Summary
В этом протоколе представлены широко используемые анализы цитотоксичности (анализы Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red и MTT), адаптированные для оценки цитотоксичности эмбрионов рыбок данио-рерио (ZEM2S) и клеточных линий печени (ZFL) в 96-луночных планшетах.
Abstract
Клеточные линии рыб стали все чаще использоваться в исследованиях экотоксичности, и анализы цитотоксичности были предложены в качестве методов прогнозирования острой токсичности рыб. Таким образом, в этом протоколе представлены анализы цитотоксичности, модифицированные для оценки жизнеспособности клеток эмбрионов рыбок данио-рерио (Danio rerio) (ZEM2S) и клеточных линий печени (ZFL) в 96-луночных планшетах. Оцениваемыми конечными точками цитотоксичности являются целостность митохондрий (анализы Alamar Blue [AB] и MTT), целостность мембраны через активность эстеразы (анализ CFDA-AM) и целостность лизосомальной мембраны (анализ нейтрального красного [NR]). После экспозиции исследуемых веществ в 96-луночном планшете проводятся анализы цитотоксичности; здесь AB и CFDA-AM проводятся одновременно, за ними следует NR на одной и той же пластине, в то время как анализ MTT выполняется на отдельной пластине. Показания этих анализов снимаются путем флуоресценции для AB и CFDA-AM и абсорбции для MTT и NR. Анализы цитотоксичности, проведенные с этими линиями клеток рыб, могут быть использованы для изучения острой токсичности химических веществ на рыбе.
Introduction
Химические вещества должны быть проверены на предмет их безопасности для здоровья человека и окружающей среды. Молекулярные и клеточные биомаркеры все чаще учитываются при оценке безопасности для прогнозирования воздействия на живые организмы регулирующими органами и/или законодательством (например, REACH, ОЭСР, US EPA)1,2, поскольку они могут предшествовать неблагоприятному исходу in vivo (например, эндокринные нарушения, иммунологический ответ, острая токсичность, фототоксичность)3,4,5,6,7 . В этом контексте цитотоксичность была взята в качестве измерения для прогнозирования острой токсичности рыб 5,8; Тем не менее, он может иметь много других применений в исследованиях экотоксичности, таких как определение субцитотоксических концентраций химических веществ для изучения их самого разнообразного набора эффектов на рыбу (например, эффектов, разрушающих эндокринную систему).
В системах клеточных культур (системах in vitro ) цитотоксичность химических веществ может определяться методами, различающимися по типам конечных точек. Например, метод цитотоксичности может быть основан на конечной точке, связанной со специфической морфологией, наблюдаемой во время процесса гибели клеток, в то время как другой метод может определять цитотоксичность путем измерения гибели клеток, жизнеспособности и функциональности, морфологии, энергетического метаболизма, а также прикрепления и пролиферации клеток. Химические вещества могут влиять на жизнеспособность клеток с помощью различных механизмов, поэтому оценка цитотоксичности, охватывающая различные конечные точки жизнеспособности клеток, необходима для прогнозирования химических эффектов9.
МТТ и Аламар Блю (АБ) - это анализы, которые определяют влияние на жизнеспособность клеток на основе метаболической активности клеток. Анализ МТТ оценивает активность митохондриального фермента сукцинатдегидрогеназы10. Восстановление желтоватого 3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) до формазанового синего происходит только в жизнеспособных клетках, а его оптическая плотность прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток10. Анализ AB является чувствительным окислительно-восстановительным индикатором, опосредованным митохондриальными ферментами, которые флуоресцируют и меняют цвет при восстановлении резазурина до резоруфина живыми клетками11; однако цитозольные и микросомальные ферменты также способствуют снижению AB и MTT12. Эти ферменты могут включать несколько редуктаз, таких как алкоголь и альдегидоксидоредуктазы, NAD(P)H: хиноноксидоредуктаза, флавинредуктаза, НАДН-дегидрогеназа и цитохромы11.
Анализ нейтрального красного (NR) представляет собой анализ жизнеспособности клеток, основанный на включении этого красителя в лизосомы жизнеспособных клеток13. Поглощение NR зависит от способности клеток поддерживать градиенты pH. Градиент протонов внутри лизосом поддерживает рН ниже, чем цитоплазма. При нормальном физиологическом рН NR представляет собой чистый заряд, равный примерно нулю, что позволяет ему проникать через клеточные мембраны. Таким образом, краситель становится заряженным и удерживается внутри лизосом. Следовательно, чем больше количество удерживаемого NR, тем больше число жизнеспособных клеток14. Химические вещества, повреждающие поверхность клеток или лизосомальные мембраны, ухудшают усвоение этого красителя.
Анализ CFDA-AM представляет собой флуорометрический анализ жизнеспособности клеток, основанный на удержании ацетоксиметилового эфира диацетата 5-карбоксифлуоресцеина (CFDA-AM)15. 5-CFDA-AM, эстеразный субстрат, превращается в карбоксифлуоресцеин, флуоресцентное вещество, полярное и непроницаемое мембранами живых клеток15; Таким образом, он удерживается во внутренней стороне неповрежденной клеточной мембраны, что указывает на жизнеспособные клетки.
Недавно три анализа цитотоксичности (анализы CFDA-AM, NR и AB) были объединены в утвержденном руководстве ISO (Международная организация по стандартизации) (ISO 21115:2019)16 и методе испытаний ОЭСР (Организация экономического сотрудничества и развития) (OECD TG 249) для оценки острой токсичности рыб с использованием клеточной линии RTgill-W1 (постоянная клеточная линия из жабр радужной форели [Oncorhynchus mykiss]) в 24-луночных планшетах17 . Несмотря на то, что существует клеточный метод прогнозирования острой токсичности рыб, были предприняты усилия по разработке аналогичных методов для других видов рыб и увеличению пропускной способности метода. Некоторые примеры включают разработку клеточных линий ZFL, трансфицированных репортерными генами для специфических путей токсичности18,19, тесты на фототоксичность в клеточной линии RTgill-W120 и использование клеточных линий ZFL и ZF4 (фибробласты рыбок данио, полученные из эмбрионов в возрасте 1 дня) для оценки токсичности с помощью нескольких анализов цитотоксичности21.
Danio rerio (рыбки данио-рерио) является одним из основных видов рыб, используемых в исследованиях токсичности в водной среде; Таким образом, клеточные методы с клеточными линиями рыбок данио-рерио для тестирования токсичности рыб могут быть чрезвычайно полезными. Клеточная линия ZFL представляет собой эпителиальную клеточную линию гепатоцитов рыбок данио, которая представляет основные характеристики паренхиматозных клеток печени и может метаболизировать ксенобиотики 7,22,23,24,25. Между тем, клеточная линия ZEM2S представляет собой эмбриональную фибробластическую клеточную линию рыбок данио, полученную из стадии бластулы, которая может быть использована для исследования влияния на развитие рыб26,27. Таким образом, этот протокол описывает четыре анализа цитотоксичности (анализы MTT, AB, NR и CFDA-AM) с модификациями, которые должны быть выполнены с клеточными линиями ZFL и ZEM2S в 96-луночных планшетах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для списка материалов, используемых в этом протоколе, и Таблицу 1 для состава растворов и сред, используемых в этом протоколе.
1. Подготовка ячеек ZFL и ZEM2S
- Начните с колбы T75 из клеток ZFL или ZEM2S с 80% слиянием, культивируемых в соответствующей полной среде при 28 ° C без CO2.
- Удалите питательную среду из колбы и промойте клетки, добавив 10 мл 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) (0,01 М). Добавьте 3 мл 1x трипсина (0,05% об./об.; 0,5 мМ трипсина-ЭДТА) в колбы для культивирования. Инкубировать при 28 °C в течение 3 минут.
- Осторожно постучите по колбе, чтобы освободить клетки, а затем остановите расщепление трипсина, добавив в колбу 3 мл полной питательной среды.
- Клеточную суспензию переносят в коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугу при 100 × г в течение 5 мин.
- После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл полной среды для клеток ZFL или ZEM2S и ресуспендируйте гранулу с помощью микропипетки.
2. Подсчет клеток путем исключения красителя трипанового синего
- Добавьте 10 мкл клеточной суспензии и 10 мкл красителя трипанового синего в микропробирку, чтобы подсчитать клетки и оценить их жизнеспособность. Смешайте клеточную суспензию и краситель с помощью пипетки.
- Затем перенесите 10 мкл этой смеси (клеточная суспензия + трипановый синий) в камеру Нейбауэра и подсчитайте клетки в четырех больших квадратах (квадрантах Q), расположенных по углам камеры, считая жизнеспособными клетки те, которые не поглощают трипановый синий. Определите количество жизнеспособных клеток с помощью уравнения (1):
(1) - Рассчитайте окончательное количество ячеек в клеточной суспензии, умножив количество ячеек, определенное с помощью уравнения (1), на два (коэффициент разбавления из-за использования трипанового синего).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы может быть использована автоматизированная система подсчета клеток (например, цитомер с функцией подсчета клеток и жизнеспособности).
(1)3. Обшивка ячеек в 96-луночных пластинах
- Рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для получения количества клеток, необходимых для проведения анализов цитотоксичности. Количество жизнеспособных клеток для каждой клеточной линии указано ниже:
- Планшет 60 000 жизнеспособных клеток ZEM2S на лунку; таким образом, для всей пластины используйте шесть миллионов клеток в 20 мл полной среды (200 мкл / лунка, 96-луночная пластина).
- Планшет 40 000 жизнеспособных клеток ZFL на лунку; таким образом, для всей пластины используйте четыре миллиона клеток в 20 мл полной среды (200 мкл / лунка, 96-луночная пластина).
- После этого переносят соответствующий объем клеточной суспензии в резервуар с реагентом (стерильный) и заполняют полной питательной средой для ZFL или ZEM2S до 20 мл. С помощью многоканальной пипетки аккуратно перемешайте раствор вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы не образовывалась пена или пузырьки. - Добавьте 200 мкл клеточной суспензии в каждую лунку прозрачной полистирольной 96-луночной пластины с помощью многоканальной микропипетки. Инкубировать пластины при 28 °C в течение 24 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина должна иметь не менее трех отверстий без ячеек для холостого контроля, и в эти лунки следует добавлять только полные носители. Краевой эффект (вызванный более высоким испарением в краевых колодцах) обычно возникает в 96-луночных пластинчатых анализах и может влиять на жизнеспособность ячеек в краевых лунках пластины28. Этот эффект может быть выше или ниже в зависимости от марки и конструкции 96-луночной пластины28. Хотя мы не заметили каких-либо нарушений роста/жизнеспособности клеток для ZFL и ZEM2S в краевых лунках, мы предлагаем запечатать пластину парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить этот эффект, или культивировать клетки только в 60 внутренних лунках и заполнить краевые лунки PBS.
4. Воздействие на клетки тестируемого химического вещества
- Аккуратно отработайте среду из лунок с помощью многоканальной микропипетки.
- Подвергните клетки тестированию химических веществ в разных концентрациях. Приготовьте растворы исследуемых химических концентраций в питательных средах для ZFL или ZEM2S без эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (среды воздействия). Затем добавьте 100 мкл на лунку этих растворов в техническом трехкратном количестве (т.е. три лунки / тестовая химическая концентрация).
- Для контроля поместите контрольные группы на ту же пластину, что и испытуемое химическое вещество, в технических трех экземплярах (три лунки/контрольная группа). Таким образом, для холостого контроля (B) добавьте 100 мкл экспонирующей среды в бесклеточные лунки, для отрицательного контроля (NC) добавьте 100 мкл экспонирующей среды в лунки с ячейками, а для положительного контроля (PC) подвергните клетки воздействию раствора 1% Triton X-100, приготовленного в экспонирующей среде. В некоторых случаях в планшет следует включать контроль растворителя (СК), учитывая явно нецитотоксическую концентрацию в качестве конечной концентрации растворителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве растворителя рекомендуется использовать 0,5% ДМСО; ДМСО можно использовать до 1% в качестве растворителя в этих клеточных линиях без превышения порога цитотоксичности в 10%, связанного с отрицательным контролем. - Инкубировать пластины при 28 °C в течение 24 ч. Запечатайте пластины парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы предотвратить испарение питательной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые химические вещества могут иметь внутреннюю фоновую абсорбцию или флуоресценцию, которая может влиять на поглощение или флуоресценцию индикаторного красителя (красителей) (например, соединения с цветом могут влиять на абсорбцию, сывороточный альбумин29 и соединения, мешающие восстановительным ферментам30,31). В этом случае пластина должна включать дополнительный контроль путем добавления тестовых химических растворов в лунки без ячеек. Это необходимо для проверки возможного вмешательства химической автоабсорбции/автофлуоресценции с красителями. Если интерференция обнаружена, следует оценить, можно ли ее исключить, чтобы получить правильный прогноз цитотоксичности.
5. Анализы цитотоксичности
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте все растворы в соответствии с таблицей 1. Все описанные ниже этапы (рисунок 1) проводятся в стерильных условиях. Использование пипетки для отбрасывания экспозиционных сред не рекомендуется, поскольку клетки могут легко отсоединиться от лунок после химической обработки.
- Анализы AB и CFDA-AM
- После 24 часов воздействия испытуемого химического вещества осторожно выбросьте экспонирующую среду, высыпав содержимое в сборный лоток.
- Вымойте тарелку 200 мкл PBS. Осторожно извлеките PBS, насыпав его в лоток для сбора, чтобы избежать потери ячеек.
- Добавьте 100 мкл на лунку раствора AB/CFDA-AM. Выдерживают пластину в течение 30 минут в темноте при температуре 28 °C.
- Измерьте флуоресценцию в считывателе флуоресцентных пластин при 530 нм (возбуждение) и 595 нм (излучение) для AB и при 493 нм (возбуждение) и 541 нм (излучение) для CFDA-AM.
- Анализ NR
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы анализа NR выполняются сразу после анализов AB и CFDA-AM (рис. 1).- Центрифугируют рабочий раствор NR (40 мкг/мл) в дозе 600 × г в течение 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осаждение NR в трубке не должно передаваться на пластины. Таким образом, после центрифугирования рабочего раствора NR собирают надосадочную жидкость с помощью пипетки без аспирации осадков NR. Перенесите надосадочную жидкость в резервуар с реагентами. - Осторожно извлеките раствор AB/CFDA-AM, вылив содержимое в лоток для сбора.
- Добавляют 100 мкл на лунку рабочего раствора NR с помощью многоканальной микропипетки. Инкубируйте планшет при 28 °C в течение 3 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: После 3-часовой инкубации с помощью микроскопа посмотрите, произошло ли осаждение NR в планшетах. Осадки NR могут мешать количественной оценке жизнеспособности клеток, поэтому они не должны присутствовать. - Осторожно удалите раствор NR, вылив содержимое в лоток для сбора. Промойте лунки, добавив 150 мкл PBS на лунку.
- Добавьте 150 мкл на лунку экстракционного раствора NR и инкубируйте пластину на пластинчатом шейкере в течение 10 минут для осторожного встряхивания. Измерьте коэффициент поглощения при длине волны 540 нм в планшетном считывателе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Второе считывание на длине волны 690 нм должно быть выполнено, чтобы исключить фоновое поглощение отпечатков пальцев на пластине.
- Центрифугируют рабочий раствор NR (40 мкг/мл) в дозе 600 × г в течение 10 мин.
- Анализ МТТ
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ МТТ должен проводиться отдельно от анализов, описанных выше (в новой табличке) (рис. 2).- Осторожно извлеките экспонирующий носитель, вылив содержимое в лоток для сбора.
- Добавьте 100 мкл рабочего раствора МТТ на лунку с помощью многоканальной микропипетки. Инкубируйте пластину при 28 °C в течение 4 часов.
- Откажитесь от решения MTT, вылив содержимое в лоток для сбора.
- Добавьте 100 мкл на лунку ДМСО для извлечения кристаллов формазана, инкубируя пластину на пластинчатом шейкере в течение 10 минут. Измерьте коэффициент поглощения на длине волны 570 нм с помощью планшетного считывателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Второе считывание на длине волны 690 нм должно быть выполнено, чтобы исключить фоновое поглощение отпечатков пальцев на пластине. Важно отметить, что испытуемые химические вещества могут создавать помехи для МТТ, что необходимо оценить для обеспечения качества генерируемых данных32. Для этого следует обнажить бесклеточные лунки, содержащие тестовые концентрации и МТТ (0,5 мг/мл), с последующей инкубацией, чтобы наблюдать за любым изменением цвета в лунках, которое может увеличить поглощение и привести к ложным результатам жизнеспособности. В этом тесте следует избегать химических веществ, которые взаимодействуют с МТТ.
6. Расчет жизнеспособности/цитотоксичности клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная необработанная абсорбция или флуоресценция используется для расчета жизнеспособности клеток в процентах, связанных с отрицательным контролем (для тестовых химикатов, приготовленных непосредственно в среде воздействия) или контролем растворителя (для тестовых химикатов, приготовленных с использованием растворителей, таких как ДМСО). Прежде чем определить процент жизнеспособности клеток, необработанные данные должны быть нормализованы с помощью пустого элемента управления.
- Рассчитайте среднюю абсорбцию или флуоресценцию для каждой исследуемой концентрации химического вещества и контрольной группы (три лунки/обработка).
- Чтобы определить процент жизнеспособности клеток относительно контроля (отрицательного или растворителя), используйте уравнение (2):
(2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Единицы поглощения (абс) или флуоресценции (флуоресценции) представляют собой среднее значение поглощения или флуоресценции, измеренное в трех лунках на концентрацию; Бланк представляет собой лунки без ячеек.
(2)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3 показаны планшеты анализов AB, CFDA-AM, NR и MTT. Для анализа AB (рис. 3A) пустые лунки и лунки с отсутствующим или уменьшенным числом жизнеспособных клеток показывают синий цвет и низкую флуоресценцию, в то время как лунки с большим количеством жизнеспособных клеток имеют розоватый цвет и имеют высокие значения флуоресценции из-за превращения резазурина (AB) в резоруфин (розоватое вещество) жизнеспособными клетками. Для анализа CFDA-AM нет видимой разницы в цвете лунок на пластине; однако флуоресценция выше в лунках, содержащих жизнеспособные клетки, из-за удержания CFDA-AM и последующего превращения в карбоксифлуоресцеин (флуоресцентное вещество).
Для анализа NR (рис. 3B) пустые лунки должны быть прозрачными с очень низкими значениями поглощения, поскольку нет ячеек для удержания красителя NR. В некоторых случаях заготовки колодцев не прозрачны, что свидетельствует о возникновении осаждения NR на плите; В данном случае это не следует считать допустимым экспериментом. Высокоцитотоксические концентрации исследуемых химических веществ и ФК прозрачны или имеют очень светло-розовый цвет с низкими значениями поглощения, в то время как лунки, содержащие жизнеспособные клетки, сохраняют краситель NR и имеют темно-розовый цвет и высокие значения поглощения.
Для анализа МТТ (рис. 3C) пустые лунки должны быть прозрачными и с очень низкой поглощающей способностью, так как нет ячеек для превращения МТТ в формазан. Высокоцитотоксические концентрации исследуемых химических веществ и ПК прозрачны или имеют очень светлый фиолетовый цвет с низкими значениями поглощения, в то время как лунки, содержащие жизнеспособные клетки, превращают МТТ (желтый) в формазан (фиолетовое вещество), представляя более темный фиолетовый цвет с высокими значениями поглощения.
На рисунке 4А показан репрезентативный график жизнеспособности клеток после расчета с использованием средних значений флуоресценции или поглощения для каждой группы. График может быть построен с вводом процентных значений жизнеспособности, рассчитанных по формуле расчета жизнеспособности, представленной в разделе 6 протокола, с использованием программного обеспечения для анализа данных. Жизнеспособность клеток, подвергшихся воздействию СК, не должна быть на 10% ниже, чем при НК17. Процент жизнеспособности клеток для исследуемых химических веществ рассчитывается по отношению к NC или SC в зависимости от их растворимости. В этом случае в качестве тестируемого вещества используются различные концентрации ДМСО, а жизнеспособность клеток связана с НК, которая определяется как 100% жизнеспособность.
Данные о жизнеспособности клеток могут быть использованы для расчета половины максимальной ингибирующей концентрации исследуемых химических веществ (IC50) путем логарифмического преобразования и интерполированной стандартной кривой путем нелинейной регрессии после соответствующих повторений33,34,35. На рисунке 4В показана микросхема50, рассчитанная на основе процента жизнеспособности, показанного на рисунке 4А. IC50 был получен по крайней мере с тремя техническими повторами и тремя экспериментальными повторами с использованием номинальных концентраций в анализе AB. Анализы проводились с пятью различными концентрациями исследуемых веществ; Однако в зависимости от типа эксперимента может потребоваться большее количество концентраций. Например, для дальномерного теста, который обычно проводится для определения окончательных тестовых концентраций химического вещества для эксперимента, рекомендуется восемь испытательных концентраций. Поскольку анализы жизнеспособности имеют разные конечные точки цитотоксичности, мы рекомендуем рассчитывать IC50 для каждого анализа, проводимого отдельно, чтобы выявить различия в чувствительности, вызванные различными механизмами действия химических веществ или различиями в чувствительности между клеточными линиями. Различия в значениях IC50 испытуемых химических веществ в разных клеточных линиях также могут варьироваться в зависимости от типа используемой питательной среды, поскольку различия в составе, связанные с белками и липидами, могут влиять на химическую биодоступность36. Кроме того, с помощью этих анализов можно оценить цитотоксичность многих химических веществ. IC50 других химических веществ, оцененных в клеточных линиях ZFL и ZEM2S, показан на рисунке 4B-H.
Рисунок 1: Схематический протокол анализов AB, CFDA-AM и NR, выполненных на одной и той же 96-луночной пластине. Сокращения: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = ацетоксиметиловый эфир диацетата 5-карбоксифлуоресцеина; NR = нейтральный красный; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Схематический протокол анализа МТТ, выполненного на 96-луночном планшете. Аббревиатура: МТТ = 3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные результаты анализов AB, CFDA-AM, NR и MTT. На изображениях показаны цветовые различия в лунках для контроля и тестовых концентраций в анализах (A) AB и CFDA-AM, (B) NR и (C) MTT. Сокращения: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = ацетоксиметиловый эфир диацетата 5-карбоксифлуоресцеина; NR = нейтральный красный; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; B = пустые колодцы (бесклеточные лунки); SC = контроль растворителя (0,5% ДМСО); NC = отрицательный контроль (клетки в питательной среде); ПК = положительный контроль (1% Triton X-100). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Расчет данных о жизнеспособности и жизнеспособности клеток для различных исследуемых химических веществ. Расчет жизнеспособности клеток с использованием данных считывания может быть выражен как процент (%) жизнеспособности клеток, относящийся к NC или SC (A). Цитотоксичность химического вещества может быть оценена с помощью данных о жизнеспособности для интерполяции стандартной кривой путем нелинейной регрессии для различных исследуемых химических веществ (B-H). Данные представлены в виде среднего значения жизнеспособности клеток (точки) и стандартного отклонения (бары) трех технических реплик и трех экспериментальных реплик (анализ AB). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: МТТ-анализ, проведенный в клетках ZFL и ZEM2S, культивируемых в присутствии (10%) и отсутствии (0%, полностью лишенных FBS) FBS в течение 24 ч. (A) Клетки ZFL при 0% и 10% FBS не показывают существенной разницы в жизнеспособности клеток по тесту Крускалла-Уоллиса (p = 0,2286). (B) Клетки ZEM2S при 0% и 10% FBS не показывают существенной разницы в жизнеспособности клеток по тесту Манна-Уитни (p = 0,3429). Рассмотрен уровень значимости p < 0,05. Данные выражаются в виде медианы и межквартильного диапазона трех технических реплик. Сокращения: н.с. = без существенной разницы; FBS = эмбриональная бычья сыворотка; МТТ = 3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Анализы MTT и NR, выполненные в клетках ZFL и ZEM2S, обработанных (24 часа) ДМСО в различных концентрациях (0,1%, 0,5% и 1%) и отрицательном контроле. Обработанные ДМСО клетки ZFL в любой тестируемой концентрации не показали существенной разницы в жизнеспособности клеток, связанной с NC, по анализу (A) MTT (p = 0,074) и (B) NR (p = 0,216). Обработанные ДМСО клетки ZEM2S не показали существенной разницы в жизнеспособности клеток, связанной с НК, по анализу (C) MTT (p = 0,422) и (D) NR (p = 0,287). Рассмотрен уровень значимости p < 0,05 в критерии Крускалла-Уоллиса. Данные выражаются в виде медианы и межквартильного диапазона трех технических реплик. Сокращения: н.с. = без существенной разницы; NC = отрицательный контроль; МТТ = 3-[4,5-диметилтиазол-2ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид; NR = нейтральный красный. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Таблица 1: Решения и носители, используемые в этом протоколе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализы цитотоксичности широко используются для оценки токсичности in vitro, и в этой протокольной статье представлены четыре широко используемых анализа цитотоксичности, модифицированных для проведения в клеточных линиях рыбок данио-рерио (т.е. плотность клеток для 96-луночного планшета, время инкубации в анализе МТТ, истощение FBS в условиях химического воздействия и максимально допустимая концентрация для СК). Поскольку эти анализы количественно определяют цитотоксичность по различным конечным точкам жизнеспособности клеток (метаболическая функция, целостность лизосомальной мембраны и целостность клеточной мембраны), их комбинация обеспечивает точную оценку химической цитотоксичности в клеточных линиях рыбок данио. Этот протокол также рекомендует культивирование клеточных линий ZFL и ZEM2S в состоянии, свободном от CO2, из-за их состава питательных сред, который может адекватно буферизовать культуральную систему, поддерживая pH на уровне 7,4 (физиологический pH). Состав питательной среды и среда, свободная от CO2, предложенные в этом протоколе для обеих клеточных линий, широко представлены в литературе. Клеточную линию ZFL обычно культивируют в средах L-15 и RPMI с добавлением или без добавления бикарбоната натрия и без CO2 37,38,39,40,41,42,43. Между тем, клеточная линия ZEM2S культивируется в соответствии с инструкциями биоресурсного центра, а ее питательные среды разрабатываются для культур, свободных от CO2; таким образом,СО2 и воздушная смесь могут быть вредными для клеток при использовании этого типа питательных сред44.
Химическое воздействие в культуральной среде без добавления FBS проводилось на основе опубликованных исследований, показывающих, что биодоступность химических веществ в анализах in vitro значительно зависит от их связывания с белками сыворотки. Например, Chen et al.45 показали, что присутствие сывороточных белков в анализе RTgill-W1 может снизить биодоступность катионного поверхностно-активного вещества (C12-бензалкония) до трех с половиной раз. Химическое вещество, связанное с FBS, обычно варьировалось от 47% до 90% в питательной среде45. Таким образом, чтобы избежать этой проблемы, мы оценивали клеточную жизнеспособность клеток ZFL и ZEM2S в культурах, полностью лишенных FBS в течение 24 ч, с помощью МТТ-анализа. Результаты не показали существенной разницы в жизнеспособности клеток от культур ZFL или ZEM2S с (10%) и без (0%) FBS, что указывает на то, что эти клеточные линии рыбок данио-рерио могут быть подвергнуты химической обработке в культуральных средах, лишенных FBS (рис. 5). Важно подчеркнуть, что уменьшение количества FBS может привести к другим последствиям в химической биодоступности. Например, липофильные химические вещества обладают более высокой сорбцией к пластиковой лабораторной посуде и пластинам, снижая химическую биодоступность36. Однако присутствие FBS в питательной среде может уменьшить пластическое связывание из-за того, что компоненты сыворотки конкурируют с пластиком за связывание с химическими веществами46. Наилучшее решение, связанное с процентным содержанием добавок FBS или их полным лишением, может зависеть от типа исследуемого химического вещества. Например, Pomponio et al.46 сообщили, что, хотя химическое вещество амиодарон имеет более высокое связывание с пластиком в отсутствие FBS, его биодоступность еще ниже при использовании 10% FBS. Для моно-N-дезэтиламиодарона почти одинаковое количество связывается со средой сыворотки и со стенками46.
Органические растворители (например, ДМСО) обычно рекомендуется использовать до 0,5% в анализах in vitro. Однако эта низкая концентрация может ухудшить тестирование более высоких концентраций плохо растворимых в воде химических веществ. Чтобы предотвратить эту проблему, мы оценили, подходят ли более высокие концентрации ДМСО для клеточных линий ZFL и ZEM2S, не превышающих порог цитотоксичности 10%. Для этого необработанные клетки (NC) и клетки, обработанные (24 часа) различными концентрациями ДМСО (0,1%, 0,5% и 1%), были обработаны для анализов MTT и NR. Результаты не показали существенной разницы в жизнеспособности клеток в группе лечения по сравнению с NC (рис. 6), что указывает на то, что в этих конкретных условиях можно использовать концентрации ДМСО до 1%. Другие клеточные линии рыб также поддерживают концентрацию ДМСО выше 0,5%, что не является особенностью клеточных линий ZFL и ZEM2S. Например, максимальные концентрации растворителя до 2% ДМСО (без цитотоксического эффекта) применялись в анализах цитотоксичности с использованием CHSE-214 (клеточная линия, полученная из эмбриона Oncorhynchus tshawytscha)47, RTG-2 (линия гонадных клеток Oncorhynchus mykiss)48,49,50 и PLHC-1 (клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы Poeciliopsis lucida)48 Клетки. Максимальная концентрация растворителя 1% ДМСО также использовалась в анализах цитотоксичности с использованием клеток RTL-W1 (линия гонадных клеток Oncorhynchus mykiss)51 и CCO (клеточная линия яичников Ictalurus punctatus)52. По данным Mori and Wakabayashi47, клеточные линии рыб могут иметь более низкую чувствительность к ДМСО, чем клеточные линии млекопитающих. Однако важно подчеркнуть, что максимально допустимая концентрация 1% ДМСО была определена исключительно для цитотоксичности, и это должно быть тщательно оценено для других конечных точек (например, генотоксичность, эпигенетика, анализ экспрессии генов, кодирующих белок) в клеточных линиях ZFL и ZEM2S.
Анализы МТТ и АБ основаны на метаболической активности для определения жизнеспособности клеток. Хотя анализ МТТ является наиболее часто используемым анализом жизнеспособности, по сравнению с анализом AB он может быть немного менее чувствительным, переоценивая жизнеспособность клеток в некоторых случаях53. Более высокая чувствительность анализа AB может быть связана с методом измерения, поскольку измерение флуоресценции более чувствительно, чем колориметрическое измерение15. Тем не менее, анализы AB и MTT являются высококачественными анализами для идентификации цитотоксических химических веществ, и полученные ими данные использовались для классификации опасных химических веществ в соответствии с их внутренним цитотоксическим потенциалом53.
Идея проведения анализа AB, CFDA-AM и NR на одной и той же пластине была основана на ОЭСР TG 249 (анализ RTgill-W1)17; Тем не менее, были внесены изменения для проведения этих анализов на 96-луночных планшетах, а также для того, чтобы они подходили для клеточных линий рыбок данио. Анализы на 96-луночных планшетах вместо 24-луночных планшетов могут быть полезны для высокопроизводительных тестов цитотоксичности в клеточных линиях рыб. Кроме того, в анализе RTgill-W1 используется только питательная среда L-15, в то время как клеточные линии ZFL и ZEM2S культивируют в среде, содержащей D-глюкозу. Питательная среда позволяет проводить анализ МТТ в этих клеточных линиях, поскольку клеточные линии, культивируемые в среде, свободной от глюкозы (например, только L-15), могут немедленно уменьшать снижение МТТ в клетках и ухудшать эффективность этого анализа54. Этот протокол позволяет легко проводить четыре различных анализа жизнеспособности в двух клеточных линиях рыбок данио.
Этот протокол может быть использован для изучения воздействия химических веществ на рыб с использованием моделей in vitro . Различные клеточные линии могут иметь разную чувствительность для оценки химических эффектов, даже если они принадлежат к одной и той же группе позвоночных, таких как рыба. Например, сравнивая клеточные линии ZFL и ZF4 с эмбрионами рыб, Langu-Mitea et al.21 продемонстрировали, что ZFL способен давать аналогичные результаты по сравнению с тестом на токсичность эмбрионов рыб. Tanneberger et al.5 показали, что постоянные клеточные линии рыб GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 и R1 имеют разную чувствительность в прогнозировании химической токсичности для рыб по сравнению с in vivo (взрослые рыбы). Несмотря на то, что RTgill-W1 (постоянная линия жаберных клеток рыб) была недавно утверждена в качестве альтернативного метода прогнозирования острой токсичности у рыб, следует изучить применимость других клеточных линий в исследованиях экотоксичности. Использование клеточных линий различных видов рыб и тканевого происхождения, а также стадий развития (ZEM2S: эмбрион; ZFL: взрослая печень) может внести значительный вклад в исследования экотоксичности, поскольку она может учитывать эффекты, связанные с конкретными стадиями развития рыб и органами-мишенями. Таким образом, химические эффекты должны быть исследованы с использованием различных клеточных культур, отражающих различные целевые участки у рыб (например, печень, гонады, жабры, мозг), а не только в одной клеточной линии55.
Эти протоколы могут иметь различное применение в исследованиях экотоксичности, и их использование не обязательно ограничивается прогнозированием острой токсичности рыб. Например, они могут быть применены для определения субцитотоксических концентраций для проведения других испытаний на токсичность рыб in vitro, таких как оценка эндокринно-разрушающего воздействия на рыбу. Кроме того, данные о цитотоксичности in vitro также могут помочь в разработке и улучшении физиологически обоснованного токсикокинетического (PBTK) моделирования. Поскольку PBTK фокусируется на распределении химического вещества в организме с учетом различных органов (таких как жабра, печень или кишечник)56, использование клеточных линий разных видов рыб и тканевого происхождения может быть полезным источником информации для этой модели. Результаты биопроб in vitro (например, анализов цитотоксичности) предоставляют входные данные, представляющие биологические процессы в модели PBTK, и способствуют экстраполяции in vitro в in vivo 21,56.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Памяти доктора Марсио Лоренчини, соавтора этой работы, выдающегося исследователя в области косметики и посвященного продвижению косметических исследований в Бразилии. Авторы выражают благодарность Многопользовательской лаборатории на кафедре физиологии (UFPR) за наличие оборудования и финансовую поддержку Координационного центра по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES, Бразилия) (Финансовый код 001) и Grupo Boticario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
References
- ECHA. Non-Animal Approaches-Current Status of Regulatory Applicability Under the REACH, CLP and Biocidal Products Regulations. ECHA. , Available at <87ebb68f-2038-f597-fc33-f4003e9e7d7d (2017).
- Alternative Methods Accepted by US Agencies. National Toxicology Program, and US Department of Health and Human Services. , Available from: https://ntp.niehs.nih.gov/whatwestudy/niceatm/accept-methods/index.html (2022).
- Schirmer, K. Proposal to improve vertebrate cell cultures to establish them as substitutes for the regulatory testing of chemicals and effluents using fish. Toxicology. 224 (3), 163-183 (2006).
- Scholz, S., et al. Alternatives to in vivo tests to detect endocrine disrupting chemicals (EDCs) in fish and amphibians-screening for estrogen, androgen and thyroid hormone disruption. Critical Reviews in Toxicology. 43 (1), 45-72 (2013).
- Tanneberger, K., et al. Predicting fish acute toxicity using a fish gill cell line-based toxicity assay. Environmental Science & Technology. 47 (2), 1110-1119 (2013).
- Roesler, R., Lorencini, M., Pastore, G. Brazilian cerrado antioxidant sources: cytotoxicity and phototoxicity in vitro. Food Science and Technology. 30, 814-821 (2010).
- Ruyra, A., et al. Zebrafish liver (ZFL) cells are able to mount an anti-viral response after stimulation with Poly (I:C). Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 182, 55-63 (2015).
- Natsch, A., Laue, H., Haupt, T., von Niederhäusen, V., Sanders, G. Accurate prediction of acute fish toxicity of fragrance chemicals with the RTgill-W1 cell assay. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (3), 931-941 (2018).
- Freshney, R. I.
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. European Journal of Biochemistry. 267 (17), 5421-5426 (2000).
- Gonzalez, R. J., Tarloff, J. B. Evaluation of hepatic subcellular fractions for Alamar blue and MTT reductase activity. Toxicology In Vitro. 15 (3), 257-259 (2001).
- Borenfreund, E., Puerner, J. A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicology Letters. 24 (2-3), 119-124 (1985).
- Repetto, G., del Peso, A., Zurita, J. L. Neutral red uptake assay for the estimation of cell viability/cytotoxicity. Nature Protocols. 3 (7), 1125-1131 (2008).
- Kamiloglu, S., Sari, G., Ozdal, T., Capanoglue, E. Guidelines for cell viability assays. Food Frontiers. 1 (3), 332-349 (2020).
- Water Quality-Determination of Acute Toxicity of Water Samples and Chemicals to a Fish Gill Cell Line (RTgill-W1) (ISO 21115:2019). International Organization for Standardization. , Available from: https://www.iso.org/standar/69933.html (2019).
- Organisation for Economic Co-operation and Development. Test Guideline No. 249: Fish Cell Line Acute Toxicity-The RTgill-W1 Cell Line Assay. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. Effects on Biotic Systems. , OECD Publishing. Paris. (2021).
- Lungu-Mitea, S., Lundqvist, J. Potentials and pitfalls of transient in vitro reporter bioassays: interference by vector geometry and cytotoxicity in recombinant zebrafish cell lines. Archives of Toxicology. 94 (8), 2769-2784 (2020).
- Lungu-Mitea, S., Han, Y., Lundqvist, J. Development, scrutiny, and modulation of transient reporter gene assays of the xenobiotic metabolism pathway in zebrafish hepatocytes. Cell Biology and Toxicology. , 1-23 (2021).
- Schirmer, K., Chan, A. G., Greenberg, B. M., Dixon, D. G., Bols, N. C. Methodology for demonstrating and measuring the photocytotoxicity of fluoranthene to fish cells in culture. Toxicology In Vitro. 11 (1-2), 107-119 (1997).
- Lungu-Mitea, S., et al. Modeling bioavailable concentrations in zebrafish cell lines and embryos increases the correlation of toxicity potencies across test systems. Environmental Science & Technology. 55 (1), 447-457 (2021).
- Cavalcante, D. G. S. M., et al. Cytotoxic, biochemical and genotoxic effects of biodiesel produced by different routes on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 28 (6), 1117-1125 (2014).
- Meng, Q., Yeung, K., Chan, K. M. Toxic effects of octocrylene on zebrafish larvae and liver cell line (ZFL). Aquatic Toxicology. 236, 105843 (2021).
- Kwok, M. L., Chan, K. M. Oxidative stress and apoptotic effects of copper and cadmium in the zebrafish liver cell line ZFL. Toxicology Reports. 7, 822-835 (2020).
- Yang, J., Chan, K. M. Evaluation of the toxic effects of brominated compounds (BDE-47, 99, 209, TBBPA) and bisphenol A (BPA) using a zebrafish liver cell line, ZFL. Aquatic Toxicology. 159, 138-147 (2015).
- Bradford, C. S., Sun, L., Collodi, P., Barnes, D. W. Cell cultures from zebrafish embryos and adult tissues. Journal of Tissue Culture Methods. 16 (2), 99-107 (1994).
- He, S., et al. Genetic and transcriptome characterization of model zebrafish cell lines. Zebrafish. 3 (4), 441-453 (2006).
- Mansoury, M., Hamed, M., Karmustaji, R., Al Hannan, F., Safrany, S. T. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochemistry and Biophysics Reports. 26, 100987 (2021).
- Funk, D., Schrenk, H. -H., Frei, E. Serum albumin leads to false-positive results in the XTT and the MTT assay. BioTechniques. 43 (2), 178 (2007).
- Dayeh, V. R., Bols, N. C., Tanneberger, K., Schirmer, K., Lee, L. E. J. The use of fish-derived cell lines for investigation of environmental contaminants: An update following OECD's fish toxicity testing framework no. 171. Current Protocols in Toxicology. 1, (2013).
- Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
- Ulukaya, E., Colakogullari, M., Wood, E. J. Interference by anti-cancer chemotherapeutic agents in the MTT-tumor chemosensitivity assay. Chemotherapy. 50 (1), 43-50 (2004).
- Sebaugh, J. L. Guidelines for accurate EC50/IC50 estimation. Pharmaceutical Statistics. 10 (2), 128-134 (2011).
- Weimer, M., et al. The impact of data transformations on concentration-response modeling. Toxicology Letters. 213 (2), 292-298 (2012).
- Green, J. W., Holbech, T. A., Henrik, Chapter 4: Analysis of Continuous Data (Regression). Statistical Analysis of Ecotoxicity Studies. , John Wiley & Sons, Inc. (2018).
- Proença, S., et al. Effective exposure of chemicals in in vitro cell systems: A review of chemical distribution models. Toxicology In Vitro. 73, 105133 (2021).
- Guidony, N. S., et al. ABC proteins activity and cytotoxicity in zebrafish hepatocytes exposed to triclosan. Environmental Pollution. 271, 116368 (2021).
- da Silva, N. D. G., et al. Interference of goethite in the effects of glyphosate and Roundup® on ZFL cell line. Toxicology In Vitro. 65, 104755 (2020).
- Yang, Y., et al. Temperature is a key factor influencing the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in fish cells. Experimental Parasitology. 217, 107966 (2020).
- Lopes, F. M., Sandrini, J. Z., Souza, M. M. Toxicity induced by glyphosate and glyphosate-based herbicides in the zebrafish hepatocyte cell line (ZF-L). Ecotoxicology and Environmental Safety. 162, 201-207 (2018).
- Lachner, D., Oliveira, L. F., Martinez, C. B. R. Effects of the water soluble fraction of gasoline on ZFL cell line: Cytotoxicity, genotoxicity and oxidative stress. Toxicology In Vitro. 30, 225-230 (2015).
- Morozesk, M., et al. Effects of multiwalled carbon nanotubes co-exposure with cadmium on zebrafish cell line: Metal uptake and accumulation, oxidative stress, genotoxicity and cell cycle. Ecotoxicology and Environmental Safety. 202, 110892 (2020).
- Dognani, G., et al. Nanofibrous membranes for low-concentration Cr VI adsorption: kinetic, thermodynamic and the influence on ZFL cells viability. Materials Research. , 24 (2021).
- ZEM2S (ATCC®CRL-2147™). American Type Culture Collection. , Available from: https://www.atcc.org/products/crl-2147 (2023).
- Chen, Y., et al. Acute toxicity of the cationic surfactant C12-benzalkonium in different bioassays: how test design affects bioavailability and effect concentrations. Environmental Toxicology and Chemistry. 33 (3), 606-615 (2014).
- Pomponio, G., et al. In vitro kinetics of amiodarone and its major metabolite in two human liver cell models after acute and repeated treatments. Toxicology In Vitro. 30, 36-51 (2015).
- Mori, M., Wakabayashi, M. Cytotoxicity evaluation of chemicals using cultured fish cells. Water Science and Technology. 42 (7-8), 277-282 (2000).
- Caminada, D., Escher, C., Fent, K. Cytotoxicity of pharmaceuticals found in aquatic systems: comparison of PLHC-1 and RTG-2 fish cell lines. Aquatic Toxicology. 79 (2), 114-123 (2006).
- Giltrap, M., et al. In vitro screening of organotin compounds and sediment extracts for cytotoxicity to fish cells. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (1), 154-161 (2011).
- Hollert, H., Duerr, M., Erdinger, L., Braunbeck, T. Cytotoxicity of settling particulate matter and sediments of the Neckar River (Germany) during a winter flood. Environmental Toxicology and Chemistry. 19 (3), 528-534 (2000).
- Pannetier, P., et al. Toxicity assessment of pollutants sorbed on environmental sample microplastics collected on beaches: Part I-adverse effects on fish cell line. Environmental Pollution. 248, 1088-1097 (2019).
- Ternjej, I., Srček, V. G., Mihaljević, Z., Kopjar, N. Cytotoxic and genotoxic effects of water and sediment samples from gypsum mining area in channel catfish ovary (CCO) cells. Ecotoxicology and Environmental Safety. 98, 119-127 (2013).
- Hamid, R., Rotshteyn, Y., Rabadi, L., Parikh, R., Bullock, P. Comparison of alamar blue and MTT assays for high throughput screening. Toxicology In Vitro. 18 (5), 703-710 (2004).
- Vistica, D. T., et al. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production. Cancer Research. 51 (10), 2515-2520 (1991).
- Knauer, K., Lampert, C., Gonzalez-Valero, J. Comparison of in vitro and in vivo acute fish toxicity in relation to toxicant mode of action. Chemosphere. 68 (8), 1435-1441 (2007).
- Stadnicka-Michalak, J., Tanneberger, K., Schirmer, K., Ashauer, R. Measured and modeled toxicokinetics in cultured fish cells and application to in vitro-in vivo toxicity extrapolation. PLoS One. 9 (3), 92303 (2014).
