Method Article

Анализы цитотоксичности с клеточными линиями рыбок данио-рерио

DOI:

10.3791/64860

⸱

January 6th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Genetics, Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR), 2Safety of Product Department, Grupo Boticário, 3Department of Genetics, Federal University of Paraná (UFPR)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе представлены широко используемые анализы цитотоксичности (анализы Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red и MTT), адаптированные для оценки цитотоксичности эмбрионов рыбок данио-рерио (ZEM2S) и клеточных линий печени (ZFL) в 96-луночных планшетах.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клеточные линии рыб стали все чаще использоваться в исследованиях экотоксичности, и анализы цитотоксичности были предложены в качестве методов прогнозирования острой токсичности рыб. Таким образом, в этом протоколе представлены анализы цитотоксичности, модифицированные для оценки жизнеспособности клеток эмбрионов рыбок данио-рерио (Danio rerio) (ZEM2S) и клеточных линий печени (ZFL) в 96-луночных планшетах. Оцениваемыми конечными точками цитотоксичности являются целостность митохондрий (анализы Alamar Blue [AB] и MTT), целостность мембраны через активность эстеразы (анализ CFDA-AM) и целостность лизосомальной мембраны (анализ нейтрального красного [NR]). После экспозиции исследуемых веществ в 96-луночном планшете проводятся анализы цитотоксичности; здесь AB и CFDA-AM проводятся одновременно, за ними следует NR на одной и той же пластине, в то время как анализ MTT выполняется на отдельной пластине. Показания этих анализов снимаются путем флуоресценции для AB и CFDA-AM и абсорбции для MTT и NR. Анализы цитотоксичности, проведенные с этими линиями клеток рыб, могут быть использованы для изучения острой токсичности химических веществ на рыбе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Химические вещества должны быть проверены на предмет их безопасности для здоровья человека и окружающей среды. Молекулярные и клеточные биомаркеры все чаще учитываются при оценке безопасности для прогнозирования воздействия на живые организмы регулирующими органами и/или законодательством (например, REACH, ОЭСР, US EPA)1,2, поскольку они могут предшествовать неблагоприятному исходу in vivo (например, эндокринные нарушения, иммунологический ответ, острая токсичность, фототоксичность)3,4,5,6,7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для списка материалов, используемых в этом протоколе, и Таблицу 1 для состава растворов и сред, используемых в этом протоколе.

1. Подготовка ячеек ZFL и ZEM2S

  1. Начните с колбы T75 из клеток ZFL или ZEM2S с 80% слиянием, культивируемых в соответствующей полной среде при 28 ° C без CO2.
  2. Удалите питательную среду из колбы и промойте клетки, добавив 10 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (0,01 М). Добавьте 3 мл 1x трипсина (0,05% об./об.; 0,5 мМ трипсина-ЭДТА) в колбы для культивирования. Инкубировать при 28 °....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 3 показаны планшеты анализов AB, CFDA-AM, NR и MTT. Для анализа AB (рис. 3A) пустые лунки и лунки с отсутствующим или уменьшенным числом жизнеспособных клеток показывают синий цвет и низкую флуоресценцию, в то время как лунки с большим количеством жизнеспособных клеток имеют розоватый цвет и имеют высокие значения флуоресценции из-за превращения резазурина (AB) в резоруфин (розоватое вещество) жизнеспособными клетками. Для анализа CFDA-AM нет видимой .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализы цитотоксичности широко используются для оценки токсичности in vitro, и в этой протокольной статье представлены четыре широко используемых анализа цитотоксичности, модифицированных для проведения в клеточных линиях рыбок данио-рерио (т.е. плотность клеток для 96-луночного планшета, время инкубации в анализе МТТ, истощение FBS в условиях химического воздействия и максимально допустимая концентрация для СК). Поскольку эти анализы количественно определяют цитотоксичность по различным конечным точкам жизнеспо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории на кафедре физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticario.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5-CFDA, AM (5-карбоксифлуоресцеин диацетат, ацетоксиметиловый эфир)InvitrogenC1345
Планшет для клеточной культуры, 96-луночный планшетSarstedt83.3924Поверхность: Стандартный, плоское основание
DMEMGibco12800-017Порошок, высокий уровень глюкозы, пируват
FBS - фетальная бычья сыворотка, сертифицированная, одобренные Министерством сельского хозяйства США регионыGibco12657-029
Ham's F-12 Питательная смесь, порошокGibco21700026порошок
HEPES (1 M)Gibco15630080
Leibovitz's L-15 MediumGibco41300021
Powder Neutral red Sigma-AldrichN4638Порошок, биореагент, подходит для клеточной культуры
Орбитальный шейкерWarmnestKLD-350-BI22 мм диаметр вращения
Dulbeccos PBS (10X) с кальцием имагнием Invitrogen14080055
пенициллин-стрептомицином (10 000 Ед/мл)Gibco15140122
Резазурином натриевая соль Sigma-AldrichR7017Порошок, биореагент, подходит для клеточной культуры
RPMI 1640 MediumGibco31800-014Порошок
бикарбоната натрияSigma-AldrichS5761Порошок,  биореагент для молекулярной биологии
Тиазолиловый синий Тетразолий Бромид  98%Sigma-AldrichM2128
Трипановый синий краситель (0,4%)Gibco15250-061
Трипсин-ЭДТА (0,5%), без фенола красногоGibco15400054
клеточной линии ZEM2SATCCCRL-2147Эта клеточная линия была любезно предоставлена профессором доктором Майклом Дж.<бр/> Карваном (Университет Висконсина, Милуоки, США)
ZFL клеточная линияBCRJ256

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
  2. Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cytotoxicity AssaysZebrafish Cell LinesFish Cell LinesAcute ToxicityCell ViabilityAlamar Blue AssayMTT AssayNeutral Red AssayCFDA AM Assay96 Well Plate

Related Articles