Summary
Vi presenterar en metod för odling och genredigering av primära rhesusmakak B-celler med CRISPR/Cas9 och rekombinant adenoassocierat virus serotyp 6 för studier av B-cellsterapier.
Abstract
B-celler och deras avkomma är källorna till starkt uttryckta antikroppar. Deras höga proteinuttrycksförmåga tillsammans med deras överflöd, lättillgänglighet via perifert blod och bekvämlighet för enkla adoptivöverföringar har gjort dem till ett attraktivt mål för genredigeringsmetoder för att uttrycka rekombinanta antikroppar eller andra terapeutiska proteiner. Genredigering av mus- och humana primära B-celler är effektiv, och musmodeller för in vivo-studier har visat lovande resultat, men genomförbarhet och skalbarhet för större djurmodeller har hittills inte visats. Vi utvecklade därför ett protokoll för att redigera rhesusmakaka primära B-celler in vitro för att möjliggöra sådana studier. Vi rapporterar tillstånd för in vitro-odling och genredigering av primära rhesusmakak B-celler från mononukleära celler eller splenocyter i perifert blod med CRISPR/Cas9. För att uppnå den riktade integrationen av stora (<4,5 kb) kassetter inkluderades ett snabbt och effektivt protokoll för beredning av rekombinant adenoassocierat virus serotyp 6 som en homologiriktad reparationsmall med hjälp av en tetracyklinaktiverad självdämpande adenoviral hjälpvektor. Dessa protokoll möjliggör studier av prospektiva B-cellterapier i rhesusmakaker.
Introduction
B-celler är grunden för humoral immunitet. Vid aktivering av kognatantigen och sekundära signaler ger naiva B-celler upphov till germinalcenter B-celler, minnes-B-celler och plasmaceller1. Den senare är källan till de utsöndrade antikropparna som förmedlar skyddsfunktionerna hos de flesta tillgängliga vacciner2. Plasmaceller har beskrivits som antikroppsfabriker eftersom de utsöndrar stora mängder antikroppar i serum-ca 2 ng / dag / cell3, vilket uppgår till 7-16 g / L serum, vilket gör antikroppar till ett av de tre vanligaste proteinerna i serum4. B-celler är rikliga i blod och kan därför lätt erhållas och infunderas tillbaka till en individ.
Dessa egenskaper har gjort B-celler till ett mål för cellterapiinsatser för att genredigera B-cellreceptorn (BCR) och uttrycka brett neutraliserande antikroppar (bNAbs) mot humant immunbristvirus (HIV) 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 och andra proteiner 16, 17,18,19,20,21. Sådana tillvägagångssätt har visat potential i många musstudier in vivo 7,8,10,11,16,22. Flera hinder måste dock fortfarande övervinnas för klinisk översättning 9,15,23, bland annat säkerhet, varaktighet och storlek på den terapeutiska effekten, samt skalning till större djur som icke-mänskliga primater (NHP). Faktum är att NHP, och i synnerhet rhesusmakaker, som har en lång historia inom antikropps- och HIV-forskning24,25, är den mest lämpliga modellen för att testa dessa parametrar.
Här utvecklade vi protokoll som gör det möjligt att ta itu med dessa problem. Hittills har få studier försökt odla rhesusmakak B-celler ex vivo, och endast positivt urval med CD20 har rapporterats för rening av rhesusmakak B-celler26,27,28. Vi har upprättat ett protokoll för isolering av orörda rhesusmakak B-celler genom negativ utarmning av andra celltyper. Vidare definieras odlingsbetingelser för riktad genredigering av rhesusmakak B-celler. Detta protokoll beskriver användningen av CRISPR / Cas9-ribonukleoproteiner (RNP) och rekombinant adenoassocierat virus serotyp 6 (rAAV6) som homologiriktad reparationsmall (HDRT) för att genredigera odlade rhesusmakak B-celler. Med hjälp av detta protokoll uppnåddes redigeringseffektivitet på upp till 40% med stora (~ 1,5 kb) skär. Vi presenterar också en snabb och kostnadseffektiv metod för att producera rAAV6 med hjälp av en tetracyklinaktiverad, självdämpande adenoviral hjälpare29 för att möjliggöra snabb testning av HDRT i detta format. Tillsammans beskriver dessa protokoll ett effektivt arbetsflöde för genredigering av rhesusmakak B-celler (figur 1), vilket möjliggör utvärdering av B-cellterapier i en NHP-modell.
För att starta experimenten kan givarmaterial beställas från kommersiella källor eller erhållas genom flebotomier eller splenektomi. I denna studie utfördes flebotomier och blodsamlingar som tidigare beskrivits30 med hjälp av antikoagulanten EDTA. För att erhålla mjälte, primära rhesusmakak B-celler utfördes partiella (25% -50%) eller totala splenektomier med hjälp av tekniker som rapporterats tidigare31. Djuren fastade över natten före operationen. Kortfattat, under operationen, klipptes buken och förbereddes med alternerande scrubs av klorhexidin och 70% isopropylalkohol tre gånger. Ett snitt (5-10 cm) gjordes i buken för att identifiera och isolera mjälten. Mjältens vaskulatur ligerades med antingen suturer eller kärlklämmor. Snittet stängdes i två lager med 4-0 PDS polydioxanon suturer. Splenektomi utfördes en enda gång för ett enskilt djur. Encellssuspensioner framställdes från makakmjälte genom maceration genom cellsilar. Mononukleära celler från blod- och mjältcellssuspensioner framställdes med användning av densitetsgradientcentrifugering och lagrades i flytande kväve.
Protocol
Alla djurförsök och experiment utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. En sammanfattning av följande protokoll presenteras i figur 1. Manliga och kvinnliga rhesusmakaker (Macaca mulatta) av indiskt genetiskt ursprung i åldern 2-8 år hölls och vårdades i enlighet med riktlinjerna från kommittén för vård och användning av försöksdjur i en biosäkerhetsnivå 2-anläggning.
VARNING: Alla experiment utfördes i enlighet med de universella försiktighetsåtgärderna för blodburna patogener, med sterila/aseptiska tekniker och korrekt biosäkerhetsnivå 2-utrustning i laminära flödeshuvar.
1. rAAV6 produktion
- Bered reagenserna för rAAV6-produktion.
- Designa och klona den homologiriktade reparationsmallen mellan de inverterade terminalupprepningarna (ITR) av AAV2 i vektorn pAAV med hjälp av standardtekniker. Se till att homologiarmarna är minst ~ 250 bp på vardera sidan, men så lite som 60 bp kan räcka, även om längre homologiarmar föredras om konstruktionsdesignen tillåter det. Om målsekvenser av någon av de använda sgRNA finns i HDRT, ta bort dem med tysta mutationer, som är mest effektiva i protospacer intilliggande motiv eller fröregion på målplatsen.
OBS: Gensyntes kombinerad med Gibson-montering för effektiv kloning32 kan utföras. Förbered en Maxiprep av en korrekt klon för transfektion. För sgRNA-design rekommenderas CHOPCHOP33, och en lista med fler verktyg finns på https://zlab.bio/guide-design-resources. Den maximala förpackningskapaciteten för AAV inklusive ITR är ~ 4,7 kb. AAV6 är den vanligaste serotypen för redigering av hematopoetiska celler, särskilt B-celler9. Andra serotyper av AAV för genredigering av rhesusmakak B-celler har inte testats, men AAV28 och AAV-DJ10,11 har använts i musstudier. - Förbered 293AAV-odlingsmedium och produktionsmedium enligt tabell 1 och tabell 2. Sterilfilter genom en 0,2 μm polyetersulfon (PES) membranfilterenhet. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered 1x polyetylenimin (PEI) lösning (1 mg / ml, 100 ml).
- I en 250 ml glasbägare, värm ~ 70 mlH2Oi en mikrovågsugn i ~ 30 s och tillsätt sedan 100 mg PEI. Tillsätt en magnetomrörare och rör om tills PEI är mestadels upplöst.
- Justera pH till 7 med 1 M HCl, fyll sedan på upp till 100 ml med H2O, vänta 10 minuter, kontrollera pH igen och justera vid behov.
- Sterilfiltrera PEI-lösningen genom en 0,2 μm PES-membranfilterenhet, alikvot och lagra −20 °C. Efter upptining kan lösningen förvaras vid 4 °C i upp till 2 månader.
- Förbered 5x polyetylenglykol (PEG) / NaCl-lösning.
- Väg upp 400 g PEG 8 000 och 24 g NaCl.
- Tillsätt en magnetomrörare till en 2 L glasbägare, tillsätt den vägda PEG 8,000 och NaCl och skölj med ~ 550 ml avjoniserat vatten.
- Rör om med värme och koka upp eller 80-90 °C tills det är helt upplöst.
- Justera pH till ~ 7,4 med 1 M NaOH, justera sedan volymen till 1 L med en mätcylinder och överför den till en 2 L glasflaska med magnetomröraren.
- Autoklav flaskan, magnetomröraren och lösningen i vattenbad i 30 min vid 121 °C.
- Efter autoklavering, kyla lösningen i ett kallt rum under omrörning med magnetomröraren för att förhindra separation i olika faser. Alikvot vid behov och förvaras vid 4 °C.
- Förbered formuleringsbufferten.
- Blanda 500 ml DPBS med 50 μL 10% Pluronic F-68. Sterilfiltrera genom en 0,2 μm PES-membranfilterenhet och förvara vid rumstemperatur (RT).
- Designa och klona den homologiriktade reparationsmallen mellan de inverterade terminalupprepningarna (ITR) av AAV2 i vektorn pAAV med hjälp av standardtekniker. Se till att homologiarmarna är minst ~ 250 bp på vardera sidan, men så lite som 60 bp kan räcka, även om längre homologiarmar föredras om konstruktionsdesignen tillåter det. Om målsekvenser av någon av de använda sgRNA finns i HDRT, ta bort dem med tysta mutationer, som är mest effektiva i protospacer intilliggande motiv eller fröregion på målplatsen.
- Cellodling, transfektion och transduktion för rAAV6-produktion
- Tina, odla och frysa 293AAV-celler enligt tillverkarens beskrivning med användning av ovanstående 293AAV-odlingsmedium och trypsin-EDTA för delning. Det rekommenderas att frysa några tidiga passager och använda cellerna för AAV-produktion innan de når passage 40.
- För rAAV6-produktion, frö fyra 15 cm cellodlingsrätter med 5 x 106 celler i 30 ml vardera. Cellerna är redo för transfektion, vanligtvis 1-2 dagar efter sådd, när de når 80% -90% sammanflöde.
- Tina en Maxiprep av pAAV-plasmid som innehåller HDRT som ska förpackas i AAV6. Resuspendera 85,6 μg av pAAV-plasmiden i 3 ml rent DMEM-medium.
- Lös 342 μl 1 mg/ml PEI-lösning i 3 ml rent DMEM-medium. Inkubera båda lösningarna i 10 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda båda 3 ml rören i ett rör med ~ 6,4 ml transfektionsblandning och inkubera i 20 minuter vid RT.
- Tina under tiden den tetracyklinaktiverade, självtystande hjälpvektorn RepCap6 från frysen −80 °C i ett 37 °C vattenbad. För att transducera 293AAV-cellerna, lägg till hjälparvektorn vid en infektionsmultiplicitet (MOI) på 25 med användning av medianvävnadskulturens infektiösa dos (TCID 50) och anta 1,15 x10 7 celler / skål; vanligtvis används 2-10 μL per 15 cm maträtt. Gunga och virvla diskarna försiktigt för att fördela.
- Efter inkubationen av transfektionsblandningen, tillsätt 1,6 ml droppvis över var och en av de fyra 15 cm skålarna. Inkubera vid 37 °C och 5 %CO2 över natten.
OBS: Alternativt, om rAAV6-vektorerna av intresse redan är tillgängliga, kan dessa vektorer användas för att tillhandahålla det virala genomet som ska förpackas, vilket förnekar behovet av plasmider med detta system och ger jämförbara rAAV6-titrar. För detta tillvägagångssätt samtransduceras 293AAV-cellerna med den önskade rAAV6 vid en MOI på 50 (baserat på rAAV6-genomkopior [GC] / ml) tillsammans med hjälparvektorn. - Nästa dag, försiktigt aspirera och kassera odlingsmediet och ersätt med 30 ml förvärmt produktionsmedium. Inkubera i ytterligare 96 timmar före skörd. Ingen ytterligare medelförändring rekommenderas för att maximera avkastningen.
- Skörd och rening av den rekombinanta AAV6 från mediet
- Utan att lossa celler från skålen, samla all cellsupernatant i en filterenhet med ett 0,2 μm PES-membran som är minst 50% större än volymen medium som ska filtreras. Filtrera sedan supernatanten.
OBS: Om högre utbyten av rAAV6 önskas kan cellerna skördas och rAAV extraheras från cellpelleten med hjälp av kommersiella kit eller etablerade protokoll34,35. Eftersom AAV6 mestadels utsöndras i mediet36 användes endast supernatant, vilket minskade arbetskraft, kostnad och tid. - Tillsätt 5x PEG / NaCl-lösning till den filtrerade supernatanten vid 25% av den uppsamlade volymen; detta är vanligtvis 30 ml om fyra 15 cm rätter på 30 ml används.
- Blanda väl genom att vända och ned och inkubera sedan över natten vid 4 °C för att fälla ut viruspartiklarna.
OBS: AAV-partiklar är stabila i upp till 2 dagar i denna lösning. - Förkyl en svängskopecentrifug med 250 ml rörinsatser till 4 °C. Bered en 4 ml centrifugalfilterenhet med en 100 kDa cutoff och ett 0,22 μm hydrofilt PES-sprutfilter genom att förbehandla varje membran med 2 ml 10% Pluronic F-68 i minst 1 h vid RT.
- Överför AAV-PEG/NaCl-blandningen till ett 250 ml rör, centrifugera vid 2 500 x g i 1 timme vid 4 °C och avlägsna sedan försiktigt hela supernatanten genom aspiration.
- Återsuspendera den beige till vita viruspelleten genom virvling i 4 ml 1 M HEPES tills den är helt återsuspenderad. Låt det stå i 5 minuter och virvel igen. Resuspendera med en 5 ml serologisk pipett och överför den totala volymen till ett 15 ml rör.
- I en dragskåp, tillsätt en lika stor volym kloroform till virussuspensionen - vanligtvis 4 ml.
- Virvla kraftigt i 2 minuter och centrifugera sedan vid 1 000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Samla det översta lagret (AAV-innehållande supernatant) i ett nytt 50 ml rör och kassera bottenskiktet (kloroform).
VARNING: Kloroformhaltiga lösningar är farligt avfall. Följ institutionella riktlinjer för bortskaffande. - Placera den AAV-innehållande supernatanten under ett dragskåp och låt den återstående kloroformen avdunsta i 30 minuter.
- Tvätta under tiden den förbehandlade centrifugalfilterenheten och sprutfiltret.
- Tillsätt 1,5 ml formuleringsbuffert till den förbehandlade centrifugalfilterenheten. Centrifugera vid 3 500 x g i 10 minuter vid 15 °C i en svängande skoprotor. Upprepa detta steg med 4 ml formuleringsbuffert för att tvätta membranet.
- Skölj sprutfiltret två gånger med 5 ml formuleringsbuffert med en 5 ml spruta.
- Fyll ~ 4 ml AAV-innehållande supernatant från kloroformextraktionen i en 5 ml spruta, fäst det tvättade sprutfiltret och filtrera direkt i centrifugalfilterenheten.
- Centrifugera vid 3 500 x g i 25 minuter vid 15 °C och bekräfta sedan att AAV-lösningen i filtret ligger mellan 50 och 100 μl. Om lösningens volym är >100 μl, fortsätt centrifugeringen.
- Efter avlägsnande av filtratet, tillsätt 4 ml formuleringsbuffert inuti centrifugalfilterenhetens kopp och blanda lösningen jämnt genom pipettering. Centrifugera vid 3 500 x g i 25 minuter vid 15 °C och bekräfta sedan att AAV-lösningen i filtret är mellan 50 och 100 μl. Om lösningens volym är >100 μl, fortsätt centrifugeringen. Upprepa detta steg för ytterligare en tvätt.
- Efter den slutliga centrifugeringen, bekräfta att lösningens volym är 50-70 μL; Om inte, fortsätt att centrifugera. Överför preparatet till ett 1,5 ml rör. Alikvot om så önskas och förvaras vid −80 °C.
- Utan att lossa celler från skålen, samla all cellsupernatant i en filterenhet med ett 0,2 μm PES-membran som är minst 50% större än volymen medium som ska filtreras. Filtrera sedan supernatanten.
- Rekombinant AAV6-titerbestämning med qPCR
QPCR-primrarna anneal i ITR-regionen och bör därför vara lämpliga för alla konstruktioner som klonas till pAAV.- Tina upp en delmängd av det rAAV6 som ska titreras och en delmängd av AAV6-referensmaterialet. Referensmaterialet AAV6 bör vara nära 4 x 1011 GC/ml. Justera i annat fall utspädningarna därefter.
- Utför en DNas I-sammandragning för att avlägsna eventuellt kvarvarande fritt plasmid-DNA i rAAV6-preparatet genom att kombinera 2,0 μL av provet eller AAV6-referensmaterialet med 15,6 μL nukleasfrittH2O, 2,0 μL 10x DNas I-buffert och 0,4 μL DNas I.
- Blanda försiktigt och inkubera i 30 minuter vid 37 °C och överför sedan till is. Detta är utspädning 1 (se tabell 3).
- Bered femfaldiga serieutspädningar med vatten av alla prover och AAV6-referensmaterialet enligt tabell 3 nedan.
- Förbered en SYBR Green qPCR-mastermix. Blanda 4,7 μl nukleasfritt vatten per brunn med 10 μL SYBR Green-masterblandning, 0,15 μL ITR-primer framåt vid 100 μM och 0,15 μL ITR-primer omvänd vid 100 μM.
OBS: Varje prov mäts i två exemplar, med 16 brunnar för referensstandarden, 8 brunnar per prov och 2 brunnar för en kontroll utan mall. Förbered 10% mer mastermix för att ta hänsyn till pipetterfel. - I en optisk reaktionsplatta med 96 eller 384 brunnar fyller du på 15 μl/brunn av SYBR Green qPCR-mastermixen.
- Fyll sedan på 5 μl prover och AAV6-referensmaterial eller nukleasfritt vatten för kontroll utan mall. För referensstandarden AAV6, belastningsutspädning 2 till utspädning 9. För prover, ladda utspädning 5 till utspädning 8. Mät varje utspädning i två exemplar. Undvik bubblor.
- Försegla den laddade plattan med optisk transparent film, centrifugera vid 800 x g i 1 min vid RT och fyll plattan i qPCR-instrumentet med lämplig 96-brunns- eller 384-brunnsinställning.
- Ställ in och kör qPCR-instrumentet med SYBR-detektering med följande cykelförhållanden: 98 °C i 3 minuter, sedan 40 cykler vid 98 °C i 15 sekunder och 58 °C i 30 sekunder, följt av en smältkurva.
- Analysera data med instrumentets programvara med hjälp av AAV6-referensmaterialets koncentration i genomkopior per millimeter (GC/ml) som standardkurva (se tabell 3). Beräkna provets slutliga koncentration genom att multiplicera med utspädningsfaktorn.
- Se till att standardkurvan R2 är nära 1,0, PCR-effektiviteten är 90% -110%, baslinjen har tagits bort, smältkurvan visar en enda topp, C t-värdena ändras i enlighet med utspädningarna och dubbletterna ligger inom 0,5 Ct; Annars utesluter du extremvärden. Förvänta dig avkastning som i figur 2.
2. Förbereda B-cellmedia och stimuli
- Förbered upptiningsmedium: Kombinera RPMI-1640 med 20% FCS. Sterilfilter genom en 0,2 μm PES-membranfilterenhet. Förvaras vid 4 °C.
- Bered B-cellodlingsmedium: Kombinera reagenserna i tabell 4 och sterilfiltrera sedan genom en 0,2 μm PES-membranfilterenhet. Förvaras vid 4 °C.
- Resuspendera vart och ett av B-cellsstimulantia i tabell 5 vid stamkoncentrationer i B-cellodlingsmedium, utom CpG ODN som bör resuspenderas i nukleasfritt vatten. Förvaras vid −80 °C.
- Om du utför icke-B-cellnegativ utarmning (valfritt steg 4), förbered DPBS (inget kalcium, inget magnesium) med 2% FCS (DPBS 2% FCS). Sterilfilter genom en 0,2 μm PES-membranfilterenhet. Förvaras vid 4 °C.
3. Beredning och odling av rhesusmakak B-celler
OBS: Kryokonserverade rhesusmakak PBMC eller splenocyter används för att ställa in cellkulturen30,31.
- Förvärm upptiningsmedium och B-cellodlingsmedier i ett 37 °C vattenbad. Tina B-cellstimulerande medel från tabell 5 på is.
- Förbered ett rör av lämplig storlek som innehåller förvärmt upptiningsmedium. Detta bör helst vara mer än 10 gånger volymen av de tinade cellerna.
- Tina en till två kryovialer av PBMC eller splenocyter åt gången i ett 37 °C vattenbad och dekantera i det förberedda röret med förvärmt medium. Skölj kryorören för att samla alla celler.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 10 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Dessa centrifugeringsinställningar minskar trombocytföroreningen samtidigt som PBMC-utbytet bevaras. Högre hastigheter som 350 x g i 5 minuter kan användas. - Återsuspendera cellerna i 10 ml upptiningsmedium för tvätt.
- Upprepa steg 3.4 och steg 3.5 för totalt tre centrifugeringar för att avlägsna frysmediet. Efter den sista centrifugeringen, suspendera cellerna igen vid uppskattningsvis ~ 5 x 106 celler / ml i B-cellodlingsmedium.
OBS: Ovanstående protokoll kulturer hela PBMC eller splenocytpreparat med kontaminering av andra celler. Om renare B-cellkulturer krävs, om än med signifikant reducerade totala B-cellutbyten, fortsätt med steg 4. Inga skillnader har observerats i redigeringseffektivitet mellan de två metoderna. - Späd vid behov en alikvot på 10 μl celler med B-cellodlingsmedium för räkning. Räkna med hjälp av en hemocytometer och trypanblå färgning, som kombinerar lika stora volymer resuspenderade celler och trypanblå 0,4% lösning.
- Justera cellkoncentrationen till 3 x 106 celler / ml med B-cellodlingsmedium enligt cellantalet. Tillsätt sedan B-cellstimulantia till deras slutliga koncentrationer enligt tabell 5 och blanda.
- Överför cellerna till en lämplig cellodlingsskål. Totalt rekommenderas 0,6 x 10 6-0,7 x 106 celler/cm2. Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2 i 48 timmar ± 2 timmar.
4. Valfri negativ utarmning av icke-B-celler
OBS: Utbyte och renhet beror på ingångsprocenten av B-celler bland PBMC: erna, vilket kan skilja sig drastiskt mellan enskilda rhesusmakaker27. Förvänta dig 80% -95% renhet, 60% effektivitet och 1 x 10 6-1.5 x 106 celler från 1 x 107 PBMC.
- Efter den sista tvättningen (steg 3.6), suspendera cellerna igen vid 1 x 108 celler/ml i DPBS 2% FCS och humant Fc-block utspätt 1:200. Antalet celler baseras på antalet tinade celler.
- Inkubera i 15 minuter på is för att blockera Fc-receptorerna och tillsätt sedan de biotinylerade antikropparna i tabell 6. Inkubera i ytterligare 20 minuter på is.
- Fyll på röret med DPBS 2% FCS och snurra vid 200 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Resuspendera cellerna i DPBS 2% FCS vid 80% av volymen från steg 4.1 (dvs 80 μL per 1 x 107 celler).
- Tillsätt magnetiska streptavidinpärlor till cellsuspensionen vid 20 % av volymen från steg 4.1 (dvs. 20 μL pärlor per 1 x 107 celler).
- Inkubera cellerna i 15 minuter på is och agitera ibland.
- Under tiden, per 1 x 108 celler, förbereda en magnetisk separator med en stor magnetisk utarmningskolonn och ett förseparationsfilter. Skölj förseparationsfiltret och kolonnen med 2 ml DPBS 2% FCS genom tyngdkraftsflöde och kassera genomströmningen. Installera ett 15 ml uppsamlingsrör.
OBS: Användningen av andra kolumner som positiva urvalskolumner eller andra magnetiska pärlreningssystem kan drastiskt minska renheten. - Efter inkubation, fyll på cellerna till 0,5 ml med DPBS 2% FCS om volymen är <0,5 ml. Om volymen är ≥0,5 ml, fortsätt helt enkelt.
- Fyll cellsuspensionen i förseparationsfiltret på den förberedda kolonnen och samla upp genomströmningen i 15 ml röret.
- Eluera de obundna anrikade B-cellerna två gånger genom att tillsätta 1 ml DPBS 2% FCS i förseparationsfiltret. Samla de obundna cellerna i samma rör genom gravitationsflöde.
OBS: Ytterligare eluering kan marginellt öka utbytet. Renheten och effektiviteten kan utvärderas med flödescytometri för ingångscellerna, anrikade celler och celler som behålls på kolonnen. För att få cellerna kvar på kolonnen, ta bort kolonnen från magneten och spola med 3 ml DPBS 2% FCS med den medföljande kolven. Om så önskas, utvärdera renheten genom flödescytometri som i figur 3 med hjälp av reagenserna i tabell 7. - Centrifugera de anrikade B-cellerna vid 200 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Resuspendera cellerna vid uppskattningsvis ~ 5 x 106 celler / ml i B-cellodlingsmedium och fortsätt med steg 3.7.
5. Primär rhesusmakak B-cellgenredigering
- Efter aktivering av rhesusmakak B-cellerna i 48 timmar ± 2 timmar, förbered reagenserna för elektroporering och transduktion.
- Förvärmd DMSO, nukleasfri duplexbuffert, buffert T och buffert E (10 μL elektroporeringssats) eller E2 (100 μL elektroporeringssats) från elektroporeringssatsen till RT.
- Tina rAAV6 HDRT- och B-cellstimulerande medel från tabell 5 på is.
- Resuspendera CRISPR-Cas9 sgRNA vid 100 μM i duplexbuffert. Rekonstituera i 10 minuter vid rumstemperatur och blanda genom virvelning och snärtning. Förvara de rekonstituerade sgRNA på is tills användning. Förvaras vid −80 °C.
OBS: CRISPR-Cas9 sgRNA kan utformas med olika onlineverktyg (se 1.1.1) och kan variera drastiskt i sin skäreffektivitet. Empirisk testning av skäreffektiviteten rekommenderas med hjälp av analyser som TIDE37 eller ICE38. - Bered 550 μL B-cellodlingsmedium per 10 μl elektroporering med alla stimulantia från tabell 5 och tillsätt 1% DMSO. Skala volymerna 10 gånger för 100 μL elektroporeringar. Eventuellt kan 10% av detta medium framställas utan antibiotika-antimykotisk, vilket något ökar cellviabiliteten efter transfektion.
- Per 10 μL elektroporering, bereda en brunn av en 48-brunns cellodlingsplatta med 50 μL av B-cellodlingsmediet med stimulantia och utan antibiotika-antimykotisk, om den används. För 100 μL elektroporeringar, pipettera 500 μL i brunnarna på en 6-brunnsplatta.
- Tillsätt rAAV6 HDRT till mediet i brunnarna, upp till 20% av volymen i brunnen. Sikta på MOI som sträcker sig från 1 x 10 5-1 x 10 6 baserat på antalet celler per transfektion (10 μL elektroporering: 5 x 10 5 celler; 100 μL elektroporering:5 x 106 celler) och GC i rAAV6-preparatet. Höga rAAV6-koncentrationer på 5 x 1013 GC/ml till 5 x 1014 GC/ml rekommenderas för att uppnå höga MOI med låga volymer.
OBS: Lägre MOI kan leda till minskad redigeringseffektivitet, och MOI på 5 x 105 är i allmänhet nära den maximala redigeringseffektiviteten vi har sett. En påverkan av varierande MOI på B-cellviabilitet har inte observerats. Vi rekommenderar att kontroller utan rAAV6 HDRT inkluderas, utan RNP-transfektion och utan båda. - Förvärm de tillagade rätterna och det återstående mediet genom att överföra dem till en inkubator vid 37 °C med 5%CO2.
- Per 10 μL elektroporering, bereds 1,15 μL ribonukleoprotein (RNP): Blanda 0,4 μL 61 μM Cas9 med 0,75 μL 100 μM sgRNA i duplexbuffert. Förbered extra (30% mer för en enda elektroporering rekommenderas) på grund av pipetteringsfel och för att undvika bubblor när du laddar elektroporeringsspetsarna. Skala 10 gånger för 100 μL spetsar.
- Inkubera RNP i minst 15 minuter vid rumstemperatur innan det blandas med cellerna. Efter inkubation kan flera RNP kombineras om mer än en plats ska riktas samtidigt. Inga signifikanta skillnader i effektivitet har observerats med upp till tre loci samtidigt.
- Förbered under tiden cellerna för elektroporering. Håll cellerna vid RT hela tiden för att undvika temperaturchocker. Skörda cellerna efter 48 h ± 2 h kultur i ett lämpligt kärl. Skölj diskarna med DPBS för att samla maximalt antal celler.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 10 minuter vid RT. Kassera supernatanten och suspendera cellerna i DPBS igen vid ~ 2 x 106 celler / ml.
- Kombinera 10 μL trypanblå 0,4% lösning med 10 μL av cellsuspensionen och räkna med hjälp av en hemocytometer.
OBS: Vid denna tidpunkt, på grund av förlust under skörd och tvättning, förvänta dig cirka 60% av cellerna som sattes i kultur 48 timmar ± 2 timmar tidigare. - Centrifugera under tiden cellerna vid 200 x g i 10 minuter vid RT. Kassera supernatanten och se till att minimera eventuella återstående DPBS. Resuspendera cellerna i förvärmd (RT) buffert T vid 5,55 x 107 celler/ml baserat på ovanstående cellantal.
- Ställ in transfektionssystemet genom att slå på maskinen och ställa in den på 1 350 V, 15 ms och 1 puls. Placera pipettstationen inuti den laminära flödeshuven
- Bered ett transfektionsrör med 3 ml buffert E (för transfektioner på 10 μL) eller E2 (för transfektioner på 100 μl). Sätt in röret i pipettstationen.
- Per 10 μL elektroporering, kombinera 1,15 μL RNP med 9 μL celler. Se till att ha en tillräcklig volym (+ 30%) för att undvika att suga luft in i elektroporeringsspetsen. Inkubera vid rumstemperatur i 1-2 minuter före elektroporering.
- Aspirera 10 μL eller 100 μL RNP och cellblandning i elektroporeringsspetsen av lämplig storlek på en elektroporeringspipett, sätt in den laddade pipetten i pipettstationen och starta elektroporeringen. Se till att spetsarna är helt fria från luftbubblor för att förhindra ljusbågar. Titta under elektroporering för att verifiera att ljusbågar inte uppstår.
- Mata omedelbart ut de elektroporerade cellerna i den förberedda, förvärmda, lilla volymen medium med eller utan rAAV6 inuti plattan med 48 brunnar (10 μL transfektioner) eller 6 brunnar (100 μL transfektioner). Upprepa steg 5.15-5.17 med de återstående proven. Lägg till kontrollprover utan transfektion till odlingsbrunnarna.
- Inkubera cellerna vid 37 °C med 5 %CO2 i 4 timmar ± 2 timmar och tillsätt sedan det beredda, förvärmda B-cellodlingsmediet innehållande stimulantia, DMSO och antibiotika/antimykotiska: 450 μL för 10 μL transfektioner eller 4,5 ml för 100 μL transfektioner.
- Fortsätt inkubationen vid 37 °C med 5 % CO2 i12 –24 timmar. Byt sedan mediet till B-cellodlingsmediet som innehåller stimulantia och antibiotika / antimykotiskt utan DMSO om förlängd odling önskas. Analys av genomiskt DNA kan göras efter 24 timmar. Digital dropp-PCR med en primer utanför homologiarmen och en primer inuti insatsen kan användas för att kvantifiera redigeringseffektiviteten39. Utför PCR för att förstärka insättningsplatsen och Sanger-sekvensering för att verifiera korrekt redigering.
- För analys av proteinnivåerna, odla cellerna i 40-48 timmar efter elektroporering för att tillåta förändringar i proteinuttrycket och utför en analys med flödescytometri med hjälp av reagenserna i tabell 7.
Representative Results
Produktionen av rAAV6 med användning av den tetracyklinaktiverade, självdämpande adenovirala hjälpen resulterade i produktion av 4 x 1010 GC / ml cellodlingsmedium i genomsnitt, vilket överträffade produktionen med en standard, hjälpfri trippeltransfektion med 30-40 gånger (figur 2).
Den valfria reningen av rhesusmakak B-celler resulterade i eliminering av den stora majoriteten av CD3 + T-cellerna och CD14 + och / eller CD16 + myeloida celler, med renhet av 80% -95% CD20 + B-celler rutinmässigt erhållen (figur 3). Baserat på våra tidigare konstruktioner i murina B-celler7 utvecklade vi en metod för att redigera B-cellreceptorspecificiteten hos rhesusmakak B-celler samtidigt som alleluteslutning upprätthålls i de allra flesta B-celler genom att radera endogena antikroppsljuskedjor genom störningen av deras konstanta region. Vi konstruerade en promotorlös HDRT som skulle sättas in i IGH-locus mellan den sista IGHJ-genen och Eμ-förstärkaren av rhesusmakak B-celler (figur 4). Denna konstruktion använder den endogena V H-promotorn för den naturligt omarrangerade uppströms VDJ-regionen i mognaB-celler och uttrycks således inte av episomala AAV-genom. Dessutom kräver denna konstruktion splitsning i nedströms antikropps tunga kedjekonstanta regioner som ska uttryckas på cellytan. Därför indikerar specifik antigenbindning på cellytan som visas med flödescytometri korrekt mållokusintegration och att den infogade sekvensen är funktionell.
Vi paketerade en sådan konstruktion som kodar för antikropp Ab1485, en rhesusmakak-härledd anti-HIV bNAb40, i rAAV6 och använde den för att redigera aktiverade primära rhesusmakaque-splenocyter eller PBMC-kulturer, som beskrivits ovan (figur 5A). Protokollet bibehöll hög cellviabilitet (~ 90%) samtidigt som ljuskedjeuttrycket i ~ 80% av B-cellerna raderades. Majoriteten av B-cellerna uttryckte fortfarande isotypen IgM (figur 5B). Tillägget av rAAV6 som kodar för Ab1485 HDRT resulterade i genredigering och Ab1485-ytuttryck i 16% -21% av B-cellerna (figur 5A), om än med en lägre fluorescensintensitet för antikroppskedjor än på oredigerade B-celler (figur 5A höger panel, figur 5C). Detta kan vara resultatet av epitopkonkurrens mellan antigenfläcken och de monoklonala som används för att detektera ytan BCR i flödescytometri, såväl som faktiskt reducerat proteinuttryck på grund av HDRT: s polycistroniska natur och mindre effektiv splitsning. Tillsatsen av 1% DMSO och utökade, koncentrerade inkubationer med rAAV6 HDRT ökade i allmänhet redigeringseffektiviteten (figur 6A-C). Med hjälp av denna specifika metod, vanligtvis 5% -20% och upp till 40%, uppnås redigeringseffektivitet beroende på den enskilda rhesusmakaken (figur 5A, figur 6A-E) och kvaliteten på rAAV6 HDRT-satsen (figur 6E). Sammantaget presenterar vi protokoll för effektiv rAAV6-produktion samt odling, rening och genredigering av rhesusmakak B-celler.
| Reagenser | Volym | Lager | Slutlig koncentration |
| DMEM, hög glukos | 500 ml | 1 x | ~ 88,5% |
| FCS, värmeinaktiverad | 50 ml | 1 x | ~ 8,85% |
| Antibiotika/Antimykotiska | 5 ml | 100 x | 1 x |
| Glutamin | 5 ml | 200 mM | 2 mM |
| Natriumpyruvat | 5 ml | 100 mM | 1 mM |
Tabell 1: 293AAV-cellodlingsmediet.
| Reagenser | Volym | Lager | Slutlig koncentration |
| DMEM, hög glukos | 500 ml | 1 x | ~ 95,2% |
| FCS, värmeinaktiverad | 10 ml | 1 x | ~ 1,9% |
| Antibiotika/Antimykotiska | 5 ml | 100 x | 1 x |
| Glutamin | 5 ml | 200 mM | 2 mM |
| Natriumpyruvat | 5 ml | 100 mM | 1 mM |
Tabell 2: 293AAV-cellproduktionsmediet.
| Utspädningsserien | Provets volym (μL) | Spädningsmedel och volym | Utspädningsfaktorn | Total utspädning | Referens AAV6 |
| GC/ml | |||||
| Utspädning 1 | 2 μL prov eller AAV-referensstandard vid 4,1 x 1011 GC/ml | 18 μL DNAseI-buffert och enzym | 10 x | 10 x | 4,1 x 1010 |
| Utspädning 2 | 15 μL Dil. 1 | 60 μLH2O | 5 x | 50 x | 8,2 x 109 |
| Utspädning 3 | 20 μL Dil. 2 | 80 μLH2O | 5 x | 250 x | 1,6 x 109 |
| Utspädning 4 | 20 μL Dil. 3 | 80 μLH2O | 5 x | 1250 x | 3,3 x 108 |
| Utspädning 5 | 20 μL Dil. 4 | 80 μLH2O | 5 x | 6250x | 6,6 x 107 |
| Utspädning 6 | 20 μL Dil. 5 | 80 μLH2O | 5 x | 31250 x | 1,3 x 107 |
| Utspädning 7 | 20 μL Dil. 6 | 80 μLH2O | 5 x | 156250 x | 2,6 x 106 |
| Utspädning 8 | 20 μL Dil. 6 | 80 μLH2O | 5 x | 781250 x | 5,24 x 105 |
| Utspädning 9 | 20 μL Dil. 7 | 80 μLH2O | 5 x | 3906250 x | 1,05 x 105 |
Tabell 3: qPCR-utspädningstabell.
| Reagens | Volym | Lager | Slutlig koncentration |
| RPMI-1640 | 420 ml | 1 x | 84% |
| FCS, värmeinaktiverad | 50 ml | 1 x | 10% |
| Antibiotika/Antimykotiska | 5 ml | 100 x | 1 x |
| Glutamin | 5 ml | 200 mM | 2 mM |
| Natriumpyruvat | 5 ml | 100 mM | 1 mM |
| HEPES | 5 ml | 1 meter | 10 mM |
| 2-B-merkaptoetanol | 550 μL | 55 mM | 55 μM |
| Icke-essentiella aminosyror | 5 ml | 100 x | 1 x |
| Insulin-transferin-selen | 5 ml | 100 x | 1 x |
Tabell 4: B-cellodlingsmedium.
| Reagens | Utspädning | Lager | Slutlig koncentration |
| MegaCD40L | 1:1000 | 100 μg/ml | 100 ng/ml |
| CpG ODN | 1:300 | 1 mg/ml | 3,33 μg/ml |
| Mänsklig BAFF | 1:1000 | 40 μg/ml | 40 ng/ml |
| Människa IL-2 | 1:1000 | 50 μg/ml | 50 ng/ml |
| Människa IL-10 | 1:1000 | 50 μg/ml | 50 ng/ml |
Tabell 5: B-cellstimulerande medel.
| Antikropp | Klon | Utspädning | Slutlig konc. |
| anti-human CD3 | FN-18 | 1:40 | 2,5 μg/ml |
| anti-human CD8a | RPA-T8 | 1:200 | 2,5 μg/ml |
| anti-human CD14 | M5E2 | 1:200 | 2,5 μg/ml |
| anti-human CD16 | 3G8 | 1:200 | 2,5 μg/ml |
| anti-mänsklig CD33 | AC104.3E3 | 1:50 | 1 prov |
| anti-human CD64 | 10.1 | 1:800 | 0,625 μg/ml |
| anti-mänsklig CD66 | TET2 | 1:11 | 1 prov |
| anti-mänsklig CD89 | A59 | 1:800 | 0,625 μg/ml |
Tabell 6: Antikroppar för valfri uttömning av icke-B-celler.
| Reagens | Typ/klon | Arbetsutspädning/koncentration |
| anti-human CD14 AlexaFluor647 | M5E2 | 1:50 |
| anti-human CD16 AlexaFluor700 | 3G8 | 1:50 |
| anti-human CD20 PECy7 | 2H7 | 1:50 |
| anti-human CD3 PE | SP34-2 | 1:50 |
| Zombie-NIR | - | 1:500 |
| anti-human HLA-DR BV605 | L243 | 1:200 |
| anti-mänsklig Ig lätt kedja lambda APC | MHL-38 | 1:50 |
| anti-mänsklig Kappa Light Chain FITC | polyklonal | 1:500 |
| anti-human IgM BV421 | MHM-88 | 1:50 |
| RC1-antigen, slumpmässigt biotinylerat | - | 5 μg/ml |
| Streptavidin-PE | - | 1:500 |
Tabell 7: Flödescytometriska reagens för analys.
Figur 1: Schematisk översikt över rAAV6-produktion och genredigering av primära rhesusmakak B-celler. Protokollen är indelade i rAAV6-produktion (steg 1) och genredigering av rhesusmakak B-celler (steg 2-5), inklusive ett valfritt steg för utarmning av icke-B-celler (steg 4). Steg i protokollen indikeras med röda cirklar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Höga rAAV6-utbyten med hjälp av en självdämpande adenoviral hjälpare. rAAV6 framställdes med de metoder som beskrivs här (pAAV-transfektion [TF] + självdämpande hjälpare RepCap6, självdämpande adenoviral hjälpare) eller typisk hjälparfri trippeltransfektion av pAAV, pHelper och pRepCap6 (pRC6). rAAV6 renades endast från cellsupernatanten. Metoderna som använde de självdämpande adenovirala hjälpvektorerna producerade 30-40 gånger mer rAAV titererat med qPCR, som beskrivits ovan. Varje punkt representerar en individuell rAAV-produktion med olika pAAV-konstruktioner från 2 till 20 oberoende experiment. Medelvärdet ± SEM ritas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: B-cellanrikning genom negativ utarmning av icke-B-celler. Rhesus macaque B-celler anrikades från PBMCs med hjälp av det beskrivna protokollet och berikades till 90% renhet. Förberikningsindata och utdata efter anrikning visas. Gated på live, singlet PBMC. Representant för fem oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Inriktningsstrategi som används för redigering av B-cellreceptorspecificiteten hos rhesusmakak B-celler. rAAV6 producerades innehållande HDRT avbildad. HDRT består av en 266 bp 5' homologiarm, följt av 111 bp av rhesusmakak IGHM exon 1 skarvacceptor, sedan en GSG-länkare med en Thosea asigna-virus självklyvande 2A-peptidsekvens (T2A), följt av en ledarsekvens och den kompletta lätta kedjan av rhesusmakakantikroppen Ab1485 som rhesusmakak IGLC1. Detta följs av en furinklyvningsplats, en GSG-länk och en svinteschovirus självklyvande 2A-peptidsekvens (Furin-P2A), följt av en annan ledarsekvens och Ab1485 tungkedjevariabel, följt av 52 bp av rhesusmakakens IGHJ4-skarvdonatorsekvens, för att möjliggöra splitsning i nedströms antikroppskonstanta regioner och en 514 bp homologiarm. Denna konstruktion riktades in i IGH-lokus mellan den sista IGHJ-genen och Eμ-förstärkaren med hjälp av sgRNA-målsekvensen GAGATGCCAGAGCAAACCAG. Båda homologiarmarna var utformade för att sluta vid skärningsstället för detta sgRNA, vilket avlägsnade målsekvensen och möjliggjorde optimal integrationseffektivitet. Samtidigt, för att upprätthålla alleluteslutning och uttrycket av en enda B-cellreceptor, raderade vi endogena ljuskedjor med hjälp av sgRNA riktade mot rhesusmakaken IGKC med målsekvensen GGCGGGAAGATGAAGACAGA och IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 och IGLC7S med målsekvensen CTGATCAGTGACTTCTACCC. HDRT inkluderade tysta mutationer som förhindrade klyvning av IGLC1-sekvensen av detta sgRNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Genredigering av primära rhesusmakakaka B-celler. (A) Primära splenocyter (övre panelen) eller PBMC (nedre panelen) från samma rhesusmakak odlades utan uttömning av icke-B-celler och redigerades enligt beskrivningen ovan. Inriktningsstrategin var som visas i figur 4. Två dagar efter elektroporering skördades cellerna och ytfärgades för flödescytometrisk analys. Den vänstra kolumnen var gated på singlettceller, och de andra kolumnerna var sedan gated, som anges i den övre raden. Cellernas livsduglighet, B-cellernas renhet, de lätta kedjornas deletionseffektivitet och Ab1485s knock-in-effektivitet genom färgning med det specifika antigenet RC141 indikeras i obehandlade, RNP-transfekterade eller RNP-transfekterade + rAAV6-transducerade prover (MOI = 5 x 105). Representant för sex oberoende experiment med celler från olika rhesusmakaker. (B) IgM-uttryck på odlade rhesusmakak B-cellkontroller eller efter redigering och (C) geometrisk genomsnittlig fluorescensintensitet (gMFI) för IgM på B-celler som inte har förlorat Ig-uttryck på grund av IgLC- och IgKC-inriktning (oredigerad) eller B-celler som binder det förväntade antigenet (redigerad). Den röda pricken indikerar gMFI för odlade otransfekterade kontroll B-celler. indikerar p < 0,0001 i ett parat t-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Effekter av DMSO, långvarig koncentrerad inkubation med rAAV6 HDRT, rAAV-batchkvalitet och reproducerbarhet bland olika donator-NHP på genredigeringseffektivitet i primära rhesusmakak B-celler. (A) Splenocyter odlades och redigerades enligt beskrivningen. Efter elektroporering odlades 5 x 10 5 celler i medium med eller utan 1% DMSO och inkuberades i 50 μL medium innehållande rAAV6 HDRT vid en MOI på 5 x 10 5 under antingen 2 timmar eller5 timmar före tillsats av ytterligare 450 μL medium. Cellerna analyserades 2 dagar efter elektroporering med flödescytometri, som i figur 5. Representant för fyra oberoende experiment. (B) Kvantifiering av (A) över fyra oberoende experiment. Punkterna indikerar tekniska replikat med transfektionsinställningar på 1 350 V, 10-20 ms och 1 pulselektroporeringstid och DMSO-koncentrationer från 0,75% -1,25%. (C) Genomsnittlig vikningsförändring i redigeringseffektivitet från (B). * p > 0,05 i Mann-Whitney U-test. (D) Redigeringseffektivitet jämfört med oberoende experiment med olika makaker med hjälp av en kommersiell rAAV6-sats med lägre effektivitet. (E) Redigeringseffektivitet med två olika kommersiella satser av rAAV6 i vilka samma konstruktion förpackades i B-cellerna i två olika NHP i samma experiment. Punkterna indikerar tekniska repliker med transfektionsinställningar på 1 350 V, 10-20 ms och 1 pulselektroporering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Discussion
Protokollen som presenteras här ger en snabb och effektiv metod för att generera höga utbyten och titrar av rAAV6s som HDRT och nya metoder för att effektivt genredigera primära rhesusmakak B-celler in vitro.
Produktionsprotokollet rAAV6 är relativt enkelt och snabbt, vilket möjliggör produktion och testning av många olika konstruktioner samtidigt utan överdrivet arbete. Om så önskas kan rAAV6 renas ytterligare med hjälp av etablerade protokoll såsom jodixanolgradient ultracentrifugering34 eller vattenhaltig tvåfaspartitionering35 före buffertbyte och koncentration.
Även om det minskade det totala utbytet valde vi att endast använda serumreducerat cellodlingsmedium för rAAV6-rening istället för rening från cellpelleten, eftersom majoriteten av rAAV6 släpps ut i mediet36, och rening från cellpelleten ger mer kostnad och arbete. Användningen av den självinaktiverande adenovirala hjälpen ökade utbytet 30-40 gånger i genomsnitt, vilket möjliggjorde testning av konstruktioner förpackade i AAV6 i en enda 15 cm maträtt. Även om vår reningsmetod är grundläggande, får vi med hjälp av denna metod relativt liten batch-till-batch-variation i genredigeringseffektivitet eller cellviabilitet efter transduktion med olika cellinjer eller andra primära celler (data visas inte).
Vi utvecklade ett reningsprotokoll för rhesusmakak B-celler för att erhålla orörda primära B-celler med hjälp av negativ utarmning av oönskade populationer. Även om det inte är nödvändigt för genredigering av dessa celler, ger det ett sätt att erhålla en relativt ren population av primära rhesusmakak B-celler för denna eller andra applikationer om andra celltyper stör de experimentella målen. Renhet kommer emellertid på bekostnad av minskade totala B-cellutbyten. För både de anrikade och icke-anrikade B-cellkulturerna är fraktionen av B-celler i de initiala PBMC- eller splenocytpreparaten avgörande. I synnerhet för PBMC rekommenderar vi screening av olika makaker för individer med en hög andel B-celler i perifert blod för att få ett stort antal B-celler för experiment, eftersom detta värde kan skilja sig dramatiskt mellan individer27. PBMC kan erhållas genom regelbunden blödning eller leukaferes42.
Genredigeringsprotokollet leder till effektiv genredigering, vanligtvis mellan 60% -80% av knock-out och 5% -20% av knock-in B-celler, även om vi har uppnått upp till 90% BCR knock-out och 40% BCR knock-in B-celler (Figur 5 och Figur 6).
De viktigaste parametrarna för effektiv redigering av rhesusmakak B-celler är sgRNA: s skäreffektivitet, elektroporeringsparametrarna, MOI och kvaliteten på rAAV6-preparatet. Skäreffektiviteten hos kandidat-sgRNA bör bestämmas empiriskt för att möjliggöra optimal redigering och design av HDRT. De elektroporeringsparametrar som presenteras här balanserar effektivitet med genomförbarhet för att erhålla det maximala totala antalet redigerade B-celler snarare än den högsta andelen redigerade B-celler. Om en högre andel redigerade celler krävs rekommenderas ökade spänningar (upp till 1 750 V) eller förändrade pulslängder (10-30 ms), även om mer celldöd kan observeras. Vi noterade också något högre redigeringseffektivitet i mjältens B-celler jämfört med B-celler från PBMC från samma individ (figur 5); Den bakomliggande orsaken till detta är dock för närvarande okänd.
Vi fann att tillsatsen av 1% DMSO efter elektroporering signifikant ökade genredigeringseffektiviteten med ~ 40% i rhesusmakak B-celler utan att påverka cellviabiliteten (figur 6A-C), i linje med rapporter i andra celler43. Förlängd odling i 1% DMSO bör dock undvikas och kan påverka cellviabiliteten. DMSO kan helt utelämnas om så önskas.
Odlingen av cellerna i en liten volym efter elektroporering i flera timmar tillsammans med rAAV6 leder till högre redigeringseffektivitet, troligen på grund av den bättre transduktionen av HDRT av rAAV6 och därmed den högre intracellulära koncentrationen av HDRT vid den relevanta tidpunkten när Cas9 är aktiv. Vi fann att odling av cellerna på detta sätt i upp till 8 timmar inte påverkade cellviabiliteten, men redigeringseffektiviteten ökade inte dramatiskt utöver 5 timmar (figur 6). Om endast knock-out istället för knock-in krävs, kan detta steg utelämnas.
Sammanfattningsvis presenterar vi omfattande protokoll för genredigering av rhesusmakak B-celler in vitro och produktion av rAAV6 HDRT som är nödvändig för effektiv knock-in av önskade konstruktioner. Dessa protokoll möjliggör snabb, kostnadseffektiv testning av många konstruktioner förpackade som rAAV6 och möjliggör preklinisk testning av genomförbarheten och skalbarheten av B-cellterapier i en mer relevant icke-human primatmodell.
Disclosures
Inga konkurrerande intressen deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Harry B. Gristick och Pamela Björkman för att ha tillhandahållit RC1-antigenet och hela Nussenzweig- och Martin-laboratorierna för kritisk diskussion. Detta arbete stöddes av Bill och Melinda Gates Foundation-bidrag INV-002777 (till MCN) och det intramurala forskningsprogrammet för National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health. (R.G. och M.A.M). M.C.N. är en HHMI-utredare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL tube sterile, Dnase, Rnase and purogen free | Stellar Scientific | T17-125 | or similar |
| 10 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4488 | or similar |
| 15 cm tissue culture dish | Falcon | 353025 | or similar |
| 15 mL polypropylene conical tybe | Falcon | 352097 | or similar |
| 25 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4489 | or similar |
| 250 mL polypropylene conical tybe | Corning | 430776 | or similar |
| 293AAV cell line | Cell Biolabs | AAV-100 | |
| 2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x) | Gibco | 21985-023 | |
| 48-well tissue culture plate | Corning | 3548 | or similar |
| 5 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4487 | or similar |
| 5 mL syringes with Luer-Lok Tip | BD | 309646 | or similar |
| 50 mL polypropylene conical tybe | Falcon | 352070 | or similar |
| 50 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-free | Corning | 4490 | or similar |
| 6-well tissue culture plate | Falcon | 353046 | or similar |
| AAV-6 Packaging System (plasmids) | Cell Biolabs | VPK-406 | |
| AAV6 Reference Materials (full capsids) | Charles River | RS-AAV6-FL | |
| Accu-jet S Pipette Controller | Brand | 26350 | or similar pipette controller |
| Antibiotic/Antimycotic 100x | Gibco | 15260-062 | |
| anti-human CD14 AlexaFluor647 | Biolegend | 301812 | |
| anti-human CD14 biotin | BioLegend | 301826 | |
| anti-human CD16 AlexaFluor700 | BD Biosciences | 557920 | |
| anti-human CD16 biotin | BioLegend | 302004 | |
| anti-human CD20 PECy7 | Biolegend | 302312 | |
| anti-human CD3 biotin | Thermo Fisher | APS0309 | |
| anti-human CD3 PE | BD Biosciences | 552127 | |
| anti-human CD33 biotin | Miltenyi | 130-113-347 | |
| anti-human CD64 biotin | BioLegend | 305004 | |
| anti-human CD66 biotin | Miltenyi | 130-100-143 | |
| anti-human CD89 biotin | BioLegend | 354112 | |
| anti-human CD8a biotin | BioLegend | 301004 | |
| anti-human HLA-DR BV605 | Biolegend | 307640 | |
| anti-human Ig light chain lambda APC | Biolegend | 316610 | |
| anti-human IgM BV421 | Biolegend | 314516 | |
| anti-Human Kappa Light Chain FITC | Fisher Scientific | A18854 | |
| Autoclave | Steris | Amsco Lab 250 | or similar |
| Cell culture CO2 incubator | Fisher Scientific | 51026331 | or similar |
| Centrifugal Filter Unit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa) | Millipore | UFC810024 | |
| Centrifuge 5920 R | Eppendorf | EP022628188 | or any other, coolable swinging bucket centrifuge with inserts for 96-well plates, 15, 50 and 250 mL size tubes |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298SK-4 | |
| Cpg ODN | Invivogen | tlrl-2395 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869-500ML | |
| DMEM, High Glucose | Gibco | 11965092 | |
| DNaseI (RNase-free) | New England Biolabs | M0303L | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Electroporation kit (Neon Transfection System 10 µL) | Fisher Scientific | MPK1096 | or other sizes or 100 uL transfection kit MPK 10096 |
| Electroporation system (Neon Transfection System) | Fisher Scientific | MPK5000 | |
| FCS | Hyclone | SH30910.03* | |
| Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS) | Cytiva | 17144002 | or similar |
| Fume Hood | Fisher Scientific | FH3943810244 | or similar |
| Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | |
| Graduated Cylinder 1L | Corning | 3022-1L | or similar |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z375357-1EA | or similar |
| HEPES 1M | Gibco | 15630-080 | |
| HEPES 1M | Gibco | 15630-080 | |
| Hot Plate Magnetic Stirrer | Fisher Scientific | SP88857200 | or similar |
| Human BAFF | Peprotech | 310-13 | |
| Human BD Fc Block | BD | 564220 | |
| Human IL-10 | Peprotech | 200-10 | |
| Human IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrophilic Polyethersulfone Syringe Filters, (Supor membrane), Sterile - 0.2 µm, 25 mm | Pall | 4612 | |
| Insulin-Transferin-Selenium, 100x | Gibco | 41400-045 | |
| ITR primer forward: GGAACCCCTAGTGATGGAGTT | Integrated DNA Technologies | custom | |
| ITR primer reverse: CGGCCTCAGTGAGCGA | Integrated DNA Technologies | custom | |
| Laminar flow biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A | or similar |
| Large magnetic depletion (LD) Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Magentic seperator (MidiMACS separator and multistand) | Miltenyi Biotec | 130-090-329 | |
| Magnetic stir bar | Fisher Scientific | 14-512-127 | or similar |
| Magnetic streptavidin beads (Streptavidin MicroBeads) | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Maxiprep kit | Machery-Nagel | 740414.5 | or similar |
| Media Bottles 2L with cap | Cole-Parmer | UX-34514-26 | or similar |
| MegaCD40L | Enzo | ALX-522-110-C010 | |
| MicroAmp Optical 384-well Reaction Plate | Fisher Scientific | 4309849 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Fisher Scientific | 4311971 | |
| Microcentrifuge 5424 R | Eppendorf | 5404000014 | or any other table top centrifuge for 1.5 mL tubes |
| Microwave oven | Panasonic | NN-SD987SA | or similar |
| Nikon TMS Inverted Phase Contrast Microscope | Nikon | TMS | or any other Inverted phase-contrast microscope for cell culture |
| Non-essential amino acids, 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Nuclease-free Duplex buffer | Integrated DNA Technologies | 11-01-03-01 | |
| Nuclease-free Water | Qiagen | 129115 | |
| pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | or similar |
| Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 and tips | Gilson | F167380 | or similar set of pipettes and tips |
| Pluronic F-68 10 % | Gibco | 24040-032 | |
| Polyethylene Glycol 8000 | Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25K | Polysciences | 23966-100 | |
| Precision Balance | Mettler Toledo | ME4001TE | or similar |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Pyrex glass beaker 2 L | Cole-Parmer | UX-34502-13 | or similar |
| Pyrex glass beaker 250 mL | Millipore Sigma | CLS1000250 | or similar |
| qPCR Instrument | Fisher Scientific | 4485691 | or similar |
| RC1 antigen randomly biotinylated | Bjorkman lab, CalTech | in house | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| S.p. Cas9 Nuclease | Integrated DNA Technologies | 1081059 | |
| Scientific 1203 Water Bath | VWR | 24118 | or any water bath set to 37 °C |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Sodium Pyruvate 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membranes | Thermo Scientific Nalgene | 567-0020 | |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | |
| SYBR Green Master Mix | Fisher Scientific | A25742 | |
| Tetracycline-enabled, self-silencing adenoviral vector RepCap6 | Oxgene | TESSA-RepCap6 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Water Purification System | Millipore Sigma | ZEQ7000TR | or similar |
| Zombie-NIR | Biolegend | 423106 |
References
- Victora, G. D., Nussenzweig, M. C.
- Plotkin, S. A. Correlates of protection induced by vaccination. Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).
- Brinkmann, V., Heusser, C. H. T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors. Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).
- Chernecky, C. C., Berger, B. J. Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition. , Elsevier Saunders. St Louis, MO. 917-920 (2013).
- Balazs, A. B., et al. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).
- Greiner, V., et al. CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells. iScience. 12, 369-378 (2019).
- Hartweger, H., et al. HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).
- Huang, D., et al. Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells. Nature Communications. 11, 5850 (2020).
- Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies. Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).
- Nahmad, A. D., et al. In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).
- Nahmad, A. D., et al. Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion. Nature Communications. 11, 5851 (2020).
- Voss, J. E., et al. Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies. eLife. 8, 42995 (2019).
- Pesch, T., et al. Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells. Frontiers in Immunology. 10, 2630 (2019).
- Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 7, 10934 (2016).
- Rogers, G. L., Cannon, P. M. Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).
- Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
- Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
- Wu, C. M., et al. Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).
- Luo, B., et al. Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration. Cell Death and Disease. 11 (11), 973 (2020).
- Laoharawee, K., et al. Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (165), e61855 (2020).
- Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells. Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).
- Moffett, H. F., et al. B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo. Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).
- Nishimura, Y., Martin, M. A. Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1. Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).
- Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials. Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).
- Kreuser, S., et al. Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells. bioRxiv. , (2021).
- Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation. Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).
- Kim, J. S., et al. Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).
- Su, W., et al. Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination. Nature Communications. 13, 1182 (2022).
- Endo, Y., et al. Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus. Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).
- Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences. Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
- Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
- Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
- Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
- Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12, 686 (2021).
- Wang, Z., et al. A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch. eLife. 9, 61991 (2020).
- Escolano, A., et al. Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques. Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).
- Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).
- Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).
