EPR se recolectaron de los ojos de un conejillo de indias joven (2 semanas de edad), el protocolo también se ha utilizado con éxito para recolectar muestras de EPR de animales mayores (adultos jóvenes).
Para los investigadores con experiencia previa mínima con cirugía ocular o disección, el paso 2.1 y el paso 2.2 del protocolo pueden ser un desafío. El detalle crítico en el paso 2.1 es la ubicación de la incisión inicial en la esclerótica, que debe colocarse con precisión 1.0 mm detrás del limbo para que el iris y el cristalino se retiren junto con la córnea al separar el segmento anterior. Si, en cambio, el iris permanece unido al segmento ocular posterior, es difícil encontrar la zonula de Zinn, que es clave para separar con éxito la retina en el siguiente paso. Como se señala en el protocolo, para el desprendimiento exitoso de la retina, también es fundamental que la retina no se agarre directamente con los fórceps para evitar su fragmentación. La retina del conejillo de indias parece más frágil que la retina del ratón, probablemente debido a su naturaleza avascular20. Idealmente, la copa ocular posterior aislada, que comprende el EPR, la coroides y la esclerótica, debe sumergirse en un reactivo de almacenamiento de tejido dentro de los 5 minutos posteriores a la enucleación ocular para garantizar la preservación adecuada del ARN en la muestra de EPR recolectada.
El método SRIRS, que se desarrolló con el propósito específico de recolectar muestras de alta calidad de EPR de los ojos de ratones, parece haber logrado ese objetivo para los ojos de ratón; Se informa que es eficiente y eficaz18. Esta técnica también se ha utilizado con éxito para recolectar EPR de ojos sanos de donantes humanos21. Sin embargo, según la experiencia de los autores, este método SRIRS no es adecuado para recolectar EPR de los ojos del conejillo de indias, la musaraña arbórea y la zarigüeya, aunque las razones subyacentes de esto no están claras. Al informar sobre la técnica descrita aquí para aislar y recolectar EPR de los ojos de conejillos de indias jóvenes, esperamos abordar una importante necesidad insatisfecha en el campo de la investigación de la miopía.
En cuanto a las limitaciones del protocolo descrito, la principal es la necesidad de un período de capacitación práctica para garantizar la recolección eficiente de muestras, ya que el tiempo de finalización es clave, además de la pureza de las muestras de EPR recolectadas. Los investigadores que no tienen experiencia con microdisección ocular o cirugía serán los que más necesitan capacitación. Aunque se han descrito varios métodos de aislamiento de EPR22,23, el método descrito aquí no es adecuado para cultivos celulares de EPR o análisis de proteínas debido al uso de un reactivo estabilizador de ARN.
El EPR ha sido reconocido durante mucho tiempo por desempeñar un papel crítico no solo en el mantenimiento de la salud y la función de la retina, sino también en enfermedades relacionadas. El hecho de que ahora también se reconozca que el EPR desempeña un papel clave en la regulación del crecimiento ocular y el desarrollo de la miopía ha ampliado considerablemente el alcance de las preguntas de investigación, para las cuales la capacidad de recolectar muestras de EPR de alta calidad de los ojos de conejillos de indias, como se describe aquí, u otros mamíferos utilizados como modelos animales puede ser clave para proporcionar nuevos conocimientos. Tales estudios también pueden ofrecer nuevos conocimientos sobre las complicaciones patológicas de la miopía, incluida la maculopatía miópica, para la cual se puede esperar que las cifras de prevalencia aumenten en paralelo con las cifras de prevalencia de miopía per se.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este estudio cuenta con el apoyo de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia en el Extranjero Research Fellowships (SG), un becario postdoctoral Loris y David Rich (SG), y una subvención del Instituto Nacional del Ojo de los Institutos Nacionales de Salud (R01EY012392; C.F.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
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