Summary
Este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad de uso común (ensayos Alamar Blue [AB], CFDA-AM, Neutral Red y MTT) adaptados para la evaluación de la citotoxicidad en líneas celulares de embrión de pez cebra (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos.
Abstract
Las líneas celulares de peces se han utilizado cada vez más en estudios de ecotoxicidad, y los ensayos de citotoxicidad se han propuesto como métodos para predecir la toxicidad aguda de los peces. Por lo tanto, este protocolo presenta ensayos de citotoxicidad modificados para evaluar la viabilidad celular en líneas celulares de embrión de pez cebra (Danio rerio) (ZEM2S) e hígado (ZFL) en placas de 96 pocillos. Los criterios de valoración de citotoxicidad evaluados son la integridad mitocondrial (ensayos Alamar Blue [AB] y MTT), la integridad de la membrana a través de la actividad de la esterasa (ensayo CFDA-AM) y la integridad de la membrana lisosomal (ensayo Neutral Red [NR]). Después de la exposición de las sustancias de ensayo en una placa de 96 pocillos, se realizan los ensayos de citotoxicidad; aquí, AB y CFDA-AM se llevan a cabo simultáneamente, seguidos de NR en la misma placa, mientras que el ensayo MTT se realiza en una placa separada. Las lecturas para estos ensayos se toman por fluorescencia para AB y CFDA-AM, y absorbancia para MTT y NR. Los ensayos de citotoxicidad realizados con estas líneas celulares de peces se pueden utilizar para estudiar la toxicidad aguda de sustancias químicas en peces.
Introduction
Las sustancias químicas deben ser probadas en cuanto a su seguridad para la salud humana y el medio ambiente. Los biomarcadores moleculares y celulares se han considerado cada vez más en las evaluaciones de seguridad para predecir los efectos en los organismos vivos por parte de las agencias reguladoras y/o legislaciones (por ejemplo, REACH, OCDE, US EPA)1,2, ya que pueden preceder al resultado adverso in vivo (por ejemplo, alteración endocrina, respuesta inmunológica, toxicidad aguda, fototoxicidad)3,4,5,6,7 . En este contexto, la citotoxicidad ha sido tomada como medida para predecir la toxicidad aguda de los peces 5,8; Sin embargo, puede tener muchas otras aplicaciones en estudios de ecotoxicidad, como la definición de concentraciones subcitotóxicas de sustancias químicas para estudiar su conjunto más diverso de efectos en los peces (por ejemplo, efectos de alteración endocrina).
En los sistemas de cultivo celular (sistemas in vitro ), la citotoxicidad de las sustancias químicas puede determinarse mediante métodos que difieren en los tipos de criterios de valoración. Por ejemplo, un método de citotoxicidad puede basarse en un punto final relacionado con la morfología específica observada durante el proceso de muerte celular, mientras que otro puede determinar la citotoxicidad mediante la medición de la muerte celular, la viabilidad y funcionalidad, la morfología, el metabolismo energético y la unión y proliferación celular. Las sustancias químicas pueden afectar la viabilidad celular a través de diferentes mecanismos, por lo que la evaluación de la citotoxicidad que cubre diferentes criterios de valoración de la viabilidad celular es necesaria para predecir los efectos químicos9.
MTT y Alamar Blue (AB) son ensayos que determinan los efectos sobre la viabilidad celular en función de la actividad metabólica celular. El ensayo MTT evalúa la actividad de la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa10. La reducción del bromuro amarillento de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a azul de formazán ocurre solo en células viables, y su densidad óptica es directamente proporcional al número de células viables10. El ensayo AB es un indicador sensible de oxidación-reducción, mediado por enzimas mitocondriales que emiten fluorescencia y cambian de color al reducir la resazurina a resorufina por las células vivas11; sin embargo, las enzimas citosólicas y microsomales también contribuyen a la reducción de AB y MTT12. Estas enzimas pueden incluir varias reductasas, como alcohol y aldehído oxidorreductasas, NAD(P)H: quinona oxidorreductasa, flavina reductasa, NADH deshidrogenasa y citocromos11.
El ensayo Neutral Red (NR) es un ensayo de viabilidad celular basado en la incorporación de este colorante en los lisosomas de células viables13. La absorción de NR depende de la capacidad de las células para mantener gradientes de pH. El gradiente de protones dentro de los lisosomas mantiene un pH más bajo que el citoplasma. A pH fisiológico normal, el NR presenta una carga neta de aproximadamente cero, lo que le permite penetrar en las membranas celulares. Por lo tanto, el tinte se carga y se retiene dentro de los lisosomas. En consecuencia, cuanto mayor es la cantidad de NR retenida, mayor es el número de células viables14. Las sustancias químicas que dañan la superficie celular o las membranas lisosomales perjudican la absorción de este colorante.
El ensayo CFDA-AM es un ensayo de viabilidad celular fluorométrica basado en la retención de éster acetoxymetilo de diacetato de 5-carboxifluoresceína (CFDA-AM)15. La 5-CFDA-AM, sustrato de esterasa, se convierte en carboxifluoresceína, sustancia fluorescente que es polar y no permeable por las membranas de las células vivas15; Por lo tanto, se retiene en el lado interno de una membrana celular intacta, lo que indica células viables.
Recientemente, se combinaron tres ensayos de citotoxicidad (ensayos CFDA-AM, NR y AB) en una guía ISO (Organización Internacional de Normalización) validada (ISO 21115: 2019)16 y un método de prueba de la OCDE (Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos) (OCDE TG 249) para evaluar la toxicidad aguda de los peces utilizando la línea celular RTgill-W1 (línea celular permanente de trucha arco iris [Oncorhynchus mykiss] branquia) en placas de 24 pocillos17 . Aunque existe un método basado en células para predecir la toxicidad aguda de los peces, se han invertido esfuerzos en desarrollar métodos similares con otras especies de peces y aumentar el rendimiento del método. Algunos ejemplos incluyen el desarrollo de líneas celulares ZFL transfectadas con genes reporteros para vías de toxicidad específicas18,19, pruebas de fototoxicidad en la línea celular RTgill-W1 20, y el uso de líneas celulares ZFL y ZF4 (fibroblástico de pez cebra derivado de embriones de 1 día de edad) para evaluar la toxicidad mediante varios ensayos de citotoxicidad21.
Danio rerio (pez cebra) es una de las principales especies de peces utilizadas en estudios de toxicidad acuática; Por lo tanto, los métodos basados en células con líneas celulares de pez cebra para pruebas de toxicidad de peces pueden ser extremadamente útiles. La línea celular ZFL es una línea celular de hepatocitos epiteliales de pez cebra que presenta las principales características de las células del parénquima hepático y puede metabolizar xenobióticos 7,22,23,24,25. Mientras tanto, la línea celular ZEM2S es una línea celular fibroblástica embrionaria de pez cebra derivada de la etapa de blástula que puede usarse para investigar los efectos del desarrollo en peces26,27. Por lo tanto, este protocolo describe cuatro ensayos de citotoxicidad (ensayos MTT, AB, NR y CFDA-AM), con modificaciones que se realizarán con líneas celulares ZFL y ZEM2S en placas de 96 pocillos.
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Protocol
NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener la lista de materiales utilizados en este protocolo y la Tabla 1 para la composición de soluciones y medios utilizados en este protocolo.
1. Preparación de células ZFL y ZEM2S
- Comenzar con un matraz T75 de células ZFL o ZEM2S con 80% de confluencia, cultivadas en el medio completo respectivo a 28 °C sinCO2.
- Retirar el medio de cultivo del matraz y lavar las células añadiendo 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,01 M). Añadir 3 ml de tripsina 1x (0,05% v/v; 0,5 mM tripsina-EDTA) a los matraces de cultivo. Incubar a 28 °C durante 3 min.
- Golpee suavemente el matraz para liberar las células y luego detenga la digestión de tripsina agregando 3 ml de medio de cultivo completo al matraz.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrifuga a 100 × g durante 5 min.
- Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante, agregue 1 ml de medio completo para células ZFL o ZEM2S y vuelva a suspender el pellet con una micropipeta.
2. Conteo celular por exclusión del colorante azul de tripano
- Agregue 10 μL de la suspensión celular y 10 μL de colorante azul de tripano a un microtubo para contar las células y evaluar su viabilidad. Mezclar la suspensión celular y el tinte con una pipeta.
- Luego, transfiera 10 μL de esta mezcla (suspensión celular + azul de tripano) a una cámara de Neubauer y cuente las celdas en los cuatro cuadrados grandes (cuadrantes Q) colocados en las esquinas de la cámara, considerando que las células viables son aquellas que no absorben azul de tripano. Determina el número de celdas viables usando la ecuación (1):
(1) - Calcule el número de celda final en la suspensión celular multiplicando el número de celdas determinado usando la ecuación (1) por dos (el factor de dilución debido al uso de azul de tripano).
NOTA: Alternativamente, se puede utilizar un sistema automatizado de recuento celular (por ejemplo, un citómero con función de recuento celular y viabilidad).
(1)3. Recubrimiento celular en placas de 96 pocillos
- Calcular el volumen de suspensión celular necesario para obtener el número de células necesarias para realizar los ensayos de citotoxicidad. El número de células viables para cada línea celular se indica a continuación:
- Placa 60.000 células ZEM2S viables por pocillo; por lo tanto, para toda la placa, use seis millones de células en 20 ml de medio completo (200 μL / pocillo, placa de 96 pocillos).
- Placa 40.000 células ZFL viables por pozo; por lo tanto, para toda la placa, use cuatro millones de células en 20 ml de medio completo (200 μL / pocillo, placa de 96 pocillos).
- Después de eso, transfiera el volumen respectivo de la suspensión celular a un depósito de reactivo (estéril) y llénelo con el medio de cultivo completo para ZFL o ZEM2S a 20 ml. Con una pipeta multicanal, mezcle la solución suavemente hacia arriba y hacia abajo.
NOTA: Tenga cuidado de no formar espuma o burbujas. - Añadir 200 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa transparente de poliestireno de 96 pocillos utilizando la micropipeta multicanal. Incubar las placas a 28 °C durante 24 h.
NOTA: La placa debe tener al menos tres pocillos sin celdas para el control en blanco, y solo se deben agregar medios completos a estos pocillos. El efecto borde (causado por una mayor evaporación en los pocillos de borde) ocurre comúnmente en ensayos de placas de 96 pocillos y puede afectar la viabilidad de las células en los pocillos de borde de la placa28. Este efecto puede ser mayor o menor dependiendo de la marca y el diseño de la placa de 96 pocillos28. Aunque no notamos ninguna alteración del crecimiento celular / viabilidad para ZFL y ZEM2S en los pozos de borde, sugerimos sellar la placa con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar este efecto, o cultivar las células solo en los 60 pozos interiores y llenar los pozos de borde con PBS.
4. Exposición de las células a la sustancia de ensayo
- Deseche cuidadosamente los medios gastados de los pocillos utilizando una micropipeta multicanal.
- Exponga las células para probar sustancias químicas en diferentes concentraciones. Preparar las soluciones de las concentraciones químicas de ensayo en los medios de cultivo para ZFL o ZEM2S sin suero fetal bovino (FBS) (medios de exposición). Luego, agregue 100 μL por pocillo de estas soluciones en triplicado técnico (es decir, tres pocillos/concentración química de prueba).
- Para los controles, coloque los grupos de control en la misma placa que la sustancia problema en triplicados técnicos (tres pocillos/grupo de control). Por lo tanto, para el control en blanco (B), agregue 100 μL de los medios de exposición en los pocillos libres de células, para el control negativo (NC), agregue 100 μL del medio de exposición a los pocillos con células, y para el control positivo (PC), exponga las células a una solución de Triton X-100 al 1% preparada en el medio de exposición. En algunos casos, se debe incluir un control de disolvente (SC) en la placa, considerando una concentración claramente no citotóxica como concentración final de disolvente.
NOTA: Se recomienda utilizar DMSO al 0,5% como disolvente; El DMSO se puede utilizar hasta un 1% como disolvente en estas líneas celulares sin exceder el umbral de citotoxicidad del 10% relacionado con el control negativo. - Incubar las placas a 28 °C durante 24 h. Selle las placas con parafilm o lámina de sellado adhesiva para evitar la evaporación del medio de cultivo.
NOTA: Ciertos productos químicos pueden tener absorbancia de fondo intrínseca o fluorescencia que puede interferir con la absorbancia o fluorescencia de los colorantes indicadores (por ejemplo, los compuestos con color pueden influir en la absorbancia, la albúmina sérica29 y los compuestos que interfieren con las enzimas reductoras30,31). En este caso, la placa debe incluir un control adicional mediante la adición de soluciones químicas de prueba en los pocillos sin células. Esto es para verificar la posible interferencia de la auto-absorbancia química / autofluorescencia con los tintes. Si se detecta interferencia, se debe evaluar si se puede excluir para obtener una predicción correcta de la citotoxicidad.
5. Ensayos de citotoxicidad
NOTA: Prepare todas las soluciones de acuerdo con la Tabla 1. Todos los pasos descritos a continuación (Figura 1) se llevan a cabo en condiciones estériles. No se recomienda el uso de una pipeta para desechar los medios de exposición, ya que las células pueden desprenderse fácilmente de los pocillos después del tratamiento químico.
- Ensayos AB y CFDA-AM
- Después de 24 h de exposición química de prueba, deseche cuidadosamente los medios de exposición vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.
- Lave el plato con 200 μL de PBS. Retire con cuidado el PBS vertiéndolo en una bandeja de recolección para evitar la pérdida de células.
- Añadir 100 μL por pocillo de solución AB/CFDA-AM. Incubar la placa durante 30 minutos en la oscuridad a 28 °C.
- Mida la fluorescencia en un lector de placas de fluorescencia a 530 nm (excitación) y 595 nm (emisión) para AB, y a 493 nm (excitación) y 541 nm (emisión) para CFDA-AM.
- Ensayo NR
NOTA: Los pasos para el ensayo NR se llevan a cabo inmediatamente después de los ensayos AB y CFDA-AM (Figura 1).- Centrifugar la solución de trabajo NR (40 μg/ml) a 600 × g durante 10 min.
NOTA: La precipitación de NR en el tubo no debe transferirse a las placas. Por lo tanto, después de la centrifugación de la solución de trabajo NR, recoger el sobrenadante con una pipeta sin aspirar los precipitados NR. Transfiera el sobrenadante a un depósito de reactivo. - Retire con cuidado la solución AB/CFDA-AM vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.
- Añadir 100 μL por pocillo de la solución de trabajo NR utilizando una micropipeta multicanal. Incubar la placa a 28 °C durante 3 h.
NOTA: Después de la incubación de 3 h, observe si se produjo precipitación de NR en las placas con un microscopio. Los precipitados de NR pueden interferir con la cuantificación de la viabilidad celular, por lo tanto, no deben estar presentes. - Retire con cuidado la solución NR vertiendo el contenido en una bandeja de recolección. Lave los pocillos agregando 150 μL de PBS por pocillo.
- Añadir 150 μL por pocillo de la solución de extracción NR e incubar la placa en un agitador de placas durante 10 minutos para agitar suavemente. Mida la absorbancia a 540 nm en un lector de placas.
NOTA: Se debe realizar una segunda lectura a 690 nm para excluir cualquier absorbancia de huellas dactilares de fondo en la placa.
- Centrifugar la solución de trabajo NR (40 μg/ml) a 600 × g durante 10 min.
- Ensayo MTT
NOTA: El ensayo MTT debe realizarse por separado de los ensayos descritos anteriormente (en una placa nueva) (Figura 2).- Retire con cuidado los medios de exposición vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.
- Añadir 100 μL de solución de trabajo MTT por pocillo utilizando una micropipeta multicanal. Incubar la placa a 28 °C durante 4 h.
- Deseche la solución MTT vertiendo el contenido en una bandeja de recolección.
- Añadir 100 μL por pocillo de DMSO para extraer los cristales de formazan, incubando la placa en un agitador de placas durante 10 min. Mida la absorbancia a 570 nm utilizando un lector de placas.
NOTA: Se debe realizar una segunda lectura a 690 nm para excluir cualquier absorbancia de huellas dactilares de fondo en la placa. Es importante señalar que los productos químicos de ensayo pueden interferir con el MTT, que debe ser evaluado para garantizar la calidad de los datos generados32. Para ello, se deben exponer pocillos libres de células que contengan las concentraciones de prueba y MTT (0,5 mg / ml), seguidos de incubación para observar cualquier cambio de color en los pocillos que pueda aumentar la absorbancia y conducir a resultados de viabilidad falsos. Los productos químicos que interactúan con MTT deben evitarse en esta prueba.
6. Cálculo de la viabilidad celular/citotoxicidad
NOTA: La absorbancia bruta o fluorescencia adquirida se utiliza para calcular la viabilidad celular como un porcentaje relacionado con el control negativo (para sustancias de ensayo preparadas directamente en medios de exposición) o el control de disolventes (para sustancias químicas de ensayo preparadas con disolventes, como el DMSO). Antes de determinar el porcentaje de viabilidad celular, los datos sin procesar deben ser normalizados por el control en blanco.
- Calcular la absorbancia o fluorescencia media para cada concentración química de ensayo y grupo de control (tres pocillos/tratamiento).
- Para determinar el porcentaje de viabilidad celular en relación con el control (negativo o solvente), use la ecuación (2):
(2)
NOTA: Las unidades de absorbancia (abs) o fluorescencia (fluo) representan la media de absorbancia o fluorescencia medida en los tres pocillos por concentración; El blanco representa pozos sin celdas.
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Representative Results
La figura 3 muestra las placas de los ensayos AB, CFDA-AM, NR y MTT. Para el ensayo AB (Figura 3A), los pocillos en blanco y los pocillos sin células viables o con un número reducido de ellas muestran color azul y baja fluorescencia, mientras que los pocillos con un alto número de células viables son rosados y presentan altos valores de fluorescencia debido a la transformación de resazurina (AB) en resorufina (sustancia rosada) por las células viables. Para el ensayo CFDA-AM, no hay diferencia visible en el color de los pocillos en la placa; sin embargo, la fluorescencia es mayor en pocillos que contienen células viables debido a la retención de CFDA-AM y la posterior conversión en carboxifluoresceína (sustancia fluorescente).
Para el ensayo NR (Figura 3B), los pocillos en blanco deben ser transparentes con valores de absorbancia muy bajos, ya que no hay células para retener el colorante NR. En algunos casos, los pocillos en blanco no son transparentes, lo que indica la ocurrencia de precipitación de NR en la placa; En este caso, esto no debe considerarse un experimento válido. Las concentraciones altamente citotóxicas de los productos químicos de ensayo y PC son transparentes o presentan un color rosa muy claro con bajos valores de absorbancia, mientras que los pocillos que contienen células viables retienen el colorante NR y presentan un color rosa oscuro y altos valores de absorbancia.
Para el ensayo MTT (Figura 3C), los pocillos en blanco deben ser transparentes y con muy baja absorbancia, ya que no hay células para convertir MTT en formazan. Las concentraciones altamente citotóxicas de los productos químicos de ensayo y PC son transparentes o presentan un color violeta muy claro con bajos valores de absorbancia, mientras que los pocillos que contienen células viables transforman el MTT (amarillo) en formazan (sustancia violeta), presentando un color violeta más oscuro con altos valores de absorbancia.
La Figura 4A muestra un gráfico representativo de la viabilidad celular después del cálculo, utilizando los promedios de los valores de fluorescencia o absorbancia por grupo. El gráfico se puede trazar con la entrada de valores porcentuales de viabilidad, calculados mediante la fórmula de cálculo de viabilidad presentada en la sección 6 del protocolo, utilizando software de análisis de datos. La viabilidad de las células expuestas al SC no debe ser un 10% inferior a la del NC17. El porcentaje de viabilidad celular para los productos químicos de prueba se calcula en relación con el NC o SC, dependiendo de su solubilidad. En este caso, se utilizan diferentes concentraciones de DMSO como sustancia de ensayo y la viabilidad celular está relacionada con NC, que se define como 100% de viabilidad.
Los datos de viabilidad celular pueden utilizarse para calcular la concentración inhibitoria máxima media de los productos químicos de ensayo (IC50) mediante transformación logarítmica, y la curva estándar interpolada mediante regresión no lineal después de réplicas apropiadas33,34,35. La Figura 4B muestra el IC50, calculado a partir del porcentaje de viabilidad que se muestra en la Figura 4A. El IC50 se obtuvo con al menos tres réplicas técnicas y tres réplicas experimentales utilizando concentraciones nominales en el ensayo AB. Los análisis se realizaron con cinco concentraciones diferentes de las sustancias de ensayo; sin embargo, puede ser necesario un mayor número de concentraciones dependiendo del tipo de experimento. Por ejemplo, se recomiendan ocho concentraciones de prueba para la prueba de determinación del rango, que generalmente se realiza para determinar las concentraciones finales de prueba de una sustancia química para un experimento. Como los ensayos de viabilidad tienen diferentes criterios de valoración de citotoxicidad, recomendamos calcular el IC50 para cada ensayo realizado por separado para identificar diferencias en la sensibilidad causadas por diferentes mecanismos de acción de las sustancias químicas o diferencias en la sensibilidad entre líneas celulares. Las diferencias en los valores de IC50 de los productos químicos probados en diferentes líneas celulares también pueden variar dependiendo del tipo de medio de cultivo utilizado, ya que las diferencias en la composición relacionadas con proteínas y lípidos pueden afectar la biodisponibilidad química36. Además, la citotoxicidad de muchos productos químicos se puede evaluar a través de estos ensayos. El IC50 de otros productos químicos evaluados en líneas celulares ZFL y ZEM2S se muestra en la Figura 4B-H.
Figura 1: Protocolo esquemático de los ensayos AB, CFDA-AM y NR realizados en la misma placa de 96 pocillos. Abreviaturas: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxifluoresceína diacetato acetoxymethyl ester; NR = Rojo neutro; PBS = solución salina tamponada con fosfato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Protocolo esquemático del ensayo MTT realizado en una placa de 96 pocillos. Abreviatura: MTT = bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de los ensayos AB, CFDA-AM, NR y MTT. Las imágenes muestran las diferencias de color en los pocillos para controles y concentraciones de prueba en (A) AB y CFDA-AM, (B) NR y (C) ensayos MTT. Abreviaturas: AB = Alamar Blue; CFDA-AM = 5-carboxifluoresceína diacetato acetoxymethyl ester; NR = Rojo neutro; PBS = solución salina tamponada con fosfato; B = pocillos en blanco (pocillos libres de células); SC = control con disolventes (0,5% DMSO); NC = control negativo (células en medio de cultivo); PC = control positivo (1% Triton X-100). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cálculo de la viabilidad celular y los datos de viabilidad para diferentes productos químicos de ensayo. El cálculo de la viabilidad celular utilizando los datos de lectura puede expresarse como el porcentaje (%) de viabilidad celular relacionada con el NC o SC (A). La citotoxicidad de una sustancia química puede evaluarse utilizando los datos de viabilidad para interpolar una curva estándar mediante regresión no lineal para diferentes sustancias de ensayo (B-H). Los datos se representan como media de viabilidad celular (puntos) y desviación estándar (barras) de tres réplicas técnicas y tres réplicas experimentales (ensayo AB). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ensayo MTT realizado en células ZFL y ZEM2S cultivadas en presencia (10%) y ausencia (0%, completamente privado de FBS) de FBS durante 24 h. (A) Las células ZFL al 0% y al 10% de FBS no muestran diferencias significativas en la viabilidad celular mediante la prueba de Kruskall-Wallis (p = 0,2286). (B) Las células ZEM2S al 0% y al 10% FBS no muestran diferencias significativas en la viabilidad celular según la prueba de Mann-Whitney (p = 0,3429). Se consideró un nivel de significancia de p < 0,05. Los datos se expresan como mediana y rango intercuartil de tres réplicas técnicas. Abreviaturas: n.s. = sin diferencia significativa; FBS = suero fetal bovino; MTT = bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Ensayos MTT y NR realizados en células ZFL y ZEM2S tratadas (24 h) con DMSO a diferentes concentraciones (0,1%, 0,5% y 1%) y control negativo. Las células ZFL tratadas con DMSO en cualquier concentración probada no mostraron una diferencia significativa en la viabilidad celular relacionada con NC por el ensayo (A) MTT (p = 0.074) y (B) ensayo NR (p = 0.216). Las células ZEM2S tratadas con DMSO no mostraron una diferencia significativa en la viabilidad celular relacionada con NC por el ensayo (C) MTT (p = 0,422) y (D) ensayo NR (p = 0,287). Se consideró un nivel de significancia de p < 0,05 en la prueba de Kruskall-Wallis. Los datos se expresan como mediana y rango intercuartil de tres réplicas técnicas. Abreviaturas: n.s. = sin diferencia significativa; NC = control negativo; MTT = bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2il]-2,5-difeniltetrazolio; NR = Rojo neutro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Soluciones y medios utilizados en este protocolo. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Los ensayos de citotoxicidad son ampliamente utilizados para la evaluación de toxicidad in vitro, y este artículo del protocolo presenta cuatro ensayos de citotoxicidad comúnmente utilizados modificados para ser realizados en líneas celulares de pez cebra (es decir, densidad celular para placa de 96 pocillos, tiempo de incubación en el ensayo MTT, agotamiento de FBS durante la condición de exposición química y concentración máxima aceptable para el SC). Como estos ensayos cuantifican la citotoxicidad por diferentes criterios de valoración de viabilidad celular (función metabólica, integridad de la membrana lisosomal e integridad de la membrana celular), la combinación de los mismos proporciona una evaluación precisa de la citotoxicidad química en líneas celulares de pez cebra. Este protocolo también recomienda el cultivo de líneas celulares ZFL y ZEM2S en una condición libre deCO2, debido a su composición de medios de cultivo que pueden amortiguar adecuadamente el sistema de cultivo, manteniendo el pH a 7.4 (pH fisiológico). La composición de los medios de cultivo y el ambiente libre deCO2 propuesto en este protocolo para ambas líneas celulares son ampliamente reportados en la literatura. La línea celular ZFL generalmente se cultiva en medios L-15 y RPMI con o sin la adición de bicarbonato de sodio y sin CO2 37,38,39,40,41,42,43. Mientras tanto, la línea celular ZEM2S se cultiva de acuerdo con las instrucciones del centro de recursos biológicos, y sus medios de cultivo están formulados para cultivos libres deCO2; por lo tanto, la mezcla deCO2 y aire puede ser perjudicial para las células cuando se utiliza este tipo de medios de cultivo44.
La exposición química en un medio de cultivo sin agregar FBS se realizó en base a estudios publicados, que muestran que la biodisponibilidad de las sustancias químicas en ensayos in vitro se ve significativamente afectada por su unión a las proteínas séricas. Por ejemplo, Chen et al.45 demostraron que la presencia de proteínas séricas en el ensayo RTgill-W1 podría reducir la biodisponibilidad de un tensioactivo catiónico (C12-benzalconio) hasta tres veces y media. El producto químico unido a FBS generalmente varió de 47% a 90% en el medio de cultivo45. Por lo tanto, para evitar este problema, evaluamos la viabilidad celular de las células ZFL y ZEM2S en cultivos completamente privados de FBS durante 24 h utilizando el ensayo MTT. Los resultados no mostraron diferencias significativas en la viabilidad celular de cultivos ZFL o ZEM2S con (10%) y sin (0%) FBS, lo que indica que estas líneas celulares de pez cebra pueden ser sometidas a tratamiento químico en medios de cultivo privados de FBS (Figura 5). Es importante destacar que disminuir la cantidad de FBS podría causar otras consecuencias en la biodisponibilidad química. Por ejemplo, los productos químicos lipofílicos tienen mayor sorción a los materiales de laboratorio y placas de plástico, reduciendo la biodisponibilidad química36. Sin embargo, la presencia de FBS en el medio de cultivo puede disminuir la unión plástica debido a los constituyentes del suero que compiten con el plástico para unirse a los productos químicos46. La mejor decisión relacionada con el porcentaje de suplementación con FBS o su privación completa podría depender del tipo de sustancia química de prueba. Por ejemplo, Pomponio et al.46 informaron que aunque la amiodarona química tiene una mayor unión al plástico en ausencia de FBS, su biodisponibilidad es aún menor cuando se usa FBS al 10%. Para la mono-N-desetilamidorona, casi la misma cantidad se une al medio sérico y a las paredes46.
Por lo general, se recomienda el uso de disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO) hasta un 0,5% en ensayos in vitro. Sin embargo, esta baja concentración puede afectar las pruebas de concentraciones más altas de productos químicos pobres solubles en agua. Para evitar este problema, evaluamos si las concentraciones más altas de DMSO eran adecuadas para las líneas celulares ZFL y ZEM2S que no excedían el umbral de citotoxicidad del 10%. Para ello, se procesaron células no tratadas (NC) y células tratadas (24 h) con diferentes concentraciones de DMSO (0,1%, 0,5% y 1%) para los ensayos MTT y NR. Los resultados no mostraron diferencias significativas en la viabilidad celular del grupo de tratamiento en comparación con las NC (Figura 6), lo que indica que, en estas condiciones particulares, se pueden usar concentraciones de DMSO de hasta el 1%. Otras líneas celulares de peces también admiten concentraciones de DMSO superiores al 0,5%, lo que no es una particularidad de las líneas celulares ZFL y ZEM2S. Por ejemplo, se han aplicado concentraciones máximas de disolventes de hasta 2% de DMSO (sin efecto citotóxico observado) en ensayos de citotoxicidad utilizando CHSE-214 (línea celular derivada del embrión de Oncorhynchus tshawytscha)47, RTG-2 (línea celular gonadal de Oncorhynchus mykiss)48,49,50 y PLHC-1 (línea celular de carcinoma hepatocelular de Poeciliopsis lucida)48 células. La concentración máxima de disolvente de 1% DMSO también se ha utilizado en ensayos de citotoxicidad utilizando células RTL-W1 (Oncorhynchus mykiss gonadal cell line)51 y CCO (Ictalurus punctatus ovary cell line)52. Según Mori y Wakabayashi47, las líneas celulares de peces pueden tener una menor sensibilidad al DMSO que las líneas celulares de mamíferos. Sin embargo, es importante destacar que la concentración máxima aceptable de DMSO al 1% se definió exclusivamente para la citotoxicidad, y esto debe evaluarse cuidadosamente para otros puntos finales (por ejemplo, genotoxicidad, epigenética, análisis de expresión génica codificante de proteínas) en líneas celulares ZFL y ZEM2S.
Los ensayos MTT y AB se basan en la actividad metabólica para determinar la viabilidad celular. Aunque el ensayo MTT es el ensayo de viabilidad más utilizado, en comparación con el ensayo AB puede ser ligeramente menos sensible, sobreestimando la viabilidad celular en algunos casos53. La mayor sensibilidad del ensayo AB puede estar relacionada con el método de medición, ya que la medición de fluorescencia es más sensible que la medición colorimétrica15. No obstante, tanto los ensayos AB como MTT son ensayos de alta calidad para identificar sustancias químicas citotóxicas, y sus datos generados se han utilizado para clasificar sustancias químicas peligrosas de acuerdo con su potencial citotóxico intrínseco53.
La idea de realizar el ensayo AB, CFDA-AM y NR en la misma placa se basó en el TG 249 de la OCDE (ensayo RTgill-W1)17; Sin embargo, se realizaron modificaciones para realizar estos ensayos en placas de 96 pocillos, así como para ser adecuados para líneas celulares de pez cebra. Los ensayos en placas de 96 pocillos, en lugar de placas de 24 pocillos, pueden ser ventajosos para pruebas de citotoxicidad de alto rendimiento en líneas celulares de peces. Además, el ensayo RTgill-W1 utiliza solo medio de cultivo L-15, mientras que las líneas celulares ZFL y ZEM2S se cultivan en un medio que contiene D-glucosa. El medio de cultivo permite realizar el ensayo MTT en estas líneas celulares, ya que las líneas celulares cultivadas en medio libre de glucosa (por ejemplo, sólo L-15) pueden disminuir inmediatamente la reducción de MTT en las células y perjudicar el rendimiento de este ensayo54. Este protocolo permite realizar fácilmente cuatro ensayos de viabilidad diferentes en dos líneas celulares de pez cebra.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar los efectos de las sustancias químicas en los peces mediante el uso de modelos in vitro . Diferentes líneas celulares pueden tener diferentes sensibilidades para estimar los efectos químicos, a pesar de que son del mismo grupo de vertebrados, como los peces. Por ejemplo, comparando líneas celulares ZFL y ZF4 con embriones de peces, Langu-Mitea et al.21 demostraron que ZFL es capaz de generar resultados similares en comparación con la prueba de toxicidad de embriones de peces. Tanneberger et al.5 demostraron que las líneas celulares permanentes de peces GSF, PLHC, RTG-2, RTgill-W1 y R1 tienen diferentes sensibilidades en la predicción de la toxicidad química de los peces en comparación con in vivo (peces adultos). Aunque RTgill-W1 (línea celular permanente de branquias de peces) se validó recientemente como un método alternativo para predecir la toxicidad aguda de los peces, se debe investigar la aplicabilidad de otras líneas celulares en estudios de ecotoxicidad. Utilizando líneas celulares de diferentes especies de peces y orígenes de tejidos, así como etapas de desarrollo (ZEM2S: embrión; ZFL: hígado adulto) puede contribuir significativamente a los estudios de ecotoxicidad, ya que puede abordar los efectos relacionados con etapas específicas del desarrollo de los peces y los órganos diana. Por lo tanto, los efectos químicos deben investigarse utilizando diferentes cultivos celulares que reflejen diferentes sitios diana en peces (por ejemplo, hígado, gónadas, branquias, cerebro), y no solo en una sola línea celular55.
Estos protocolos pueden tener diferentes aplicaciones en estudios de ecotoxicidad, y su uso no se limita necesariamente a predecir la toxicidad aguda de los peces. Por ejemplo, se pueden aplicar para definir concentraciones subcitotóxicas para realizar otras pruebas de toxicidad in vitro en peces, como la evaluación de los efectos de alteración endocrina en los peces. Además, los datos de citotoxicidad in vitro también pueden ayudar a desarrollar y mejorar el modelado toxicocinético de base fisiológica (PBTK). Como PBTK se centra en la distribución de una sustancia química en un organismo considerando los diferentes órganos (como la branquia, el hígado o el intestino)56, el uso de líneas celulares de diferentes especies de peces y orígenes de tejidos puede ser una fuente útil de información para este modelo. Los resultados de los bioensayos in vitro (por ejemplo, ensayos de citotoxicidad) proporcionan datos de entrada que representan procesos biológicos en el modelo PBTK y contribuyen a la extrapolación in vitro in vivo 21,56.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
En memoria del Dr. Márcio Lorencini, coautor de este trabajo, excelente investigador en el campo de la cosmética y dedicado a promover la investigación cosmética en Brasil. Los autores agradecen al Laboratorio Multiusuario del Departamento de Fisiología (UFPR) por la disponibilidad de equipos y por el apoyo financiero de la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Enseñanza Superior (CAPES, Brasil) (Código de Finanzas 001) y del Grupo Boticario.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-CFDA, AM (5-Carboxyfluorescein Diacetate, Acetoxymethyl Ester) | Invitrogen | C1345 | |
| Cell culture plate, 96 well plate | Sarstedt | 83.3924 | Surface: Standard, flat base |
| DMEM | Gibco | 12800-017 | Powder, high glucose, pyruvate |
| FBS - Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 12657-029 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, powder | Gibco | 21700026 | Powder |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 41300021 | Powder |
| Neutral red | Sigma-Aldrich | N4638 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| Orbital shaker | Warmnest | KLD-350-BI | 22 mm rotation diameter |
| Dulbeccos PBS (10X) with calcium and magnesium | Invitrogen | 14080055 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Resazurin sodium salt | Sigma-Aldrich | R7017 | Powder, BioReagent, suitable for cell culture |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 31800-014 | Powder |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | Powder, bioreagent for molecular biology |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide 98% | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| ZEM2S cell line | ATCC | CRL-2147 | This cell line was kindly donated by Professor Dr. Michael J. Carvan (University of Wisconsin, Milwaukee, USA) |
| ZFL cell line | BCRJ | 256 |
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