Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं का जीन संपादन

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64858
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,5, 1, 1,6, 1, 2, 1,4
1Laboratory of Molecular Immunology, The Rockefeller University, 2Laboratory of Molecular Microbiology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Laboratory of Retrovirology, The Rockefeller University, 4Howard Hughes Medical Institute, The Rockefeller University, 5Laboratory of Applied Virology and Precision Medicine, King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 6Vaccine and Immunotherapy Center, Wistar Institute

Summary

हम बी सेल थेरेपी के अध्ययन के लिए सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 और पुनः संयोजक एडेनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 6 का उपयोग करके प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं के संवर्धन और जीन संपादन के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

बी कोशिकाएं और उनकी संतान अत्यधिक व्यक्त एंटीबॉडी के स्रोत हैं। उनकी उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति क्षमताओं के साथ-साथ उनकी प्रचुरता, परिधीय रक्त के माध्यम से आसान पहुंच, और सरल दत्तक स्थानान्तरण के लिए अनुकूलन ने उन्हें पुनः संयोजक एंटीबॉडी या अन्य चिकित्सीय प्रोटीन व्यक्त करने के लिए जीन संपादन दृष्टिकोण के लिए एक आकर्षक लक्ष्य बना दिया है। माउस और मानव प्राथमिक बी कोशिकाओं का जीन संपादन कुशल है, और विवो अध्ययनों में माउस मॉडल ने वादा दिखाया है, लेकिन बड़े पशु मॉडल के लिए व्यवहार्यता और मापनीयता अब तक प्रदर्शित नहीं की गई है। इसलिए, हमने इस तरह के अध्ययन को सक्षम करने के लिए विट्रो में रीसस मकाक प्राथमिक बी कोशिकाओं को संपादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। हम सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 का उपयोग करके परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं या स्प्लेनोसाइट्स से प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं के इन विट्रो कल्चर और जीन-संपादन के लिए स्थितियों की रिपोर्ट करते हैं। बड़े (<4.5 केबी) कैसेट्स के लक्षित एकीकरण को प्राप्त करने के लिए, टेट्रासाइक्लिन-सक्षम स्व-साइलेंसिंग एडेनोवायरल हेल्पर वेक्टर का उपयोग करके होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट के रूप में पुनः संयोजक एडेनो-संबद्ध वायरस सीरोटाइप 6 तैयार करने के लिए एक तेज और कुशल प्रोटोकॉल शामिल किया गया था। ये प्रोटोकॉल रीसस मकाक में संभावित बी सेल चिकित्सीय के अध्ययन को सक्षम करते हैं।

Introduction

बी कोशिकाएं ह्यूमरल इम्युनिटी की नींव हैं। अंतरंग एंटीजन और द्वितीयक संकेतों द्वारा सक्रियण पर, भोले बी कोशिकाएं जर्मिनल सेंटर बी कोशिकाओं, मेमोरी बी कोशिकाओं और प्लाज्मा कोशिकाओंको जन्म देती हैं। उत्तरार्द्ध स्रावित एंटीबॉडी का स्रोत है जो वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश टीकों के सुरक्षात्मककार्यों को मध्यस्थ करता है। प्लाज्मा कोशिकाओं को एंटीबॉडी कारखानों के रूप में वर्णित किया गया है क्योंकि वे सीरम में एंटीबॉडी की विशाल मात्रा का स्राव करते हैं- लगभग 2 एनजी / दिन / सेल3, 7-16 ग्राम / एल सीरम की मात्रा, एंटीबॉडी सीरम4 में तीन सबसे प्रचुर मात्रा में प्रोटीन में से एक बनाते हैं। बी कोशिकाएं रक्त में प्रचुर मात्रा में होती हैं और इस प्रकार, आसानी से प्राप्त की जा सकती हैं और किसी व्यक्ति में वापस आ सकती हैं।

इन लक्षणों ने बी कोशिकाओं को बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) को जीन-संपादित करने और मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 और अन्य प्रोटीन 16 के लिए व्यापक रूप से निष्क्रिय एंटीबॉडी (बीएनएबी) को व्यक्त करने के लिए सेल थेरेपी प्रयासों का लक्ष्य बना दिया है। 17,18,19,20,21. इस तरह के दृष्टिकोण ने विवो 7,8,10,11,16,22 में कई माउस अध्ययनों में क्षमता दिखाई है। हालांकि, नैदानिक अनुवाद 9,15,23 के लिए अभी भी कई बाधाओं को दूर किया जाना चाहिए, उनमें से चिकित्सीय प्रभावकारिता की सुरक्षा, अवधि और परिमाण, साथ ही गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) जैसे बड़े जानवरों के लिए स्केलिंग शामिल है। दरअसल, एनएचपी, और विशेष रूप से रीसस मकाक, जिनका एंटीबॉडी और एचआईवी अनुसंधान24,25 में एक लंबा इतिहास है, इन मापदंडों का परीक्षण करने के लिए सबसे उपयुक्त मॉडल हैं।

यहां, हमने प्रोटोकॉल विकसित किए हैं जो इन मुद्दों को संबोधित करने में सक्षम बनाते हैं। आज तक, कुछ अध्ययनों ने रीसस मकाक बी कोशिकाओं को विवो में कल्चर करने का प्रयास किया है, और रीसस मकाक बी कोशिकाओं 26,27,28 के शुद्धिकरण के लिए सीडी 20 का उपयोग करके केवल सकारात्मक चयन की सूचना दी गई है। हमने अन्य सेल प्रकारों की नकारात्मक कमी से अनछुए रीसस मकाक बी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है। इसके अलावा, रीसस मकाक बी कोशिकाओं के लक्षित जीन संपादन के लिए संवर्धन स्थितियों को परिभाषित किया गया है। यह प्रोटोकॉल सुसंस्कृत रीसस मकाक बी कोशिकाओं को जीन संपादित करने के लिए होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट (एचडीआरटी) के रूप में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) और पुनः संयोजक एडेनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 6 (आरएएवी 6) के उपयोग को रेखांकित करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, बड़े (~ 1.5 केबी) सम्मिलित के साथ 40% तक संपादन क्षमता प्राप्त की गई थी। हम इस प्रारूप में एचडीआरटी के तेजी से परीक्षण को सक्षम करने के लिए टेट्रासाइक्लिन-सक्षम, स्व-साइलेंसिंग एडेनोवायरल हेल्पर29 का उपयोग करके आरएएवी 6 का उत्पादन करने के लिए एक तेज और लागत प्रभावी विधि भी प्रस्तुत करते हैं। संयुक्त रूप से, ये प्रोटोकॉल रीसस मकाक बी कोशिकाओं (चित्रा 1) के जीन संपादन के लिए एक कुशल वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं, जो एनएचपी मॉडल में बी सेल थेरेपी के मूल्यांकन को सक्षम करते हैं।

प्रयोगों को शुरू करने के लिए, दाता सामग्री को वाणिज्यिक स्रोतों से आदेश दिया जा सकता है या फ्लेबोटोमी या स्प्लेनेक्टोमी द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। इस अध्ययन में, एंटीकोआगुलेंट ईडीटीए का उपयोग करके पहले वर्णित30 के रूप में फ्लेबोटोमी और रक्त संग्रह किए गए थे। स्प्लेनिक प्राप्त करने के लिए, प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं, आंशिक (25% -50%) या कुल स्प्लेनेक्टोमी को पहलेबताई गई तकनीकों का उपयोग करके किया गया था। सर्जरी से पहले जानवरों को रात भर उपवास किया गया था। संक्षेप में, सर्जरी के दौरान, पेट को तीन बार क्लोरहेक्सिडाइन और 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के वैकल्पिक स्क्रब के साथ तैयार किया गया था। तिल्ली की पहचान करने और अलग करने के लिए पेट में एक चीरा (5-10 सेमी) लगाया गया था। तिल्ली के वाहिका को या तो सीवन या संवहनी क्लैंप के साथ जोड़ा गया था। चीरा को 4-0 पीडीएस पॉलीडिओक्सानोन सीवन के साथ दो परतों में बंद कर दिया गया था। स्प्लेनेक्टोमी एक व्यक्तिगत जानवर के लिए एक बार किया गया था। सिंगल-सेल सस्पेंशन को मैकाक प्लीहा से सेल स्ट्रेनर के माध्यम से मैकेशन द्वारा तैयार किया गया था। रक्त और स्प्लेनिक सेल सस्पेंशन से मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके तैयार किया गया था और तरल नाइट्रोजन में संग्रहीत किया गया था।

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं और प्रयोगों को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। निम्न प्रोटोकॉल का सारांश चित्रा 1 में प्रस्तुत किया गया है। भारतीय आनुवंशिक मूल के नर और मादा रीसस मकाक (मकाका मुलाटा) की आयु 2-8 वर्ष थी, उन्हें जैव सुरक्षा स्तर 2 सुविधा में प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग पर समिति के दिशानिर्देशों के अनुसार रखा गया था और उनकी देखभाल की गई थी।

चेतावनी: सभी प्रयोग रक्तजनित रोगजनकों के लिए सार्वभौमिक सावधानियों के अनुपालन में किए गए थे, बाँझ / सड़न रोकनेवाला तकनीकों और लैमिनार प्रवाह हुड में उचित जैव सुरक्षा स्तर 2 उपकरण के साथ।

1. आरएएवी 6 उत्पादन

  1. आरएएवी 6 उत्पादन के लिए अभिकर्मकों को तैयार करें।
    1. मानक तकनीकों का उपयोग करके वेक्टर पीएवी में एएवी 2 के उल्टे टर्मिनल दोहराव (आईटीआर) के बीच होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत टेम्पलेट को डिजाइन और क्लोन करें। सुनिश्चित करें कि होमोलॉजी आर्म्स दोनों तरफ कम से कम ~ 250 बीपी के हैं, लेकिन 60 बीपी तक पर्याप्त हो सकते हैं, हालांकि लंबे समय तक होमोलॉजी हथियारों को प्राथमिकता दी जाती है यदि निर्माण डिजाइन इसके लिए अनुमति देता है। यदि एचडीआरटी में किसी भी उपयोग किए गए एसजीआरएनए के लक्ष्य अनुक्रम मौजूद हैं, तो उन्हें मूक उत्परिवर्तन का उपयोग करके हटा दें, जो लक्ष्य साइट के प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति या बीज क्षेत्र में सबसे प्रभावी हैं।
      नोट: कुशल क्लोनिंग32 के लिए गिब्सन असेंबली के साथ संयुक्त जीन संश्लेषण किया जा सकता है। अभिकर्मक के लिए एक सही क्लोन का मैक्सिप्रेप तैयार करें। एसजीआरएनए डिजाइन के लिए, चॉपचॉप33 की सिफारिश की जाती है, और https://zlab.bio/guide-design-resources पर अधिक उपकरणों की एक सूची पाई जा सकती है। आईटीआर सहित एएवी के लिए अधिकतम पैकेजिंग क्षमता ~ 4.7 केबी है। एएवी 6 हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं, विशेष रूप से बी कोशिकाओं9 के संपादन के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला सीरोटाइप है। रीसस मकाक बी कोशिकाओं के जीन संपादन के लिए एएवी के अन्य सीरोटाइप का परीक्षण नहीं किया गया है, लेकिन माउस अध्ययन में एएवी 28 और एएवी-डीजे10,11 का उपयोग किया गया है।
    2. तालिका 1 और तालिका 2 के अनुसार 293 AAV संस्कृति माध्यम और उत्पादन माध्यम तैयार करें। 0.2 μm पॉलीथेरसल्फोन (PES) झिल्ली फ़िल्टर इकाई के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. 1x पॉलीथाइलेनिमाइन (पीईआई) समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल, 100 एमएल) तैयार करें।
    4. एक 250 एमएल ग्लास बीकर में, ~ 30 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में ~ 70 एमएल एच2ओ गर्म करें, और फिर 100 मिलीग्राम पीईआई जोड़ें। एक चुंबकीय हलचल जोड़ें, और पीईआई को ज्यादातर भंग होने तक हिलाएं।
    5. पीएच को 1 एम एचसीएल के साथ 7 में समायोजित करें, फिर एच2ओ के साथ 100 एमएल तक टॉप करें, 10 मिनट प्रतीक्षा करें, पीएच को फिर से जांचें, और यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।
    6. 0.2 μm PES झिल्ली फ़िल्टर इकाई, एलिकोट और स्टोर -20 °C के माध्यम से पीईआई समाधान को बाँझ-फ़िल्टर करें। पिघलने के बाद, समाधान को 2 महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    7. 5x पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल (PEG)/NaCl समाधान तैयार करें।
    8. 400 ग्राम पीईजी 8,000 और 24 ग्राम एनएसीएल का वजन करें।
    9. 2 लीटर ग्लास बीकर में एक चुंबकीय स्टिरर जोड़ें, वजन किए गए पीईजी 8,000 और एनएसीएल जोड़ें, और ~ 550 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी से कुल्ला करें।
    10. हीटिंग के साथ हिलाएं, और पूरी तरह से घुलने तक उबाल या 80-90 डिग्री सेल्सियस तक लाएं।
    11. पीएच को 1 एम एनएओएच के साथ ~ 7.4 में समायोजित करें, फिर मापने वाले सिलेंडर का उपयोग करके वॉल्यूम को 1 एल में समायोजित करें, और इसे चुंबकीय स्टिरर के साथ 2 एल ग्लास बोतल में स्थानांतरित करें।
    12. बोतल, चुंबकीय हलचल, और घोल को 121 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए पानी के स्नान में ऑटोक्लेव करें।
    13. आटोक्लेविंग के बाद, विभिन्न चरणों में पृथक्करण को रोकने के लिए चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग करके हिलाते हुए एक ठंडे कमरे में घोल को ठंडा करें। यदि आवश्यक हो तो एलिकोट, और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    14. फॉर्मूलेशन बफर तैयार करें।
    15. 10% प्लूरोनिक एफ -68 के 50 μL के साथ DPBS के 500 mL मिलाएं। 0.2 μm PES झिल्ली फ़िल्टर इकाई के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर करें, और कमरे के तापमान (RT) पर स्टोर करें।
  2. आरएएवी 6 उत्पादन के लिए सेल संस्कृति, अभिकर्मक और पारगमन
    1. विभाजन के लिए उपरोक्त 293एएवी संस्कृति माध्यम और ट्रिप्सिन-ईडीटीए का उपयोग करके निर्माता द्वारा वर्णित 293एएवी कोशिकाओं को पिघलना, संस्कृति और फ्रीज करना। कुछ शुरुआती मार्गों को फ्रीज करने और एएवी उत्पादन के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, इससे पहले कि वे मार्ग 40 तक पहुंच जाएं।
    2. आरएएवी 6 उत्पादन के लिए, 30 एमएल में 5 x 106 कोशिकाओं के साथ चार 15 सेमी सेल कल्चर व्यंजन बीज। कोशिकाएं आमतौर पर बीज बोने के 1-2 दिन बाद अभिकर्मक के लिए तैयार होती हैं जब वे 80% -90% संगम तक पहुंचती हैं।
    3. एएवी 6 में पैक किए जाने वाले एचडीआरटी युक्त पीएएवी प्लास्मिड के एक मैक्सिप्रेप को पिघलाएं। शुद्ध डीएमईएम माध्यम के 3 एमएल में पीएवी प्लास्मिड के 85.6 μg को पुन: चार्ज करें।
    4. शुद्ध डीएमईएम माध्यम के 3 एमएल में 1 मिलीग्राम / एमएल पीईआई समाधान के 342 μL को घोलें। आरटी में 10 मिनट के लिए दोनों समाधानों को इनक्यूबेट करें।
    5. दोनों 3 एमएल ट्यूबों को ~ 6.4 एमएल अभिकर्मक मिश्रण की एक ट्यूब में मिलाएं, और आरटी में 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. इस बीच, टेट्रासाइक्लिन-सक्षम, स्व-साइलेंसिंग हेल्पर वेक्टर रेपकैप 6 को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाएं। 293एएवी कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए, औसत ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक (टीसीआईडी 50) का उपयोग करके25 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर हेल्पर वेक्टर जोड़ें और 1.15 x 107 कोशिकाओं / डिश को मानते हुए; आमतौर पर, प्रति 15 सेमी डिश में 2-10 μL का उपयोग किया जाता है। वितरित करने के लिए व्यंजनों को धीरे से हिलाएं और घुमाएं।
    7. अभिकर्मक मिश्रण के इनक्यूबेशन के बाद, चार 15 सेमी व्यंजनों में से प्रत्येक में 1.6 मिलीलीटर जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, यदि रुचि के आरएएवी 6 वैक्टर पहले से ही उपलब्ध हैं, तो इन वैक्टर का उपयोग वायरल जीनोम को पैक करने के लिए किया जा सकता है, जो इस प्रणाली के साथ किसी भी प्लास्मिड की आवश्यकता को नकारता है और तुलनीय आरएएवी 6 टिटर्स पैदा करता है। इस दृष्टिकोण के लिए, 293एएवी कोशिकाओं को हेल्पर वेक्टर के साथ 50 के एमओआई (आरएएवी 6 जीनोम प्रतियों [जीसी]/एमएल के आधार पर) पर वांछित आरएएवी 6 के साथ सह-ट्रांसड्यूस किया जाता है।
    8. अगले दिन, सावधानीपूर्वक संस्कृति माध्यम को एस्पिरेट करें और त्याग दें, और 30 एमएल पूर्वनिर्मित उत्पादन माध्यम के साथ प्रतिस्थापित करें। कटाई से पहले 96 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। पैदावार को अधिकतम करने के लिए कोई और मध्यम परिवर्तन की सिफारिश नहीं की जाती है।
  3. माध्यम से पुनः संयोजक AAV6 की फसल और शुद्धिकरण
    1. डिश से कोशिकाओं को हटाने के बिना, सभी सेल सुपरनैटेंट को फ़िल्टर यूनिट में इकट्ठा करें जिसमें 0.2 μm PES झिल्ली फ़िल्टर की जाने वाली मध्यम की मात्रा से कम से कम 50% बड़ी हो। फिर, सुपरनैटेंट को फ़िल्टर करें।
      नोट: यदि आरएएवी 6 की उच्च पैदावार वांछित है, तो कोशिकाओं को काटा जा सकता है और वाणिज्यिक किट या स्थापित प्रोटोकॉल34,35 का उपयोग करके सेल पेलेट से आरएएवी निकाला जा सकता है। चूंकि एएवी 6 को ज्यादातर माध्यम36 में स्रावित किया जाता है, इसलिए श्रम, लागत और समय को कम करते हुए केवल सतह पर तैरनेवाला का उपयोग किया गया था।
    2. एकत्रित मात्रा के 25% पर फ़िल्टर किए गए सुपरनैटेंट में 5x PEG / NaCl समाधान जोड़ें; यह आमतौर पर 30 एमएल है यदि 30 एमएल के चार 15 सेमी व्यंजनों का उपयोग किया जाता है।
    3. इनवर्टिंग द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, और फिर वायरल कणों को अवक्षेपित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
      नोट: एएवी कण इस समाधान में 2 दिनों तक स्थिर होते हैं।
    4. प्रीकूल एक स्विंग बकेट सेंट्रीफ्यूज है जिसमें 250 एमएल ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस तक प्रवेश करती है। आरटी में कम से कम 1 घंटे के लिए 10% प्लूरोनिक एफ -68 के 2 एमएल के साथ प्रत्येक झिल्ली को पूर्वउपचार करके 100 केडीए कटऑफ और 0.22 μm हाइड्रोफिलिक पीईएस सिरिंज फिल्टर के साथ एक 4 एमएल केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई तैयार करें।
    5. एएवी-पीईजी/एनएसीएल मिश्रण को 250 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, सेंट्रीफ्यूज 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2,500 x g पर, और फिर आकांक्षा द्वारा पूरे सतह पर तैरने वाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    6. बेज को 1 एम एचईपीईएस के 4 एमएल में भंवर में घुमाकर सफेद वायरल पेलेट में फिर से निलंबित करें जब तक कि पूरी तरह से पुन: निलंबित न हो जाए। यदि आवश्यक हो, तो इसे 5 मिनट के लिए खड़े रहने दें, और भंवर फिर से। 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पुन: निलंबित करें, और कुल मात्रा को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. एक फ्यूम हुड में, वायरस निलंबन में क्लोरोफॉर्म की एक समान मात्रा जोड़ें- आमतौर पर 4 एमएल।
    8. 2 मिनट के लिए जोरदार भंवर, और फिर आरटी में 5 मिनट के लिए 1,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    9. एक नई 50 एमएल ट्यूब में शीर्ष परत (एएवी युक्त सुपरनैटेंट) एकत्र करें, और नीचे की परत (क्लोरोफॉर्म) को छोड़ दें।
      चेतावनी: क्लोरोफॉर्म युक्त समाधान खतरनाक अपशिष्ट हैं। इसके निपटान के लिए संस्थागत दिशा-निर्देशों का पालन करें।
    10. एएवी युक्त सुपरनैटेंट को एक फ्यूम हुड के नीचे रखें, और शेष क्लोरोफॉर्म को 30 मिनट के लिए वाष्पित होने दें।
    11. इस बीच, प्रीट्रीटेड केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट और सिरिंज फिल्टर को धो लें।
    12. प्रीट्रीटेड केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट में 1.5 एमएल फॉर्मूलेशन बफर जोड़ें। एक स्विंगिंग बकेट रोटर में 10 मिनट के लिए 3,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज 15 डिग्री सेल्सियस पर। झिल्ली को धोने के लिए 4 एमएल फॉर्मूलेशन बफर के साथ इस चरण को दोहराएं।
    13. 5 एमएल सिरिंज का उपयोग करके 5 एमएल फॉर्मूलेशन बफर के साथ सिरिंज फिल्टर को दो बार धोएं।
    14. क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण से एएवी युक्त सुपरनैटेंट के ~ 4 एमएल को 5 एमएल सिरिंज में लोड करें, धुले हुए सिरिंज फिल्टर को संलग्न करें, और सीधे केन्द्रापसारक फ़िल्टर इकाई में फ़िल्टर करें।
    15. सेंट्रीफ्यूज 15 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 3,500 x g पर, और फिर पुष्टि करें कि फ़िल्टर में एएवी समाधान लगभग 50-100 μL के बीच है। यदि समाधान की मात्रा >100 μL है, तो सेंट्रीफ्यूज करना जारी रखें।
    16. फिल्ट्रेट को हटाने के बाद, केन्द्रापसारक फ़िल्टर यूनिट के कप के अंदर 4 एमएल फॉर्मूलेशन बफर जोड़ें, और पाइपिंग द्वारा समाधान को समान रूप से मिलाएं। सेंट्रीफ्यूज 15 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिनट के लिए 3,500 x g पर, और फिर पुष्टि करें कि फ़िल्टर में AAV समाधान 50-100 μL के बीच है। यदि समाधान की मात्रा >100 μL है, तो सेंट्रीफ्यूज करना जारी रखें। एक और धोने के लिए इस चरण को दोहराएं।
    17. अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, पुष्टि करें कि समाधान की मात्रा 50-70 μL है; यदि नहीं, तो सेंट्रीफ्यूज करना जारी रखें। तैयारी को 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। यदि वांछित हो तो एलिकोट, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. क्यूपीसीआर द्वारा पुनः संयोजक AAV6 टिटर निर्धारण
    नोट: क्यूपीसीआर प्राइमर आईटीआर क्षेत्र में नष्ट हो जाते हैं और इस प्रकार, पीएवी में क्लोन किए गए सभी निर्माणों के लिए उपयुक्त होना चाहिए।
    1. आरएएवी 6 के एक एलिकोट को टिटर किया जाना चाहिए और एएवी 6 संदर्भ सामग्री का एक एलिकोट। AAV6 संदर्भ सामग्री 4 x 1011 GC / mL के करीब होनी चाहिए; अन्यथा, कमजोर पड़ने को तदनुसार समायोजित करें।
    2. नमूने या एएवी 6 संदर्भ सामग्री के 2.0 μL के नमूने या AAV6 संदर्भ सामग्री के 15.6 μL के न्यूक्लियस-मुक्तH2O, 10x DNase I बफर के 2.0 μL और DNase I के 0.4 μL के संयोजन से RAAV6 तैयारी में किसी भी शेष मुक्त प्लास्मिड डीएनए को हटाने के लिए एक DNase I पाचन करें।
    3. धीरे से मिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर बर्फ में स्थानांतरित करें। यह कमजोर पड़ने वाला 1 है ( तालिका 3 देखें)।
    4. पानी के साथ नीचे दी गई तालिका 3 के अनुसार सभी नमूनों और एएवी 6 संदर्भ सामग्री के पांच गुना सीरियल कमजोर पड़ने की तैयारी करें।
    5. एक SYBR ग्रीन QPCR मास्टर मिश्रण तैयार करें। प्रति कूप, 4.7 μL न्यूक्लियस-मुक्त पानी को 10 μL SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स के साथ मिलाएं, 0.15 μL ITR प्राइमर को 100 μM पर आगे और 0.15 μL ITR प्राइमर रिवर्स को 100 μM पर मिलाएं।
      नोट: प्रत्येक नमूने को डुप्लिकेट में मापा जाता है, जिसमें संदर्भ मानक के लिए 16 कुएं, प्रति नमूना 8 कुएं और नो-टेम्प्लेट नियंत्रण के लिए 2 कुएं होते हैं। पाइपिंग त्रुटि के लिए 10% अधिक मास्टर मिश्रण तैयार करें।
    6. एक ऑप्टिकल 96-वेल या 384-वेल रिएक्शन प्लेट में, SYBR Green qPCR मास्टर मिक्स के 15 μL / वेल लोड करें।
    7. इसके बाद, नो-टेम्प्लेट नियंत्रण के लिए नमूने और एएवी 6 संदर्भ सामग्री या न्यूक्लियस-मुक्त पानी के 5 μL लोड करें। AAV6 संदर्भ मानक के लिए, लोड कमजोर पड़ने 2 से कमजोर पड़ने 9 तक। नमूनों के लिए, लोड कमजोर पड़ने 5 से कमजोर पड़ने 8 तक। डुप्लिकेट में प्रत्येक कमजोर पड़ने को मापें। बुलबुले से बचें।
    8. ऑप्टिकल पारदर्शी फिल्म के साथ भरी हुई प्लेट को सील करें, आरटी पर 1 मिनट के लिए 800 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और प्लेट को उपयुक्त 96-वेल या 384-वेल सेटअप के साथ क्यूपीसीआर उपकरण में लोड करें।
    9. निम्नलिखित साइकिल िंग स्थितियों के साथ SYBR डिटेक्शन का उपयोग करके QPCR उपकरण सेट करें और चलाएं: 3 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस, फिर 15 सेकंड के लिए 98 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र और 30 सेकंड के लिए 58 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद पिघलने वक्र।
    10. मानक वक्र के रूप में जीनोम प्रतियों प्रति मिलीमीटर (जीसी / एमएल) में एएवी 6 संदर्भ सामग्री की एकाग्रता का उपयोग करके उपकरण के सॉफ्टवेयर के साथ डेटा का विश्लेषण करें ( तालिका 3 देखें)। कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करके नमूने की अंतिम एकाग्रता की गणना करें।
    11. सुनिश्चित करें कि मानक वक्र आर2 1.0 के करीब है, पीसीआर दक्षता 90% -110% है, बेसलाइन हटा दी गई है, पिघलने वक्र एक एकल शिखर दिखाता है, सी टी मान कमजोरपड़ने के अनुसार बदलते हैं, और डुप्लिकेट 0.5 सीटी के भीतर हैं; अन्यथा, आउटलायर्स को बाहर रखें। चित्र 2 के अनुसार पैदावार की उम्मीद करें।

2. बी सेल मीडिया और उत्तेजनाओं की तैयारी

  1. पिघलने का माध्यम तैयार करें: आरपीएमआई -1640 को 20% एफसीएस के साथ मिलाएं। 0.2 μm PES झिल्ली फ़िल्टर इकाई के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. बी सेल कल्चर माध्यम तैयार करें: तालिका 4 में अभिकर्मकों को मिलाएं, और फिर 0.2 μm PES झिल्ली फ़िल्टर इकाई के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. तालिका 5 में बी सेल उत्तेजक पदार्थों में से प्रत्येक को बी सेल कल्चर माध्यम में स्टॉक सांद्रता पर पुन: निलंबित किया गया है, सीपीजी ओडीएन को छोड़कर जिसे न्यूक्लियस मुक्त पानी में फिर से निलंबित किया जाना चाहिए। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. यदि गैर-बी सेल नकारात्मक कमी (वैकल्पिक चरण 4) का प्रदर्शन करते हैं, तो 2% एफसीएस (डीपीबीएस 2% एफसीएस) के साथ डीपीबीएस (कोई कैल्शियम नहीं, कोई मैग्नीशियम नहीं) तैयार करें। 0.2 μm PES झिल्ली फ़िल्टर इकाई के माध्यम से बाँझ-फ़िल्टर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

3. रीसस मकाक बी कोशिकाओं की तैयारी और संस्कृति

नोट: क्रायोप्रिजर्व्ड रीसस मकाक पीबीएमसी या स्प्लेनोसाइट्स का उपयोग सेल कल्चर30,31 को स्थापित करने के लिए किया जाता है।

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में प्रीवार्म पिघलने मध्यम और बी सेल कल्चर मीडिया। बर्फ पर तालिका 5 से बी सेल उत्तेजक पदार्थों को पिघलाएं।
  2. एक उचित आकार की ट्यूब तैयार करें जिसमें पूर्व-गर्म पिघलने का माध्यम हो। यह आदर्श रूप से पिघली हुई कोशिकाओं की मात्रा से 10 गुना अधिक होना चाहिए।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक समय में पीबीएमसी या स्प्लेनोसाइट्स के एक से दो क्रायोवियल्स को पिघलाएं, और तैयार ट्यूब में पूर्वनिर्मित माध्यम के साथ डिकेंट करें। सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए क्रायोट्यूब को कुल्ला करें।
  4. आरटी में 10 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
    नोट: ये सेंट्रीफ्यूजेशन सेटिंग्स पीबीएमसी पैदावार को संरक्षित करते हुए प्लेटलेट संदूषण को कम करती हैं। 5 मिनट के लिए 350 x g जैसी उच्च गति का उपयोग किया जा सकता है।
  5. धोने के लिए कोशिकाओं को 10 एमएल पिघलने वाले माध्यम में पुन: निलंबित करें।
  6. ठंड माध्यम को हटाने के लिए कुल तीन सेंट्रीफ्यूजेशन के लिए चरण 3.4 और चरण 3.5 दोहराएं। अंतिम सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, बी सेल कल्चर माध्यम में अनुमानित ~ 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
    नोट: उपरोक्त प्रोटोकॉल अन्य कोशिकाओं द्वारा संदूषण के साथ पूरे पीबीएमसी या स्प्लेनोसाइट तैयारी को पूरा करता है। यदि शुद्ध बी सेल संस्कृतियों की आवश्यकता होती है, भले ही कुल बी सेल पैदावार में काफी कमी आई हो, तो चरण 4 के साथ जारी रखें। दोनों विधियों के बीच संपादन क्षमता में कोई अंतर नहीं देखा गया है।
  7. गिनती के लिए बी सेल कल्चर माध्यम के साथ आवश्यक 10 μL कोशिकाओं के एक एलिकोट को पतला करें। हेमोसाइटोमीटर और ट्रिपैन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करके गणना करें, जो पुन: निलंबित कोशिकाओं की समान मात्रा और ट्रिपैन ब्लू 0.4% समाधान का संयोजन करते हैं।
  8. सेल गणना के अनुसार बी सेल कल्चर माध्यम के साथ सेल एकाग्रता को 3 x 106 कोशिकाओं / एमएल में समायोजित करें। फिर, तालिका 5 के अनुसार बी सेल उत्तेजक को उनकी अंतिम सांद्रता में जोड़ें, और मिश्रण करें।
  9. कोशिकाओं को एक उपयुक्त सेल कल्चर डिश में स्थानांतरित करें। कुल मिलाकर, 0.6 x 10 6-0.7 x 106 कोशिकाओं / सेमी2 की सिफारिश की जाती है। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 के साथ 48 घंटे ± 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

4. गैर-बी कोशिकाओं की वैकल्पिक नकारात्मक कमी

नोट: उपज और शुद्धता पीबीएमसी के बीच बी कोशिकाओं के इनपुट प्रतिशत पर निर्भर करती है, जो व्यक्तिगत रीसस मकाक27 के बीच काफी भिन्न हो सकती है। 1 x 107 PBMCs से 80% -95% शुद्धता,60% दक्षता, और 1 x 10 6-1.5 x 106 कोशिकाओं की उम्मीद करें।

  1. अंतिम धोने (चरण 3.6) के बाद, डीपीबीएस 2% एफसीएस में 1 x 108 कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और मानव एफसी-ब्लॉक पतला 1: 200। सेल की गिनती पिघली हुई कोशिकाओं की संख्या पर आधारित होती है।
  2. एफसी रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करने के लिए बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और फिर तालिका 6 में बायोटिनिलेटेड एंटीबॉडी जोड़ें। बर्फ पर एक और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. डीपीबीएस 2% एफसीएस के साथ ट्यूब को ऊपर उठाएं, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 200 x g पर स्पिन करें।
  4. चरण 4.1 से मात्रा के 80% पर डीपीबीएस 2% एफसीएस में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें (यानी, 80 μL प्रति 1 x 107 कोशिकाएं)।
  5. चरण 4.1 से मात्रा के 20% पर सेल निलंबन में चुंबकीय स्ट्रेप्टाविडिन मोती जोड़ें (यानी, प्रति 1 x 107 कोशिकाओं में मोतियों का 20 μL)।
  6. कोशिकाओं को बर्फ पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और कभी-कभी आंदोलन करें।
  7. इस बीच, प्रति 1 x 108 कोशिकाओं में, एक बड़े चुंबकीय रिक्तीकरण स्तंभ और एक पूर्व-पृथक्करण फ़िल्टर के साथ एक चुंबकीय विभाजक तैयार करें। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा डीपीबीएस 2% एफसीएस के 2 एमएल के साथ प्री-सेपरेशन फिल्टर और कॉलम को कुल्ला करें, और प्रवाह-थ्रू को छोड़ दें। एक 15 एमएल संग्रह ट्यूब स्थापित करें।
    नोट: सकारात्मक चयन स्तंभ या अन्य चुंबकीय मोती शोधन प्रणालियों जैसे अन्य स्तंभों का उपयोग शुद्धता को काफी कम कर सकता है।
  8. इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं को डीपीबीएस 2% एफसीएस के साथ 0.5 एमएल तक टॉप अप करें यदि मात्रा <0.5 एमएल है। यदि आयतन ≥0.5 एमएल है, तो बस आगे बढ़ें।
  9. सेल निलंबन को तैयार कॉलम पर पूर्व-पृथक्करण फ़िल्टर में लोड करें, और 15 एमएल ट्यूब में प्रवाह-माध्यम से एकत्र करें।
  10. प्री-सेपरेशन फिल्टर में डीपीबीएस 2% एफसीएस के 1 एमएल जोड़कर अनबाउंड समृद्ध बी कोशिकाओं को दो बार हटा दें। गुरुत्वाकर्षण प्रवाह द्वारा अनबाउंड कोशिकाओं को एक ही ट्यूब में इकट्ठा करें।
    नोट: अतिरिक्त क्षालन उपज में मामूली वृद्धि कर सकता है। शुद्धता और दक्षता का मूल्यांकन इनपुट कोशिकाओं, समृद्ध कोशिकाओं और कॉलम पर बनाए गए कोशिकाओं के प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा किया जा सकता है। कॉलम पर रखी गई कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, चुंबक से कॉलम को हटा दें, और प्रदान किए गए प्लंजर का उपयोग करके डीपीबीएस 2% एफसीएस के 3 एमएल के साथ फ्लश करें। यदि वांछित हो, तो तालिका 7 में अभिकर्मकों का उपयोग करके चित्र 3 में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता का मूल्यांकन करें।
  11. समृद्ध बी कोशिकाओं को 200 x g पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  12. बी सेल कल्चर माध्यम में अनुमानित ~ 5 x 106 कोशिकाओं / एमएल पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें, और चरण 3.7 पर जारी रखें।

5. प्राथमिक रीसस मकाक बी सेल जीन संपादन

  1. रीसस मकाक बी कोशिकाओं को 48 घंटे ± 2 घंटे के लिए सक्रिय करने के बाद, इलेक्ट्रोपोरेशन और ट्रांसडक्शन के लिए अभिकर्मकों को तैयार करें।
    1. प्रीवार्म डीएमएसओ, न्यूक्लियस-फ्री डुप्लेक्स बफर, बफर टी, और बफर ई (10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन किट) या E2 (100 μL इलेक्ट्रोपोरेशन किट) इलेक्ट्रोपोरेशन किट से RT तक।
    2. बर्फ पर तालिका 5 से आरएएवी 6 एचडीआरटी और बी सेल उत्तेजक पदार्थों को पिघलाएं।
  2. CRISPR-Cas9 sgRNA को डुप्लेक्स बफर में 100 μM पर पुन: निलंबित करें। आरटी में 10 मिनट के लिए पुनर्गठित करें, और भंवर और फ्लिक करके मिलाएं। पुनर्गठित एसजीआरएनए को उपयोग होने तक बर्फ पर रखें। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: CRISPR-Cas9 sgRNA को विभिन्न ऑनलाइन उपकरणों (1.1.1 देखें) के साथ डिज़ाइन किया जा सकता है और उनकी काटने की दक्षता में काफी भिन्नता हो सकती है। काटने की दक्षता के अनुभवजन्य परीक्षण की सिफारिश टाइड37 या आईसीई38 जैसे परखों का उपयोग करके की जाती है।
  3. प्रति 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन, तालिका 5 से सभी उत्तेजक पदार्थों के साथ 550 μL B सेल कल्चर माध्यम तैयार करें, और 1% DMSO जोड़ें। 100 μL इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए वॉल्यूम को 10 गुना स्केल करें। वैकल्पिक रूप से, इस माध्यम का 10% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के बिना तैयार किया जा सकता है, जो अभिकर्मक के बाद सेल व्यवहार्यता को थोड़ा बढ़ाता है।
  4. प्रति 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन, 48-वेल सेल कल्चर प्लेट का एक कुआं तैयार करें, जिसमें उत्तेजक पदार्थों के साथ और एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक के बिना 50 μL बी सेल कल्चर माध्यम हो, यदि इसका उपयोग किया जाता है। 100 μL इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, पिपेने 6-वेल प्लेट के कुओं में 500 μL का उपयोग करें।
  5. कुओं में माध्यम में आरएएवी 6 एचडीआरटी जोड़ें, कुएं में मात्रा का 20% तक। प्रति अभिकर्मक कोशिकाओं की संख्या के आधार पर 1 x 105-1 x 106 तक एमओआई का लक्ष्य रखें (10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन: 5 x 105 कोशिकाएं; 100 μL इलेक्ट्रोपोरेशन: 5 x 106 कोशिकाएं) और RAAV6 तैयारी में GC। कम मात्रा वाले उच्च एमओआई प्राप्त करने के लिए 5 x 1013 GC/mL से 5 x 1014 GC/mL की उच्च RAAV6 स्टॉक सांद्रता की सिफारिश की जाती है।
    नोट: कम एमओआई से संपादन दक्षता कम हो सकती है, और 5 x 105 के एमओआई आम तौर पर हमारे द्वारा देखी गई अधिकतम संपादन क्षमता के करीब होते हैं। बी सेल व्यवहार्यता पर अलग-अलग एमओआई का प्रभाव नहीं देखा गया है। आरएएवी 6 एचडीआरटी के बिना, आरएनपी अभिकर्मक के बिना, और दोनों के बिना नियंत्रण शामिल करने की सिफारिश की जाती है।
  6. तैयार व्यंजनों और शेष माध्यम को 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करके तैयार करें।
  7. प्रति 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन, राइबोन्यूक्लिओप्रोटीन (RNP) का 1.15 μL तैयार करें: डुप्लेक्स बफर में 100 μM sgRNA के 0.75 μL के साथ 61 μM Cas9 के 0.4 μL मिलाएं। पाइपिंग त्रुटि के कारण अतिरिक्त तैयार करें (एकल इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए 30% अधिक अनुशंसित है) और इलेक्ट्रोपोरेशन युक्तियों को लोड करते समय बुलबुले से बचने के लिए। 100 μL युक्तियों के लिए स्केल 10-गुना।
  8. कोशिकाओं के साथ मिश्रण करने से पहले आरटी में कम से कम 15 मिनट के लिए आरएनपी को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, कई आरएनपी को जोड़ा जा सकता है यदि एक साथ एक से अधिक टिड्डों को लक्षित किया जाना है। एक ही समय में तीन लोकी के साथ दक्षता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया है।
  9. इस बीच, इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए कोशिकाओं को तैयार करें। तापमान के झटके से बचने के लिए कोशिकाओं को हर समय आरटी पर रखें। 48 घंटे ± 2 घंटे की संस्कृति के बाद कोशिकाओं को एक उपयुक्त पोत में काटें। कोशिकाओं की अधिकतम संख्या एकत्र करने के लिए डीपीबीएस के साथ व्यंजनों को कुल्ला करें।
  10. RT पर 10 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को छोड़ दें, और DPBS में कोशिकाओं को ~ 2 x 106 कोशिकाओं / mL पर पुन: निलंबित करें।
  11. सेल सस्पेंशन के 10 μL के साथ ट्रिपैन ब्लू 0.4% समाधान के 10 μL मिलाएं, और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें।
    नोट: इस बिंदु पर, कटाई और धोने के दौरान नुकसान के कारण, लगभग 60% कोशिकाओं की उम्मीद करें जिन्हें 48 घंटे ± 2 घंटे पहले संस्कृति में रखा गया था।
  12. इस बीच, आरटी में 10 मिनट के लिए 200 x g पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। उपरोक्त सेल गणना के आधार पर 5.55 x 107 कोशिकाओं / एमएल पर प्रीवार्म्ड (आरटी) बफर टी में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  13. मशीन को चालू करके और इसे 1,350 वी, 15 एमएस और 1 पल्स पर सेट करके अभिकर्मक प्रणाली सेट करें। पिपेट स्टेशन को लामिनार प्रवाह हुड के अंदर रखें
  14. 10 इलेक्ट्रोपोरेशन के प्रत्येक सेट के लिए, 3 एमएल बफर ई (10 μL अभिकर्मक के लिए) या E2 (100 μL अभिकर्मक के लिए) के साथ एक अभिकर्मक ट्यूब तैयार करें। ट्यूब को पिपेट स्टेशन में डालें।
  15. प्रति 10 μL इलेक्ट्रोपोरेशन, 1.15 μL RNP को 9 μL कोशिकाओं के साथ मिलाएं। इलेक्ट्रोपोरेशन टिप में हवा को वाष्पित करने से बचने के लिए पर्याप्त मात्रा (+ 30%) होना सुनिश्चित करें। इलेक्ट्रोपोरेशन से पहले 1-2 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  16. एस्पिरेटेड 10 μL या 100 μL RNP और सेल मिश्रण को इलेक्ट्रोपोरेशन पिपेट पर उचित आकार के इलेक्ट्रोपोरेशन टिप में डालें, लोड किए गए पिपेट को पिपेट स्टेशन में डालें, और इलेक्ट्रोपोरेशन शुरू करें। सुनिश्चित करें कि आर्किंग को रोकने के लिए युक्तियां हवा के बुलबुले से पूरी तरह से मुक्त हैं। इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान यह सत्यापित करने के लिए देखें कि आर्किंग नहीं होती है।
  17. 48-वेल (10 μL अभिकर्मक) या 6-वेल प्लेट (100 μL अभिकर्मक) के अंदर RAAV6 के साथ या उसके बिना तैयार, पूर्व-निर्मित, मध्यम की छोटी मात्रा में इलेक्ट्रोपोरेट कोशिकाओं को तुरंत बाहर निकाल दें। शेष नमूने के साथ चरण 5.15-5.17 दोहराएं। संस्कृति कुओं में अभिकर्मक के बिना नियंत्रण नमूने जोड़ें।
  18. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे ±2 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ इनक्यूबेट करें, और फिर तैयार, पूर्वनिर्मित बी सेल कल्चर माध्यम जोड़ें जिसमें उत्तेजक, डीएमएसओ, और एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक शामिल हैं: 10 μL अभिकर्मक के लिए 450 μL या 100 μL अभिकर्मक के लिए 4.5 mL।
  19. 12-24 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन जारी रखें। फिर, यदि विस्तारित संवर्धन वांछित है तो डीएमएसओ के बिना उत्तेजक और एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक युक्त माध्यम से बी सेल कल्चर माध्यम को बदलें। जीनोमिक डीएनए का विश्लेषण 24 घंटे के बाद किया जा सकता है। होमोलॉजी आर्म के बाहर एक प्राइमर और इंसर्ट के अंदर एक प्राइमर का उपयोग करके डिजिटल ड्रॉपलेट पीसीआर का उपयोग संपादन दक्षता39 को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। सही संपादन को सत्यापित करने के लिए सम्मिलन साइट और सेंगर अनुक्रमण को बढ़ाने के लिए पीसीआर करें।
  20. प्रोटीन के स्तर के विश्लेषण के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति परिवर्तनों की अनुमति देने के लिए इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिकाओं को 40-48 घंटे के लिए कल्चर करें, और तालिका 7 में अभिकर्मकों का उपयोग करके फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।

Representative Results

टेट्रासाइक्लिन-सक्षम, स्व-साइलेंसिंग एडेनोवायरल हेल्पर के उपयोग के साथ आरएएवी 6 के उत्पादन के परिणामस्वरूप औसतन सेल कल्चर माध्यम के 4 x10 10 जीसी / एमएल का उत्पादन हुआ, इस प्रकार एक मानक, हेल्पर-मुक्त ट्रिपल अभिकर्मक का उपयोग करके उत्पादन को 30-40 गुना (चित्रा 2) से बेहतर प्रदर्शन किया गया।

रीसस मकाक बी कोशिकाओं के वैकल्पिक शुद्धिकरण के परिणामस्वरूप सीडी 3 + टी कोशिकाओं और सीडी 14 + और / या सीडी 16 + माइलॉयड कोशिकाओं के विशाल बहुमत का उन्मूलन हुआ, जिसमें 80% -95% सीडी 20 + बी कोशिकाओं की शुद्धता नियमित रूप से प्राप्त की जा रही थी (चित्रा 3)। मुराइन बी कोशिकाओं7 में हमारे पिछले डिजाइनों के आधार पर, हमने रीसस मकाक बी कोशिकाओं की बी सेल रिसेप्टर विशिष्टता को संपादित करने के लिए एक विधि विकसित की, जबकि साथ ही साथ उनके निरंतर क्षेत्र के विघटन के माध्यम से अंतर्जात एंटीबॉडी प्रकाश श्रृंखलाओं को हटाकर बी कोशिकाओं के विशाल बहुमत में एलील बहिष्करण बनाए रखा। हमने अंतिम आईजीएचजे जीन और रीसस मकाक बी कोशिकाओं के ईएन्हांसर के बीच आईजीएच लोकस में डालने के लिए एक प्रमोटर-लेस एचडीआरटी का निर्माण किया (चित्रा 4)। यह निर्माण परिपक्व बी कोशिकाओं में स्वाभाविक रूप से पुनर्व्यवस्थित अपस्ट्रीम वीडीजे क्षेत्र के अंतर्जात वीएच प्रमोटर का उपयोग करता है और इस प्रकार, एपिसोमल एएवी जीनोम द्वारा व्यक्त नहीं किया जाता है। इसके अलावा, इस निर्माण को सेल की सतह पर व्यक्त करने के लिए डाउनस्ट्रीम एंटीबॉडी भारी श्रृंखला निरंतर क्षेत्रों में स्प्लिसिंग की आवश्यकता होती है। इसलिए, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा दिखाए गए सेल की सतह पर विशिष्ट एंटीजन बाइंडिंग सही लक्ष्य लोकस एकीकरण को इंगित करती है और यह कि सम्मिलित अनुक्रम कार्यात्मक है।

हमने इस तरह के एक निर्माण एन्कोडिंग एंटीबॉडी एबी 1485, रीसस मकाक-व्युत्पन्न एंटी-एचआईवी बीएनएबी40 को आरएएवी 6 में पैक किया और इसका उपयोग सक्रिय प्राथमिक रीसस मकाक स्प्लेनोसाइट या पीबीएमसी संस्कृतियों को संपादित करने के लिए किया, जैसा कि ऊपर वर्णित है (चित्रा 5 ए)। प्रोटोकॉल ने उच्च सेल व्यवहार्यता (~ 90%) को बनाए रखा, जबकि साथ ही साथ ~ 80% बी कोशिकाओं में प्रकाश श्रृंखला अभिव्यक्ति को हटा दिया। अधिकांश बी कोशिकाओं ने अभी भी आइसोटाइप आईजीएम (चित्रा 5 बी) व्यक्त किया है। AB1485 HDRT को एन्कोडिंग करने वाले rAAV6 के अलावा, बी कोशिकाओं के 16% -21% में जीन संपादन और AB1485 सतह अभिव्यक्ति हुई (चित्रा 5A), हालांकि असंपादित B कोशिकाओं की तुलना में एंटीबॉडी श्रृंखलाओं के लिए कम प्रतिदीप्ति तीव्रता पर (चित्रा 5A दाएं पैनल, चित्रा 5C)। यह एंटीजन दाग और फ्लो साइटोमेट्री में सतह बीसीआर का पता लगाने के लिए उपयोग किए जाने वाले मोनोक्लोनल के बीच एपिटोप प्रतियोगिता का परिणाम हो सकता है, साथ ही एचडीआरटी की पॉलीसिस्ट्रोनिक प्रकृति और कम कुशल स्प्लिसिंग के कारण वास्तविक कम प्रोटीन अभिव्यक्ति भी हो सकती है। आरएएवी 6 एचडीआरटी के साथ 1% डीएमएसओ और विस्तारित, केंद्रित ऊष्मायन के अलावा आम तौर पर संपादन दक्षता में वृद्धि हुई (चित्रा 6 ए-सी)। इस विशिष्ट विधि का उपयोग करके, आमतौर पर 5% -20%, और 40% तक, संपादन दक्षता व्यक्तिगत रीसस मकाक (चित्रा 5 ए, चित्रा 6 ए-ई) और आरएएवी 6 एचडीआरटी बैच (चित्रा 6 ई) की गुणवत्ता के आधार पर प्राप्त की जाती है। कुल मिलाकर, हम कुशल आरएएवी 6 उत्पादन के साथ-साथ रीसस मकाक बी कोशिकाओं की संस्कृति, शुद्धिकरण और जीनसिंग के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

अभिकर्मकों आयतन भंडार अंतिम एकाग्रता
डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज 500 mL 1 x ~ 88.5%
एफसीएस, गर्मी-निष्क्रिय 50 mL 1 x ~ 8.85%
एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक 5 mL 100 x 1 x
ग्लूटामाइन 5 mL 200 mM 2 mM
सोडियम पाइरूवेट 5 mL 100 mM 1 mM

तालिका 1: 293 AAV सेल संस्कृति माध्यम।

अभिकर्मकों आयतन भंडार अंतिम एकाग्रता
डीएमईएम, उच्च ग्लूकोज 500 mL 1 x ~ 95.2%
एफसीएस, गर्मी-निष्क्रिय 10 mL 1 x ~ 1.9%
एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक 5 mL 100 x 1 x
ग्लूटामाइन 5 mL 200 mM 2 mM
सोडियम पाइरूवेट 5 mL 100 mM 1 mM

तालिका 2: 293 AAV सेल उत्पादन माध्यम।

तनुकरण श्रृंखला नमूने की मात्रा (μL) डिल्यूएंट और वॉल्यूम कमजोर पड़ने का कारक कुल कमजोर पड़ना संदर्भ AAV6
GC/mL
कमजोर पड़ना 1 4.1 x 10 11 GC/mL पर 2 μL नमूना याAAV संदर्भ मानक 18 μL DNAseI बफर और एंजाइम 10 x 10 x 4.1 x 1010
कमजोर पड़ना 2 15 μL Dil. 1 60 μL H2O 5 x 50 x 8.2 x 109
कमजोर पड़ना 3 20 μL Dil. 2 80 μL H2O 5 x 250 x 1.6 x 109
कमजोर पड़ना 4 20 μL Dil. 3 80 μL H2O 5 x 1250 x 3.3 x 108
कमजोर पड़ना 5 20 μL Dil. 4 80 μL H2O 5 x 6250x 6.6 x 107
कमजोर पड़ना 6 20 μL Dil. 5 80 μL H2O 5 x 31250 x 1.3 x 107
कमजोर पड़ने 7 20 μL Dil. 6 80 μL H2O 5 x 156250 x 2.6 x 106
कमजोर पड़ना 8 20 μL Dil. 6 80 μL H2O 5 x 781250 x 5.24 x 105
कमजोर पड़ना 9 20 μL Dil. 7 80 μL H2O 5 x 3906250 x 1.05 x 105

तालिका 3: क्यूपीसीआर तनुकरण तालिका।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) आयतन भंडार अंतिम एकाग्रता
RPMI-1640 420 mL 1 x 84%
एफसीएस, गर्मी-निष्क्रिय 50 mL 1 x 10%
एंटीबायोटिक / एंटीमाइकोटिक 5 mL 100 x 1 x
ग्लूटामाइन 5 mL 200 mM 2 mM
सोडियम पाइरूवेट 5 mL 100 mM 1 mM
HEPES 5 mL 1 M 10 mM
2-बी-मर्कैप्टो-इथेनॉल 550 μL 55 mM 55 μM
गैर-आवश्यक अमीनो एसिड 5 mL 100 x 1 x
इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम 5 mL 100 x 1 x

तालिका 4: बी सेल संस्कृति माध्यम।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) तनूकरण भंडार अंतिम एकाग्रता
MegaCD40L 1:1000 100 μg/mL 100 ng/
CpG ODN 1:300 1 mg/mL 3.33 μg/mL
मानव BAFF 1:1000 40 μg/mL 40 ng/mL
मानव आईएल -2 1:1000 50 μg/mL 50 ng/
मानव आईएल -10 1:1000 50 μg/mL 50 ng/

तालिका 5: बी सेल उत्तेजक।

रोग-प्रतिकारक क्लोन तनूकरण अंतिम शंख।
मानव-विरोधी CD3 FN-18 1:40 2.5 μg/mL
मानव-विरोधी CD8a RPA-T8 1:200 2.5 μg/mL
मानव-विरोधी CD14 M5E2 1:200 2.5 μg/mL
मानव-विरोधी CD16 3G8 1:200 2.5 μg/mL
मानव-विरोधी CD33 AC104.3E3 1:50 1 परीक्षण
मानव-विरोधी CD64 10.1 1:800 0.625 μg/mL
मानव-विरोधी CD66 TET2 1:11 1 परीक्षण
मानव-विरोधी CD89 A59 1:800 0.625 μg/mL

तालिका 6: गैर-बी कोशिकाओं की वैकल्पिक कमी के लिए एंटीबॉडी।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) प्रकार/क्लोन काम कमजोर पड़ना/एकाग्रता
एंटी-ह्यूमन सीडी 14 एलेक्साफ्लोर 647 M5E2 1:50
एंटी-ह्यूमन सीडी 16 एलेक्साफ्लोर 700 3G8 1:50
एंटी-ह्यूमन CD20 PECy7 2H7 1:50
एंटी-ह्यूमन सीडी 3 पीई SP34-2 1:50
ज़ोंबी-एनआईआर - 1:500
एंटी-ह्यूमन एचएलए-डीआर बीवी 605 L243 1:200
मानव विरोधी आईजी लाइट चेन लैम्ब्डा एपीसी MHL-38 1:50
मानव विरोधी कप्पा लाइट चेन एफआईटीसी पॉलीक्लोनल 1:500
एंटी-ह्यूमन आईजीएम बीवी 421 MHM-88 1:50
आरसी 1 एंटीजन, यादृच्छिक रूप से बायोटिनिलेटेड - 5 μg/mL
Streptavidin-PE - 1:500

तालिका 7: विश्लेषण के लिए साइटोमेट्रिक अभिकर्मकों का प्रवाह।

Figure 1
चित्रा 1: आरएएवी 6 उत्पादन और प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं के जीन संपादन का योजनाबद्ध अवलोकन। प्रोटोकॉल को आरएएवी 6 उत्पादन (चरण 1) और रीसस मकाक बी कोशिकाओं (चरण 2-5) के जीन संपादन में विभाजित किया गया है, जिसमें गैर-बी कोशिकाओं की कमी के लिए एक वैकल्पिक कदम (चरण 4) शामिल है। प्रोटोकॉल में चरणों को लाल घेरे के साथ इंगित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: उच्च rAAV6 एक स्व-साइलेंसिंग एडेनोवायरल हेल्पर का उपयोग करके पैदावार देता है। rAAV6 का उत्पादन यहां वर्णित विधियों (pAAV अभिकर्मक [TF] + सेल्फ-साइलेंसिंग हेल्पर RepCap6, सेल्फ-साइलेंसिंग एडेनोवायरल हेल्पर) या pAAV, pHelper और pRepCap6 (pRC6) के विशिष्ट हेल्पर-मुक्त ट्रिपल अभिकर्मक का उपयोग करके किया गया था। आरएएवी 6 को केवल सेल सुपरनैटेंट से शुद्ध किया गया था। स्व-साइलेंसिंग एडेनोवायरल हेल्पर वैक्टर का उपयोग करने वाली विधियों ने क्यूपीसीआर द्वारा 30-40 गुना अधिक आरएएवी टिटर का उत्पादन किया, जैसा कि ऊपर वर्णित है। प्रत्येक बिंदु 2 से 20 स्वतंत्र प्रयोगों से विभिन्न पीएवी संरचनाओं का उपयोग करके एक व्यक्तिगत आरएएवी उत्पादन का प्रतिनिधित्व करता है। औसत ± एसईएम प्लॉट किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: गैर-बी कोशिकाओं की नकारात्मक कमी से बी सेल संवर्धन। रीसस मकाक बी कोशिकाओं को वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके पीबीएमसी से समृद्ध किया गया और 90% शुद्धता तक समृद्ध किया गया। संवर्धन के बाद पूर्व-संवर्धन इनपुट और आउटपुट दिखाया गया है। लाइव, सिंगल पीबीएमसी पर गेटेड। पांच स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: रीसस मकाक बी कोशिकाओं के बी सेल रिसेप्टर विशिष्टता को संपादित करने के लिए उपयोग की जाने वाली लक्ष्यीकरण रणनीति। आरएएवी 6 का निर्माण एचडीआरटी से युक्त किया गया था। एचडीआरटी में 266 बीपी 5 'होमोलॉजी आर्म होता है, इसके बाद रीसस मकाक आईजीएचएम एक्सॉन 1 स्प्लिस स्वीकर्ता का 111 बीपी होता है, फिर एक जीएसजी-लिंकर होता है, जिसमें थेसिया एसिग्ना वायरस सेल्फ-क्लीवर 2 ए पेप्टाइड सीक्वेंस (टी 2 ए) होता है, इसके बाद एक लीडर सीक्वेंस और रीसस मकाक एंटीबॉडी एबी 1485 की पूरी प्रकाश श्रृंखला रीसस मकाक आईजीएलसी 1 के रूप में होती है। इसके बाद एक फुरिन क्लीवेज साइट, एक जीएसजी लिंकर और एक पोर्सिन टेस्कोवायरस सेल्फ-क्विविंग 2 ए पेप्टाइड अनुक्रम (फुरिन-पी 2 ए) है, इसके बाद एक और लीडर अनुक्रम और एबी 1485 भारी श्रृंखला चर है, इसके बाद रीसस मकाक आईजीएचजे 4 स्प्लिस डोनर अनुक्रम का 52 बीपी है, ताकि डाउनस्ट्रीम एंटीबॉडी भारी श्रृंखला स्थिर क्षेत्रों में स्प्लिसिंग की अनुमति मिल सके, और एक 514 बीपी होमोलॉजी आर्म। इस निर्माण को एसजीआरएनए लक्ष्य अनुक्रम GAGATGCCAGAGACAACCAGAGAGAGAGAACCAG का उपयोग करके अंतिम IGHJ जीन और Esenar के बीच IGH लोकस में लक्षित किया गया था। दोनों होमोलॉजी आर्म्स को इस एसजीआरएनए के कट साइट पर समाप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, इस प्रकार लक्ष्य अनुक्रम को हटा दिया गया और इष्टतम एकीकरण क्षमता की अनुमति दी गई। इसके साथ ही, एलील बहिष्करण और एकल बी सेल रिसेप्टर की अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए, हमने लक्ष्य अनुक्रम सीटीजीजीसीएजीजीटीजीसीटीटीसीटीसीसीसी का उपयोग करके लक्ष्य अनुक्रम जीजीसीजीजीएजीएजीएसीएजीएजीएजीसी और आईजीएलसी 7 एस के साथ रीसस मकाक आईजीकेसी को लक्षित करने वाले एसजीआरएनए का उपयोग करके अंतर्जात प्रकाश श्रृंखलाओं को हटा दिया। एचडीआरटी में इस एसजीआरएनए द्वारा आईजीएलसी 1 अनुक्रम की दरार को रोकने वाले मूक उत्परिवर्तन शामिल थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं का जीन संपादन। (ए) एक ही रीसस मकाक से प्राथमिक स्प्लेनोसाइट्स (शीर्ष पैनल) या पीबीएमसी (निचला पैनल) को गैर-बी कोशिकाओं की कमी के बिना सुसंस्कृत किया गया था और ऊपर वर्णित के रूप में संपादित किया गया था। लक्ष्यीकरण रणनीति चित्र 4 में दिखाए गए अनुसार थी। इलेक्ट्रोपोरेशन के दो दिन बाद, कोशिकाओं को काटा गया और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए सतह से दाग दिया गया। बाएं कॉलम को सिंगलेट कोशिकाओं पर गेट किया गया था, और अन्य कॉलम को तब गेट किया गया था, जैसा कि शीर्ष पंक्ति में इंगित किया गया है। कोशिकाओं की व्यवहार्यता, बी कोशिकाओं की शुद्धता, प्रकाश श्रृंखलाओं की विलोपन दक्षता, और विशिष्ट एंटीजन आरसी 1 41 के साथ धुंधला करके एबी1485 की नॉक-इन दक्षता अनुपचारित, आरएनपी ट्रांसक्रिप्टेड, या आरएनपी ट्रांसक्रिप्टेड + आरएएवी 6 ट्रांसड्यूस्ड नमूने (एमओआई = 5 x 105) में इंगित की जाती है। विभिन्न रीसस मकाक से कोशिकाओं के साथ छह स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि। (बी) सुसंस्कृत रीसस मकाक बी सेल नियंत्रण पर आईजीएम अभिव्यक्ति या संपादन के बाद और (सी) बी कोशिकाओं पर आईजीएम की ज्यामितीय माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता (जीएमएफआई) जिन्होंने आईजीएलसी और आईजीकेसी लक्ष्यीकरण (असंपादित) या बी कोशिकाओं के कारण आईजी अभिव्यक्ति नहीं खोई है जो अपेक्षित एंटीजन (संपादित) को बांधते हैं। लाल बिंदु सुसंस्कृत असंक्रमित नियंत्रण बी कोशिकाओं के जीएमएफआई को इंगित करता है। युग्मित टी-टेस्ट में पी < 0.0001 इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्र 6: प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं में जीन संपादन दक्षता पर विभिन्न दाता एनएचपी के बीच DMSO, RAAV6 HDRT, rAAV बैच गुणवत्ता और प्रजनन क्षमता के साथ DM इनक्यूबेशन SO के प्रभाव, RAAV6 HDRT, rAAV बैच की गुणवत्ता, और प्रजनन क्षमता। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद, 5 x 105 कोशिकाओं को 1% डीएमएसओ के साथ या उसके बिना माध्यम में संवर्धित किया गया और 5 x 10 5 के एमओआई पर आरएएवी 6 एचडीआरटी युक्त माध्यम के50 μL में 2 घंटे या 5 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। कोशिकाओं का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इलेक्ट्रोपोरेशन के 2 दिन बाद किया गया था, जैसा कि चित्रा 5 में है। चार स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधि। (बी) चार स्वतंत्र प्रयोगों में (ए) का परिमाणीकरण। डॉट्स 1,350 वी, 10-20 एमएस, और 1 पल्स इलेक्ट्रोपोरेशन अवधि और डीएमएसओ सांद्रता 0.75% -1.25% तक की अभिकर्मक सेटिंग्स के साथ तकनीकी प्रतिकृति का संकेत देते हैं। (C) (B) से संपादन दक्षता में औसत गुना परिवर्तन। * मान-व्हिटनी यू परीक्षण में पी > 0.05। (डी) कम दक्षता वाले वाणिज्यिक आरएएवी 6 बैच का उपयोग करके विभिन्न मकाक के साथ स्वतंत्र प्रयोगों पर संपादन क्षमता। (ई) आरएएवी 6 के दो अलग-अलग वाणिज्यिक बैचों का उपयोग करके संपादन दक्षता जिसमें एक ही प्रयोग में दो अलग-अलग एनएचपी के बी सेल में एक ही निर्माण पैक किया गया था। डॉट्स 1,350 वी, 10-20 एमएस और 1 पल्स इलेक्ट्रोपोरेशन की अभिकर्मक सेटिंग्स के साथ तकनीकी प्रतिकृति का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एचडीआरटी के रूप में आरएएवी 6 के उच्च पैदावार और टिटर्स उत्पन्न करने के लिए एक तेज और कुशल विधि प्रदान करते हैं और विट्रो में प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक जीन-संपादित करने के लिए नए तरीके प्रदान करते हैं।

आरएएवी 6 उत्पादन प्रोटोकॉल तुलनात्मक रूप से सरल और तेज़ है, जो अत्यधिक श्रम के बिना एक साथ कई अलग-अलग संरचनाओं के उत्पादन और परीक्षण की अनुमति देता है। यदि वांछित हो, तो आरएएवी 6 को बफर एक्सचेंज और एकाग्रता से पहले आयोडिक्सानोल ग्रेडिएंट अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन34 या जलीय दो चरण विभाजनजैसे स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके आगे शुद्ध किया जा सकता है।

यद्यपि इसने समग्र उपज को कम कर दिया, हमने सेल गोली से शुद्धिकरण के बजाय आरएएवी 6 शुद्धिकरण के लिए केवल सीरम-कम सेल कल्चर माध्यम का उपयोग करने का विकल्प चुना, क्योंकि आरएएवी 6 का अधिकांश हिस्सा मध्यम36 में जारी किया जाता है, और सेल गोली से शुद्धिकरण अधिक लागत और श्रम जोड़ता है। स्व-निष्क्रिय एडेनोवायरल हेल्पर के उपयोग ने औसतन 30-40 गुना पैदावार में वृद्धि की, जिससे एकल 15 सेमी डिश में एएवी 6 में पैक किए गए निर्माणों के परीक्षण की अनुमति मिली। यद्यपि हमारी शुद्धिकरण विधि बुनियादी है, इस विधि का उपयोग करके, हम विभिन्न सेल लाइनों या अन्य प्राथमिक कोशिकाओं (डेटा नहीं दिखाया गया) का उपयोग करके पारगमन के बाद जीन संपादन दक्षता या सेल व्यवहार्यता में अपेक्षाकृत कम बैच-टू-बैच भिन्नता प्राप्त करते हैं।

हमने अवांछित आबादी की नकारात्मक कमी का उपयोग करके अनछुए प्राथमिक बी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक रीसस मकाक बी सेल शुद्धिकरण प्रोटोकॉल विकसित किया। हालांकि इन कोशिकाओं को जीन संपादन के लिए आवश्यक नहीं है, यह इस या अन्य अनुप्रयोगों के लिए प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं की अपेक्षाकृत शुद्ध आबादी प्राप्त करने का एक तरीका प्रदान करता है, यदि अन्य सेल प्रकार प्रयोगात्मक लक्ष्यों में हस्तक्षेप करते हैं। हालांकि, शुद्धता कम समग्र बी सेल पैदावार की कीमत पर आती है। विशेष रूप से, समृद्ध और अप्रकाशित बी सेल संस्कृतियों दोनों के लिए, प्रारंभिक पीबीएमसी या स्प्लेनोसाइट तैयारी में बी कोशिकाओं का अंश महत्वपूर्ण है। विशेष रूप से पीबीएमसी के लिए, हम प्रयोगों के लिए बी कोशिकाओं की उच्च संख्या प्राप्त करने के लिए परिधीय रक्त में बी कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत वाले व्यक्तियों के लिए विभिन्न मकाक की जांच करने की सलाह देते हैं, क्योंकि यह मान व्यक्तियों के बीच नाटकीय रूप से भिन्न होसकता है। पीबीएमसी नियमित रक्तस्राव या ल्यूकाफेरेसिस42 द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

जीन संपादन प्रोटोकॉल कुशल जीन संपादन की ओर जाता है, आमतौर पर नॉक-आउट के 60% -80% और नॉक-इन बी कोशिकाओं के 5% -20% के बीच, हालांकि हमने 90% बीसीआर नॉक-आउट और 40% बीसीआर नॉक-इन बी कोशिकाओं (चित्रा 5 और चित्रा 6) तक हासिल किया है।

रीसस मकाक बी कोशिकाओं के कुशल संपादन के लिए प्रमुख पैरामीटर एसजीआरएनए की काटने की दक्षता, इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर, एमओआई और आरएएवी 6 तैयारी की गुणवत्ता हैं। एचडीआरटी के इष्टतम संपादन और डिजाइन की अनुमति देने के लिए उम्मीदवार एसजीआरएनए की काटने की क्षमता को अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। यहां प्रस्तुत इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर संपादित बी कोशिकाओं के उच्चतम प्रतिशत के बजाय संपादित बी कोशिकाओं की अधिकतम कुल संख्या प्राप्त करने के लिए व्यवहार्यता के साथ दक्षता को संतुलित करते हैं। यदि संपादित कोशिकाओं के उच्च प्रतिशत की आवश्यकता होती है, तो बढ़े हुए वोल्टेज (1,750 वी तक) या परिवर्तित पल्स लंबाई (10-30 एमएस) की सिफारिश की जाती है, हालांकि अधिक कोशिका मृत्यु देखी जा सकती है। हमने एक ही व्यक्ति से पीबीएमसी से बी कोशिकाओं की तुलना में स्प्लेनिक बी कोशिकाओं में थोड़ी अधिक संपादन क्षमता भी देखी (चित्रा 5); हालाँकि, इसका अंतर्निहित कारण वर्तमान में अज्ञात है।

हमने पाया कि इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद 1% डीएमएसओ को जोड़ने से सेल व्यवहार्यता (चित्रा 6 ए-सी) को प्रभावित किए बिना रीसस मकाक बी कोशिकाओं में जीन संपादन दक्षता में ~40% की वृद्धि हुई, जो अन्य कोशिकाओं में रिपोर्ट के अनुरूप है। हालांकि, 1% डीएमएसओ में विस्तारित संस्कृति से बचा जाना चाहिए और सेल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकता है। यदि वांछित हो तो डीएमएसओ को पूरी तरह से छोड़ा जा सकता है।

आरएएवी 6 के साथ कई घंटों तक इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं की संस्कृति उच्च संपादन क्षमता की ओर ले जाती है, शायद आरएएवी 6 द्वारा एचडीआरटी के बेहतर पारगमन के कारण और इस प्रकार, सीएएस 9 सक्रिय होने पर प्रासंगिक समय पर एचडीआरटी की उच्च इंट्रासेल्युलर एकाग्रता के कारण। हमने पाया कि 8 घंटे तक इस तरह से कोशिकाओं की खेती करने से सेल व्यवहार्यता प्रभावित नहीं हुई, लेकिन संपादन क्षमता 5 घंटे से अधिक नाटकीय रूप से नहीं बढ़ी (चित्रा 6)। यदि नॉक-इन के बजाय केवल नॉक-आउट की आवश्यकता है, तो इस चरण को छोड़ा जा सकता है।

अंत में, हम विट्रो में रीसस मकाक बी कोशिकाओं के जीन संपादन और वांछित संरचनाओं के कुशल नॉक-इन के लिए आवश्यक आरएएवी 6 एचडीआरटी के उत्पादन के लिए व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। ये प्रोटोकॉल आरएएवी 6 के रूप में पैक किए गए कई निर्माणों के तेजी से, लागत प्रभावी परीक्षण को सक्षम करते हैं और अधिक प्रासंगिक गैर-मानव प्राइमेट मॉडल में बी सेल थेरेपी की व्यवहार्यता और मापनीयता के प्रीक्लिनिकल परीक्षण को सक्षम करते हैं।

Disclosures

कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किए गए हैं।

Acknowledgments

हम आरसी 1 एंटीजन प्रदान करने के लिए हैरी बी ग्रिस्टिक और पामेला ब्योर्कमैन और महत्वपूर्ण चर्चा के लिए पूरे नुसेनज़वेग और मार्टिन प्रयोगशालाओं को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन अनुदान INV-002777 (M.C.N.) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी एंड इंफेक्शियस डिजीज, नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। (आर.जी. और एम.ए.एम.) एम.सी.एन. एक एचएचएमआई अन्वेषक है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL tube sterile, Dnase, Rnase and purogen free Stellar Scientific T17-125 or similar
10 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4488 or similar
15 cm tissue culture dish Falcon 353025 or similar
15 mL polypropylene conical tybe Falcon 352097 or similar
25 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4489 or similar
250 mL polypropylene conical tybe Corning 430776 or similar
293AAV cell line Cell Biolabs AAV-100
2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x) Gibco 21985-023
48-well tissue culture plate Corning 3548 or similar
5 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4487 or similar
5 mL syringes with Luer-Lok Tip BD 309646 or similar
50 mL polypropylene conical tybe Falcon 352070 or similar
50 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free Corning 4490 or similar
6-well tissue culture plate Falcon 353046 or similar
AAV-6 Packaging System (plasmids) Cell Biolabs VPK-406
AAV6 Reference Materials (full capsids) Charles River RS-AAV6-FL
Accu-jet S Pipette Controller Brand 26350 or similar pipette controller
Antibiotic/Antimycotic 100x Gibco 15260-062
anti-human CD14 AlexaFluor647 Biolegend 301812
anti-human CD14 biotin BioLegend 301826
anti-human CD16 AlexaFluor700 BD Biosciences 557920
anti-human CD16 biotin BioLegend 302004
anti-human CD20 PECy7 Biolegend 302312
anti-human CD3 biotin Thermo Fisher APS0309
anti-human CD3 PE BD Biosciences 552127
anti-human CD33 biotin Miltenyi 130-113-347
anti-human CD64 biotin BioLegend 305004
anti-human CD66 biotin Miltenyi 130-100-143
anti-human CD89 biotin BioLegend 354112
anti-human CD8a biotin BioLegend 301004
anti-human HLA-DR BV605 Biolegend 307640
anti-human Ig light chain lambda APC Biolegend 316610
anti-human IgM BV421 Biolegend 314516
anti-Human Kappa Light Chain FITC Fisher Scientific A18854
Autoclave Steris Amsco Lab 250 or similar
Cell culture CO2 incubator Fisher Scientific 51026331 or similar
Centrifugal Filter Unit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa) Millipore UFC810024
Centrifuge 5920 R Eppendorf EP022628188 or any other, coolable swinging bucket centrifuge with inserts for 96-well plates, 15, 50 and 250 mL size tubes
Chloroform Fisher Scientific C298SK-4
Cpg ODN Invivogen tlrl-2395
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 34869-500ML
DMEM, High Glucose Gibco 11965092
DNaseI (RNase-free) New England Biolabs M0303L
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
Electroporation kit (Neon Transfection System 10 µL) Fisher Scientific MPK1096 or other sizes or 100 uL transfection kit MPK 10096
Electroporation system (Neon Transfection System) Fisher Scientific MPK5000
FCS Hyclone SH30910.03*
Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS) Cytiva 17144002 or similar
Fume Hood Fisher Scientific FH3943810244 or similar
Glutamine 200 mM Gibco 25030-081
Graduated Cylinder 1L Corning 3022-1L or similar
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z375357-1EA or similar
HEPES 1M Gibco 15630-080
HEPES 1M Gibco 15630-080
Hot Plate Magnetic Stirrer Fisher Scientific SP88857200 or similar
Human BAFF Peprotech  310-13
Human BD Fc Block BD 564220
Human IL-10 Peprotech  200-10
Human IL-2 Peprotech  200-02
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Hydrophilic Polyethersulfone Syringe Filters, (Supor membrane), Sterile - 0.2 µm, 25 mm  Pall 4612
Insulin-Transferin-Selenium, 100x Gibco 41400-045
ITR primer forward: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT Integrated DNA Technologies custom
ITR primer reverse: CGGCCTCAGTGAGCGA Integrated DNA Technologies custom
Laminar flow biosafety cabinet The Baker Company SG403A or similar
Large magnetic depletion (LD) Column Miltenyi Biotec 130-042-901
Magentic seperator (MidiMACS separator and multistand) Miltenyi Biotec 130-090-329
Magnetic stir bar Fisher Scientific 14-512-127 or similar
Magnetic streptavidin beads (Streptavidin MicroBeads) Miltenyi Biotec 130-048-101
Maxiprep kit Machery-Nagel 740414.5 or similar
Media Bottles 2L with cap Cole-Parmer UX-34514-26 or similar
MegaCD40L Enzo ALX-522-110-C010
MicroAmp Optical 384-well Reaction Plate Fisher Scientific 4309849
MicroAmp Optical Adhesive Film Fisher Scientific 4311971
Microcentrifuge 5424 R Eppendorf 5404000014 or any other table top centrifuge for 1.5 mL tubes
Microwave oven Panasonic NN-SD987SA or similar
Nikon TMS Inverted Phase Contrast Microscope Nikon TMS or any other Inverted phase-contrast microscope for cell culture
Non-essential amino acids, 100x Gibco 11140-050
Nuclease-free Duplex buffer Integrated DNA Technologies 11-01-03-01
Nuclease-free Water Qiagen 129115
pH meter Mettler Toledo 30019028 or similar
Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 and tips Gilson F167380 or similar set of pipettes and tips
Pluronic F-68 10 % Gibco 24040-032
Polyethylene Glycol 8000 Fisher Scientific BP233-1
Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K Polysciences 23966-100
Precision Balance Mettler Toledo ME4001TE or similar
Pre-Separation Filters (30 µm) Miltenyi Biotec 130-041-407
Pyrex glass beaker 2 L Cole-Parmer UX-34502-13 or similar
Pyrex glass beaker 250 mL Millipore Sigma CLS1000250 or similar
qPCR Instrument Fisher Scientific 4485691 or similar
RC1 antigen randomly biotinylated Bjorkman lab, CalTech in house
RPMI-1640 Gibco 11875-093
S.p. Cas9 Nuclease Integrated DNA Technologies 1081059
Scientific 1203 Water Bath VWR 24118 or any water bath set to  37 °C
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653-5KG
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045-500G
Sodium Pyruvate 100 mM Gibco 11360-070
Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes Thermo Scientific Nalgene  567-0020 
Streptavidin-PE BD Biosciences 554061
SYBR Green Master Mix  Fisher Scientific A25742
Tetracycline-enabled, self-silencing adenoviral vector RepCap6  Oxgene TESSA-RepCap6
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Water Purification System Millipore Sigma ZEQ7000TR or similar
Zombie-NIR Biolegend 423106

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).
  2. Plotkin, S. A. Correlates of protection induced by vaccination. Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).
  3. Brinkmann, V., Heusser, C. H. T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors. Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).
  4. Chernecky, C. C., Berger, B. J. Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).
  5. Balazs, A. B., et al. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).
  6. Greiner, V., et al. CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells. iScience. 12, 369-378 (2019).
  7. Hartweger, H., et al. HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).
  8. Huang, D., et al. Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells. Nature Communications. 11, 5850 (2020).
  9. Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies. Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).
  10. Nahmad, A. D., et al. In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).
  11. Nahmad, A. D., et al. Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion. Nature Communications. 11, 5851 (2020).
  12. Voss, J. E., et al. Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies. eLife. 8, 42995 (2019).
  13. Pesch, T., et al. Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells. Frontiers in Immunology. 10, 2630 (2019).
  14. Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 7, 10934 (2016).
  15. Rogers, G. L., Cannon, P. M. Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).
  16. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  17. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  18. Wu, C. M., et al. Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).
  19. Luo, B., et al. Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration. Cell Death and Disease. 11 (11), 973 (2020).
  20. Laoharawee, K., et al. Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (165), e61855 (2020).
  21. Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells. Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).
  22. Moffett, H. F., et al. B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  23. Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo. Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).
  24. Nishimura, Y., Martin, M. A. Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1. Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).
  25. Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials. Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).
  26. Kreuser, S., et al. Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells. bioRxiv. , (2021).
  27. Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation. Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).
  28. Kim, J. S., et al. Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).
  29. Su, W., et al. Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination. Nature Communications. 13, 1182 (2022).
  30. Endo, Y., et al. Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus. Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).
  31. Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences. Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).
  32. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  35. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  36. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  37. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  38. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12, 686 (2021).
  40. Wang, Z., et al. A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch. eLife. 9, 61991 (2020).
  41. Escolano, A., et al. Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques. Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).
  42. Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).
  43. Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).

Tags

इस महीने जोवे में अंक 192 बी कोशिकाएं जीन संपादन जीनोम इंजीनियरिंग सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9 एडेनो से जुड़े वायरस रीसस मकाक गैर-मानव प्राइमेट सेल थेरेपी
प्राथमिक रीसस मकाक बी कोशिकाओं का जीन संपादन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hartweger, H., Gautam, R.,… More

Hartweger, H., Gautam, R., Nishimura, Y., Schmidt, F., Yao, K. H., Escolano, A., Jankovic, M., Martin, M. A., Nussenzweig, M. C. Gene Editing of Primary Rhesus Macaque B Cells. J. Vis. Exp. (192), e64858, doi:10.3791/64858 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter