Summary
Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.
Abstract
Bu protokol, retinal pigment epiteli (RPE) hücrelerinin, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere moleküler biyoloji çalışmalarında potansiyel uygulama için genç pigmentli kobayların gözlerinden izolasyonunu tanımlar. Göz büyümesinin düzenlenmesi ve miyopi bağlamında, RPE muhtemelen retina ile koroid ve sklera gibi gözün iki duvarı arasında yer aldığı için büyüme modülatör sinyalleri için hücresel bir röle olarak rol oynar. RPE'yi izole etmek için protokoller hem civcivler hem de fareler için geliştirilmiş olsa da, bu protokollerin önemli ve yaygın olarak kullanılan bir memeli miyopi modeli haline gelen kobaya doğrudan çevrilemediği kanıtlanmıştır. Bu çalışmada, örneklerin bitişik dokulardan kontaminasyon içermediğini doğrulamak için spesifik genlerin ekspresyonunu incelemek için moleküler biyoloji araçları kullanılmıştır. Bu protokolün değeri, miyopiye neden olan optik defokusa maruz kalan genç pigmentli kobaylardan RPE'nin RNA-Seq çalışmasında zaten gösterilmiştir. Göz büyümesi düzenlemesinin ötesinde, bu protokolün, RPE'nin dahil olduğu miyoplarda körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan miyop makülopati de dahil olmak üzere retina hastalıklarının çalışmalarında başka potansiyel uygulamaları vardır. Bu tekniğin temel avantajı, nispeten basit olması ve bir kez mükemmelleştirildikten sonra, RNA analizi de dahil olmak üzere moleküler biyoloji çalışmaları için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri vermesidir.
Introduction
RPE, nöral retina ve vasküler koroid arasında yer alan pigmentli hücrelerin benzersiz bir tek katmanından oluşur ve RPE, fototransdüksiyon 1,2 de dahil olmak üzere normal retina fonksiyonunun geliştirilmesinde ve sürdürülmesinde iyi bilinen rollere sahiptir. Daha yakın zamanlarda, RPE'ye göz büyümesi düzenlemesi3'te ve dolayısıyla miyopi4'ün gelişiminde ek bir anahtar rol verilmiştir. Bu atama, RPE'nin retina ve koroid arasına yerleştirilen kritik konumuna ve göz büyümesinin ve dolayısıyla kırma kusurlarının yerel olarak düzenlendiği yönündeki geniş kabule dayanmaktadır5. RPE'nin, büyüme modülatörü sinyallerin varsayılan kaynağı olan retinayı, iletilen sinyallerin iki hedefi olan koroid ve skleraya bağlayan bir sinyal rölesi olarak kilit bir rol oynadığına inanılmaktadır 6,7,8.
Çoğu miyopiyi karakterize eden aksiyel uzunluktaki artış iyi huylu olarak kabul edilemez, retina, koroid ve / veya sklerasa içeren patofizyolojik değişiklikler aşırı oküler uzamanın kaçınılmaz ve şimdi iyi bilinen sonuçlarını temsil eder 7,9. Bu bağlamda, RPE belki de en savunmasız olanıdır, çünkü mitotik olmayan bir doku olarak, genişleyen vitreus odasını ancak bireysel hücrelerin gerilmesi ve inceltilmesiyle barındırabilir. Miyop makula dejenerasyonu gibi miyopi ile ilişkili patolojilerdeki rolü henüz tam olarak anlaşılamamış olsa da, RPE, retina, RPE ve koroid10,11'de belgelenmiş anormalliklerle ilişkili olan körlüğün önde gelen nedenlerinden biri olan coğrafi atrofi de dahil olmak üzere bir dizi başka retina hastalığının patogenezinde rol oynamıştır. 12.
RPE hücrelerinin komşu oküler dokulardan kontaminasyondan arındırılmış başarılı izolasyonu, çeşitli göz / retina hastalıklarının altında yatan mekanizmalar hakkında yeni bilgiler edinmek için potansiyel olarak birçok araştırma fırsatı sunmaktadır. Bununla birlikte, RPE'nin izolasyonunun zor olduğu kanıtlanmıştır, bu nedenle kombine retina / RPE veya RPE / koroid örneklerini kullanan birçok yayınlanmış çalışma ile13,14,15. Moleküler biyoloji çalışmalarına uygun kalitede RPE'nin başarılı bir şekilde izole edilmesini içeren çalışmalar civciv ve fare gözleri ile sınırlı kalmıştır16,17. Örneğin, Wang ve ark.18 tarafından tanımlanan eşzamanlı RPE izolasyonu ve RNA stabilizasyonu (SRIRS) yöntemi. Farelerde RPE hücrelerini izole etmek, kobay gözlerinde iyi çalışmıyor gibi görünmektedir. Burada açıklanan protokol, başlangıçta yazarlardan biri (M.F.) tarafından ağaç sivri gözlerle prototiplenen ve genç pigmentli kobayların gözlerinden RNA ve diğer moleküler biyoloji analizleri için uygun yüksek kaliteli RPE örnekleri verdiği kanıtlanmış bir yaklaşımın iyileştirilmesini temsil etmektedir19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan bakımı ve tedavileri, Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Beyanı'na uygundur. Deneysel protokoller, Berkeley'deki Kaliforniya Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Gine domuzu gözünün enükleasyonu
- Anestezi altında verilen intrakardiyak sodyum pentobarbital enjeksiyonu ile bir gine domuzu ötenazi yapın (oksijende% 5 izofluran).
- Forseps ve makas yardımıyla gözleri enüklee edin ve hemen yıkamak için steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın. Gözleri taze PBS çözeltisine aktarın.
NOT: Kuyu başına 4 mL çözelti içeren 6 delikli bir plaka önerilir.
2. Oküler arka göz kapağı ve RPE/koroid/sklera kompleksinin izolasyonu
- Diseksiyon mikroskobu yardımıyla, sklerada limbal sınırın yaklaşık 1.0 mm gerisinde (yani kornea ve sklera arasında) ilk küçük kesiyi yapmak için 18 G'lik bir iğne kullanın (Şekil 1A); Daha sonra kornea, iris, siliyer gövde ve kristalin lens dahil olmak üzere ön segmenti çıkarmak için makas kullanın.
- Daha sonra, kalan posterior oküler segment göz kepçesi ile çalışarak, retinayı RPE / koroid / sklera kompleksinden ayırın; forseps kullanarak önce Zinn zonulünü kavrar ve sonra nazikçe çeker ve daha sonra retinayı parçalanmadan aşamalı olarak soyar (Şekil 1B).
NOT: Retina parçalanmasını ve eksik retina dokusu izolasyonunu önlemek için retina doğrudan kavranmamalıdır. Bu diseksiyon adımı için mikroskop kullanımı esastır.
3. RPE'nin koroidden izolasyonu
- Retina tamamen çıkarıldıktan sonra, RPE, koroid ve sklerayı içeren kalan arka göz kabını 5 dakika boyunca doku depolama reaktifine daldırın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Her biri 2 mL doku depolama reaktifi ile doldurulmuş, tanımlanmış kuyucuklara sahip 12 delikli bir plaka kullanın. - Vizör kabını 2 mL PBS ile dolu üçüncü bir kuyucuğa taşımadan önce 10 saniye boyunca 4 mL PBS ile dolu başka bir kuyucuğa aktarın.
- Son RPE izolasyon adımı için PBS ile doldurulmuş 1 mL'lik bir şırıngaya 30 G'lik bir iğne takın. PBS'nin jet akışını oluşturmak için şırıngayı yavaşça itin; İlk olarak, içinde küçük bir yırtılma veya delik açmak için bu akışı RPE'ye hedefleyin ve ardından RPE'yi koroidden bir tabaka olarak ayırmak için PBS akışını oluşturulan açıklığa yönlendirin (Şekil 1C).
NOT: RPE'nin bir tabaka olarak ayrılması en büyük RPE örneğini verir. Yine, bu adım için mikroskop kullanımı esastır. - RPE'yi koroidden ayırdıktan sonra (Şekil 1D), RPE dokusunu iğnesiz 1 mL'lik bir şırıngada toplayın ve ardından toplanan numuneyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Bir RPE peleti elde etmek için toplanan RPE ile 1.5 mL tüpü 8.000 × g'da 1 dakika boyunca santrifüj edin (Şekil 2A).
- PBS çözeltisini atın ve RNA izolasyon kitlerine dahil edildiği gibi 350 mL lizis tamponu ile değiştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız); pipet 20x karıştırmak ve böylece numunenin kalitesini korumak. Daha uzun süreli depolama ve muhafaza için, numuneleri -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın.
NOT: Lizis tamponu, RNA izolasyonu ve eşzamanlı RNA / DNA / protein izolasyonundan önce hücre ve doku lizisi için RNA izolasyon kitinin tescilli bir bileşenidir. Lizattaki RNAları inaktive etmek için, lizis tamponuna β-merkaptoetanol eklediğinizden emin olun (1 mL lizis tamponu başına 10 μL β-merkaptoetanol).
4. RPE-RNA ekstraksiyonu
- Üreticinin verdiği talimatları izleyerek RNA'yı RPE örneklerinden izole etmek ve toplamak için bir RNA izolasyon kiti kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Numunenin kalitesini elektroforez yoluyla değerlendirin.
NOT: Açıklanan protokol iyi kalitede bir ürün verdi (yani, 8.0 üzerinde RNA bütünlük numarası [RIN]).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokol kullanılarak toplanan RPE örneklerinin analizi, göz başına 240.2 ng ± 35.1 ng (n = 8, NanoDrop, Şekil 2B) ile iyi korunmuş RNA (RIN >8.0, Şekil 2B) göstermiştir. İzole RPE örneklerinin kalitesini, özellikle koroidal ve skleral kirleticilerin yokluğunu daha fazla değerlendirmek için, RPE örneklerinde19 ikinci dokuların her biri için temsili genlerin ekspresyonunu inceledik. RPE örnekleri, koroid ve skleradaki Rpe65 ekspresyon seviyelerine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bir Rpe65 ekspresyonu (RPE'ye özgü bir gen) göstermiştir (Tablo 1 ve Şekil 2C). Buna karşılık, RPE örnekleri, seçilen koroid-skleraya özgü gen olan Col1a1'in minimal ekspresyonunu gösterdi (Şekil 2D).
Şekil 1: RPE sayfalarını toplama prosedürü . (A) İlk kesi yapılan 2 haftalık bir kobay gözü. (B) Ön segment (kornea, iris ve lens), vitreus ve retina daha sonra arka göz kapağından (RPE, koroid ve sklera) ayrılır. (C) 30 G'lik bir iğne ile verilen PBS'nin bir jet akımı, RPE'yi (D) koroidden bir tabaka (siyah oklar) olarak ayırmak için kullanılır. İlk insizyondan RPE koleksiyonuna kadar olan işlem 5-7 dakika sürer. Kısaltma: RPE = retinal pigment epiteli. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İzole edilmiş RPE numunelerinin kalitesini değerlendirme prosedürü. (A) Bir RPE numunesinin döndürüldükten sonra 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde temsili görüntüsü. (B) Toplanan RPE örneklerinden ekstrakte edilen RNA için temsili biyoanalizör çıktısı. (C,D) RPE'ye özgü bir gen olan Rpe65 ve RPE'de ifade edilmeyen veya minimal olarak eksprese edilen Col1a1'in gen ekspresyon seviyeleri, n = 3 tedavi edilmemiş hayvanlardan RPE, koroid ve skleral örneklerde RT-qPCR ile ölçülür; Her iki veri seti de β-aktin'e normalleştirildi. ** P < 0,01; P < 0.001. Bu rakam Goto ve ark.19'dan değiştirilmiştir. Kısaltmalar: RPE = retinal pigment epiteli; β-aktin = beta-aktin; Col1a1 = kollajen tip-I alfa-1 zinciri; Rpe65 = retinoid izomerohidrolaz; RT-qPCR = ters transkripsiyon kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Gen | İleri Astar (5' ila 3') | Ters Astar (5' ila 3') | ||||
| Kol1a1 | GCCTCAGGCAAGACAGTCATT | GCTAACGGTAAAGCCGAATTCC | ||||
| Rpe65 | GCCCTTCTGCACAAGTTTGAC | CAGTGCGGATGAACCTTCTGT | ||||
| β-aktin | GGCCGAGCGGGAAATT | CCAGGGCAACATAGCATAGCTT | ||||
Tablo 1: Numune kalite analizinde PCR amplifikasyonu için kullanılan primerlerin nükleotid dizileri. Kısaltmalar: β-aktin = Beta-aktin; Col1a1 = kollajen tip I alfa 1 zinciri; Rpe65 = retinoid izomerohidrolaz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede, RPE gen ekspresyon analizleri için uygun olan RPE'yi genç, pigmentli kobayların gözünden izole etmek için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu protokolün esası, RNA'nın RNA'ya özgü analizler için uygun şekilde korunduğu ve yine de nispeten basit ve verimli olduğu için, nispeten kontaminasyondan arındırılmış yüksek kaliteli RPE örnekleri vermesidir. Burada verilen örnekte, RPE örnekleri genç (2 haftalık) bir kobayın gözünden toplanırken, protokol yaşlı (genç yetişkin) hayvanlardan RPE örnekleri toplamak için de başarıyla kullanılmıştır.
Oküler cerrahi veya diseksiyon konusunda önceden minimum deneyime sahip araştırmacılar için, protokol adım 2.1 ve adım 2.2 zor olabilir. Adım 2.1'deki kritik ayrıntı, skleradaki ilk insizyonun yeridir ve bu, ön segmenti ayırırken iris ve lensin kornea ile birlikte çıkarılması için limbusun 1.0 mm arkasına doğru bir şekilde yerleştirilmelidir. Bunun yerine, iris posterior oküler segmente bağlı kalırsa, bir sonraki adımda retinayı başarılı bir şekilde ayırmanın anahtarı olan Zinn zonulünü bulmak zordur. Protokolde belirtildiği gibi, retinanın başarılı bir şekilde ayrılması için, retinanın parçalanmasını önlemek için doğrudan forseps ile kavranmaması da kritik öneme sahiptir. Gine domuzu retinası, muhtemelen avasküler doğası nedeniyle fare retinasından daha kırılgan görünmektedir20. İdeal olarak, RPE, koroid ve skleradan oluşan izole arka göz kabı, toplanan RPE örneğinde RNA'nın yeterli şekilde korunmasını sağlamak için göz enükleasyonundan sonraki 5 dakika içinde doku depolama reaktifine daldırılmalıdır.
Farelerin gözlerinden yüksek kaliteli RPE örnekleri toplamak amacıyla geliştirilen SRIRS yöntemi, fare gözleri için bu hedefe ulaşmış gibi görünmektedir; hem verimli hem de etkili olduğu bildirilmektedir18. Bu teknik aynı zamanda sağlıklı insan donör gözlerinden RPE toplamak için başarıyla kullanılmıştır21. Bununla birlikte, yazarların deneyimlerine dayanarak, bu SRIRS yöntemi, bunun altında yatan nedenler açık olmasa da, kobay, ağaç faresi ve opossum'un gözlerinden RPE toplamak için uygun değildir. RPE'yi genç kobayların gözlerinden izole etmek ve toplamak için burada açıklanan tekniği bildirerek, miyopi araştırma alanında karşılanmamış önemli bir ihtiyacı ele almayı umuyoruz.
Açıklanan protokolün sınırlamaları açısından, asıl olanı, toplanan RPE örneklerinin saflığına ek olarak, tamamlanma süresi anahtar olduğundan, numunelerin verimli bir şekilde toplanmasını sağlamak için bir uygulamalı eğitim süresine duyulan ihtiyaçtır. Oküler mikrodiseksiyon veya cerrahi ile ilgili deneyimi olmayan araştırmacılar en çok eğitime ihtiyaç duyacaktır. Birkaç RPE izolasyon yöntemi22,23 bildirilmiş olmasına rağmen, burada tarif edilen yöntem, bir RNA stabilize edici reaktifin kullanılması nedeniyle RPE hücre kültürleri veya protein analizleri için uygun değildir.
RPE'nin sadece retinanın sağlığını ve işlevini korumada değil, aynı zamanda ilgili hastalıklarda da kritik rol oynadığı uzun zamandır kabul edilmektedir. RPE'nin artık oküler büyüme düzenlemesinde ve miyopi gelişiminde de önemli bir rol oynadığının kabul edilmesi, burada açıklandığı gibi kobayların gözünden veya hayvan modelleri olarak kullanılan diğer memelilerden yüksek kaliteli RPE örnekleri toplama yeteneğinin yeni anlayışlar sağlamanın anahtarı olabileceği araştırma sorularının kapsamını önemli ölçüde genişletmiştir. Bu tür çalışmalar ayrıca, miyop makülopati de dahil olmak üzere miyopinin patolojik komplikasyonları hakkında yeni bilgiler sunabilir; bunun için prevalans rakamlarının kendi başına miyopi prevalansı rakamlarıyla paralel olarak artması beklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Japonya Bilimin Desteklenmesi Derneği Denizaşırı Araştırma Bursu (SG), Loris ve David Rich Doktora Sonrası Bursu (SG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü'nden (R01EY012392; C.F.W.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Syringe with Slip Tip | Bd Vacutainer Labware Medical | 22-253-260 | |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| 6 Well Tissue Culture Plate with Lid, Flat Bottom, Sterile | pectrum Chemical Mfg. Corp | 970-95008 | |
| 12 Well Tissue Culture Plate with Lid, Individual, Sterile | Thomas Scientific LLC | 1198D72 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | automated electrophoresis to check RNA quality | ||
| Balanced Salt Solutions | Gibco | 10010031 | |
| Bonn Micro Forceps, Straight Smooth, 0.3 mm Tip, 7 cm | Fine Science Tools, Inc. | 11083-07 | |
| Dumont forceps no. 5 | ROBOZ | RS-5045 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26419 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26437 | |
| MiniSpin Microcentrifuges | Eppendorf | 540108 | Max. Speed: 8,000 g |
| RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | tissue storage reagent |
| RNeasy Mini kits | Qiagen | 74104 | RNA isolation kit |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools, Inc. | 91500-09 |
References
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Amram, B., Cohen-Tayar, Y., David, A., Ashery-Padan, R. The retinal pigmented epithelium - from basic developmental biology research to translational approaches. The International Journal of Developmental Biology. 61 (3-4-5), 225-234 (2017).
- Goto, S., et al. Neural retina-specific Aldh1a1 controls dorsal choroidal vascular development via Sox9 expression in retinal pigment epithelial cells. Elife. 7, 32358 (2018).
- Rymer, J., Wildsoet, C. F. The role of the retinal pigment epithelium in eye growth regulation and myopia: A review. Visual Neuroscience. 22 (3), 251-261 (2005).
- Wallman, J., et al. Moving the retina: Choroidal modulation of refractive state. Vision Research. 35 (1), 37-50 (1995).
- Wu, H., et al. Scleral hypoxia is a target for myopia control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (30), 7091-7100 (2018).
- Troilo, D., et al. Imi - Report on experimental models of emmetropization and myopia. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (3), 31-88 (2019).
- Jiang, X., et al. Violet light suppresses lens-induced myopia via neuropsin (OPN5) in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), e2018840118 (2021).
- Zhang, Y., Wildsoet, C. F. RPE and choroid mechanisms underlying ocular growth and myopia. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 221-240 (2015).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- McLeod, D. S., et al. Relationship between RPE and choriocapillaris in age-related macular degeneration. Investigative Opthalmology and Visual Science. 50 (10), 4982 (2009).
- Bhutto, I., Lutty, G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. Molecular Aspects of Medicine. 33 (4), 295-317 (2012).
- Shelton, L., et al. Microarray analysis of choroid/RPE gene expression in marmoset eyes undergoing changes in ocular growth and refraction. Molecular Vision. 14, 1465-1479 (2008).
- Wang, S., Liu, S., Mao, J., Wen, D. Effect of retinoic acid on the tight junctions of the retinal pigment epithelium-choroid complex of guinea pigs with lens-induced myopia in vivo. International Journal of Molecular Medicine. 33 (4), 825-832 (2014).
- He, L., Frost, M. R., Siegwart, J. T., Norton, T. T. Altered gene expression in tree shrew retina and retinal pigment epithelium produced by short periods of minus-lens wear. Experimental Eye Research. 168 (3), 77-88 (2018).
- Nickla, D. L., Wallman, J.
- Zhang, Y., Liu, Y., Wildsoet, C. F. Bidirectional, optical sign-dependent regulation of BMP2 gene expression in chick retinal pigment epithelium. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (10), 6072-6080 (2012).
- Xin-Zhao Wang, C., Zhang, K., Aredo, B., Lu, H., Ufret-Vincenty, R. L. Novel method for the rapid isolation of RPE cells specifically for RNA extraction and analysis. Experimental Eye Research. 102 (1), 1-9 (2012).
- Goto, S., et al. Gene expression signatures of contact lens-induced myopia in guinea pig retinal pigment epithelium. Investigative Opthalmology and Visual Science. 63 (9), 25 (2022).
- De Schaepdrijver, L., Simoens, P., Lauwers, H., De Geest, J. P. Retinal vascular patterns in domestic animals. Research in Veterinary Science. 47 (1), 34-42 (1989).
- Araki, H., et al. Base-resolution methylome of retinal pigment epithelial cells used in the first trial of human induced pluripotent stem cell-based autologous transplantation. Stem Cell Reports. 13 (4), 761-774 (2019).
- Sonoda, S., et al. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nature Protocols. 4 (5), 662-673 (2009).
- Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells. Nature Protocols. 11 (7), 1206-1218 (2016).
