Summary
本协议描述了使用NIR-II光学成像装置对小鼠进行详细的实时NIR-II荧光成像操作。
Abstract
近红外II（NIR-II，1000-1700 nm）荧光成像作为一种新兴的成像技术，因其高灵敏度、深层组织穿透性和具有时空分辨率的卓越成像，在生物医学领域具有巨大的潜力。然而，促进NIR-II荧光成像在医学、药学等一些急需领域实施的方法，一直困扰着相关研究人员。该协议详细描述了具有D-A-D（供体-受体-供体）骨架的NIR-II荧光分子探针HLY1的构建和生物成像应用。HLY1具有良好的光学性能和生物相容性。此外，使用NIR-II光学成像设备对小鼠进行NIR-II血管和肿瘤成像。采集实时高分辨率NIR-II荧光图像，指导肿瘤和血管疾病的检测。从探针制备到数据采集，成像质量大大提高，保证了活体成像中用于数据记录的NIR-II分子探针的真实性。
Introduction
荧光成像是基础研究中常用的分子成像工具，也常用于指导临床肿瘤切除手术1。荧光成像的基本原理是利用相机接收样品（组织、器官等）照射后激光发出的荧光。2. 该过程在几毫秒内完成3.荧光成像波长可分为紫外（200-400 nm）、可见光区（400-700 nm）、近红外 I（NIR-I，700-900 nm）和近红外 II（NIR-II，1000-1700 nm）4，5，6。由于生物组织中的血红蛋白、黑色素、脱氧血红蛋白、胆红素等内源分子对可见光区域的光有较强的吸收和散射作用，因此光的穿透力和灵敏度大大降低，对可见光波长的荧光成像产生不利影响7，8，9。
NIR-II荧光成像具有低光子吸收和散射，高成像速度和高图像对比度（或灵敏度）10，11。随着荧光波长的增加，荧光在生物组织中的吸收和散射逐渐减小，NIR-II区的自发荧光极低12。因此，NIR-II窗口显着增加了组织的穿透深度，并获得更高的分辨率和信噪比13，14，15。NIR-II窗口可进一步细分为NIR-IIa（1300-1400 nm）和NIR-lIb（1500-1700 nm）窗口16。迄今为止，已有多个里程碑式的NIR-II材料报道，包括无机材料单壁碳纳米管、稀土纳米颗粒、量子点，以及有机材料半导体聚合物纳米颗粒、小分子染料、聚集诱导发光材料等。1，17，18，19，20，21，22.无机纳米材料易在肝脏、脾脏等体内蓄积，具有潜在的长期生物毒性23.有机小分子荧光团具有代谢快、毒性低、易修饰、结构清晰等优点，是临床上最有前景的探针24。
NIR-II光学成像系统也是荧光生物成像的关键组成部分，因为它可以有效地从NIR-II探头收集NIR-II荧光信号，从而提供精确的功能，解剖和分子图像25，26。NIR-II成像系统主要包括短波红外相机、长通（LP）滤光片、激光器和计算机处理器。 体内NIR-II荧光成像被认为是阐明疾病机制和生命本质的最可行的成像方法之一27，28，29。NIR-II成像技术已广泛应用于癌细胞检测、动态成像、体内靶向示踪、靶向治疗等生物医学领域，尤其在肿瘤学研究方面30、31。然而，考虑到NIR-II.成像技术对成像探头和仪器的高技术要求，也给不同领域的研究人员的实际应用带来了困惑和限制。因此，本文详细介绍了NIR-II成像探头的制备和NIR-II成像的应用。
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Protocol
用于NIR-II成像研究的动物实验在武汉大学动物实验中心进行，该中心已获得国际实验动物护理协会（AALAC）的称号。所有动物研究均按照《中国动物福利委员会实验动物护理使用指南》进行，并经武汉大学动物实验中心动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
本研究使用6周龄的雌性BALB / c裸鼠（~20g）。
1. 近红外II成像制备
- 将市售的黑色纸板（见 材料表）放在载体的中心。然后，将样品放在黑色纸板的顶部，使样品位于载体的中心（位于成像装置中的载物台）。
注意：与白色纸板相比，黑色纸板在NIR-II成像过程中的背景干扰较小。 - 根据NIR-II探头的波长选择合适的滤光片。当系统将滤光片移动到光学成像路径时，按长（>2 s）在屏幕界面中控制与滤光片型号对应的框面积（如900 LP）。
- 长按 平台 向上的触摸屏界面上的载具控制台控制区域使载具控制台向上;长按 平台 向下，使托架控制台向下。
- 将平台高度调整为“0 mm”（高度调节），并使用自动对焦使NIR-II图像清晰。
2. 近红外II染料（HLY1）的合成
- 称量合成实验所需的原料。确保它们不会变质。
- 将化合物 1（200 毫克，0.18 毫摩尔）、氯化钯 2（dppf）2 CH 2 Cl2（28 毫克，0.04 毫摩尔）、N-苯基-N-（4-（4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基）苯基）萘-2-胺（170 毫克，0.4 毫摩尔）和 K 2 CO3（46 毫克，0.34 毫摩尔）加入 25 毫升圆底烧瓶中的四氢呋喃 （THF） 溶液中。将混合物在N2气氛下在75°C下搅拌4小时（图1A）。
注：关于化合物1和N-苯基-N-（4-（4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂硼烷-2-基）苯基）萘-2-胺的合成过程，请参阅Li等人21。化学结构如图1A所示。 - 冷却至环境温度后，用蒸馏（DI）水（80mL）淬灭反应，并用DCM（二氯甲烷）/ H2O（30mL）（三次）提取混合物。通过柱层析16 （石油醚：DCM = 10：1）纯化粗产物，使HLY1成为绿色固体（78mg，30%产率）。
- 将染料HLY1置于冰箱中的氮气保护下以备后用。这可以存储长达 6 个月。
3. 水悬浮纳米探针的制备
- 称取HLY1（1mg）和两亲性包封材料，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2k（DSPE-PEG2k，10mg;见 材料表）。
- 通过使用DSPE-PEG2k作为封装基质（纳米沉淀方法12）制备HLY1点20（图1C）。将HLY1溶解在THF（1mL）中，并在25°C超声处理下缓慢加入含有DSPE-PEG2k水溶液（9mL）的烧杯中。 随后，通过透析20从混合物中除去THF。
- 用超滤18 （7100× g ）离心浓缩上述溶液10分钟，然后将其置于4°C冰箱中以备将来使用。这最多可以存储 1 个月。
注意：由DSPE-PEG2k 加载的纳米探针水溶液应储存在0°C以上并尽快使用。
4.荷瘤小鼠的构建
- 在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中培养4T1小鼠乳腺癌细胞（4T1），补充有10%（v / v）胎牛血清（FBS）和1%（v / v）青霉素 - 链霉素（参见 材料表），并在37°C下保持在5%CO2 的加湿培养箱中。
- 对于NIR-II荧光成像实验，培养4T1细胞（5 x 107）24小时，用胰蛋白酶（1mL）消化，并用无血清DMEM（4mL）洗涤两次。
- 通过用异氟醚（2%）治疗麻醉小鼠。通过刺激小鼠的脚趾或脚底来确认充分的麻醉，并观察小鼠是否有反应。如果没有反应，则意味着麻醉足够32.
- 然后，使用胰岛素注射针，通过皮下注射（100μL）将4T1细胞混合物注射到小鼠中。
注意：NIR-II成像研究在接种后~2周进行，当时肿瘤已生长到~100mm3的体积。在进行NIR-II肿瘤成像之前，请确认肿瘤大小。通过电子游标卡尺估计肿瘤大小，用于本研究11。
5. 体内 近红外II.荧光成像
- 通过用异氟醚（2%）处理麻醉小鼠，并使用光学NIR-II成像系统对小鼠的整个身体进行NIR-II成像（参见 材料表）。
注意：注意麻醉剂的剂量，避免小鼠死亡。一般来说，麻醉持续5-10分钟。刺激小鼠的脚趾或脚底，观察小鼠是否有反应。如果没有反应，则表示麻醉就足够了。 - 取HLY1点（0.8毫克/毫升，200微升）的溶液。将HLY1点静脉注射到麻醉小鼠中，3分钟后，使用NIR-II成像系统对小鼠全身的血管进行NIR-II荧光成像。进一步关注小鼠的头部以收集脑血管成像。
注意：成像过程中使用干净的实验手套，这将有助于获得干净的NIR-II图像。 - 在小鼠中注射HLY1点后5分钟收集图像，并使用ImageJ软件处理数据。光学NIR-II成像系统的仪器参数为90 mW/cm2 （808 nm激光）。
- 实验完成后，按照机构批准的协议对动物实施安乐死。
注意：对于本研究，通过将动物暴露于过量的异氟烷32来对动物实施安乐死。
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Representative Results
通过NIR-II成像仪器测定水悬浮HLY1点的荧光强度和亮度。90% f w THF/H2O 混合物中 HLY1 的荧光强度是 THF 溶液中的五倍，这表明 HLY1 具有突出的 AIE 特征（图 1B）。此外，HLY1点在1，500 nm LP滤光片下发出强烈的荧光信号，表明HLY1点可用于NIR-IIb成像（图1D）。HLY1点的最大吸收和最大发射波长分别为740 nm和1，040 nm（图2A）。此外，通过动态光散射（DLS）确定HLY1点的流体动力学尺寸为145 nm（图2B）。HLY1点（0.2mL，0.8mg / mL）通过尾静脉注射到正常Balb / c小鼠中进行血管成像（补充图1）。后肢的微血管在1，500 nm LP滤光片下清晰识别（图3B）。此外，在1，500 nm LP滤光片下也清楚地识别了脑血管（图3A）。还通过NIR-II成像系统评估了4T1荷瘤小鼠HLY1点的NIR-II成像性能。HLY1点（0.2mL，0.8mg / mL）通过尾静脉静脉注射到4T1小鼠中。通过NIR-II成像清晰可见荷瘤小鼠的4T1肿瘤（图3C），表明HLY1点的EPR效应。所有这些结果表明，HLY1点是一种明亮的NIR-II荧光探针，适用于血管和肿瘤成像。
图1：染料分子的合成和水悬浮探针的制备。 （A）HLY1的合成路径（a：Pd（dppf）Cl 2 CH 2 Cl2，K2 CO3，75°C）。（B）THF和90% fw THF/H 2 O（1，000 nm LP，2ms）中HLY1的NIR-II图像。（C）HLY1点的制备示意图。（D）水溶液中HLY1点的NIR-IIb荧光强度（1，500 nm LP，200 ms）。请点击此处查看此图的大图。
图 2：HLY1 点的光学特性和流体动力学尺寸。 （A） HLY1 点在水溶液中的吸收和发射光谱。（B） HLY1 点的 DLS。请点击此处查看此图的大图。
图3：使用HLY1点的NIR-II荧光成像。 （A）小鼠脑血管成像（1，500nm LP，300ms曝光时间）。比例尺：2厘米。 （B）小鼠全身血管成像（1，500 nm LP，300 ms）。（C） 4T1 肿瘤成像（1，250 nm LP，30 毫秒）。比例尺：1厘米。 请点击此处查看此图的大图。
补充图1：NIR-II成像设置。 （A）将HLY1点注射到小鼠体内的示意图。（B） NIR-II成像装置的照片。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
NIR-I荧光成像在一定程度上可用于肿瘤和血管成像，但由于NIR-I荧光团的最大发射波长（<900nm）有限，导致组织渗透性和肿瘤信号背景比为33，34。成像分辨率差和低可能会导致成像反馈治疗的结果与实际治疗效果之间的偏差。此外，大多数NIR-I荧光团的光学稳定性差，代谢极快，导致成像过程不稳定。由于NIR-I荧光团的组织渗透率低且不稳定性，在肿瘤和血管成像中的应用受到很大限制35。与NIR-I光相比，NIR-II荧光成像具有光子散射吸收明显减少、组织自发荧光更低、身体组织穿透力更强、成像时空分辨率更好的优点36。
本文介绍了一种基于D-A-D骨架的明亮AIE染料，该染料具有出色的稳定性。利用有效的纳米沉淀法制备了用于血管疾病和肿瘤成像等多用途生物成像的纳米探针。水溶液中的高量子产率是由于聚集诱导的发光特性，可以实现低剂量和高生物安全性的高清NIR-II成像。NIR-II探头的亮度和水溶性决定了成像的质量。此外，在将探针注入鼠标时，必须避免探针泄漏到鼠标的尾巴中，从而影响成像结果的准确性。目前的给药方法仅限于静脉注射，不能使用多种注射方法，这是当前方法的局限性。此外，该方法的NIR-II.纳米探针只能通过被动靶向累积到靶标上，而不能通过主动靶向识别特定靶标。
在实施NIR-II成像的过程中，NIR-II设备的操作对于图像的采集也很重要。为了获得高分辨率的血管成像，InGaAs相机需要聚焦在鼠标上并靠近鼠标放置，以便于观察微小的血管。对于肿瘤成像，探针需要有效地积聚到肿瘤中，并且NIR-II荧光应由积聚在肿瘤中的探针发射，有效地区分肿瘤与周围组织的边界。由于NIR-II荧光成像的高灵敏度，可以在成像过程中动态观察图像，这是许多其他成像技术所缺乏的。
本研究介绍了荧光探针的制备方法。同时，通过NIR-II荧光纳米探针实现了高分辨率的血管和肿瘤成像，为血管疾病和癌症的检测提供了一种准确有效的方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金（82273796，82111530209）、中央指导地方科技发展专项资金（XZ202202YD0021C、XZ202102YD0033C、XZ202001YD0028C）、湖北省科技创新重点项目（2020BAB058）、中央高校基础研究经费和西藏自治区COVID-19科技发展防控项目的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anhydrous pyridine | Perimed | 110-86-1 | |
| Anhydrous sodium sulfate | China national medicines Co.,Ltd | SY006376 | |
| Black cardboard | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | AO00158 | |
| Column chromatography | Energy Chemical | E080498 | |
| Diphenylphosphine palladium dichloride | Sigma-Aldrich | B2161-1g | |
| DSPE-PEG2000 | Ponsure | PS-E1 | |
| Dulbecco's modified eagle medium | Gibco | 8121587 | |
| EGTA | Biofroxx | EZ6789D115 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 2166090RP | |
| Isoflurane | GLPBIO | GC45487-1 | |
| K2CO3 | Macklin | P816305-5g | |
| N. N '- dimethylformamide | China national medicines Co.,Ltd | 02-12-1968 | |
| NIR-II imaging instrument | Suzhou Yingrui Optical Technology Co., Ltd | 16011109 | |
| N-sulfenanilide | Enerry chemical | 1250030-5g | |
| PdCl2(dppf)2CH2Cl2 | TCI | B2064-1g | |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Tetrahydrofuran | China national medicines Co.,Ltd | M005197 | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Immochem | 1021232-5g | |
| Tetratriphenylphosphine palladium | Sigma-Aldrich | 1021232-5g | |
| Tributyltin chloride | Immochem | QH004335 | |
| Trimethylchlorosilane | China national medicines Co.,Ltd | 40060560 |
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