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Biology

Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64876
Automatic Translation
1,2, 2,3, 1,4
1Department of Biology, Western Kentucky University, 2Plant Biotechnology Division, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, 3Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 4Department of Biology, St. Joseph's University

Summary

Nous utilisons des outils de laboratoire simples pour examiner l’architecture du système racinaire (RSA) d’Arabidopsis et de Medicago. Les plantules sont cultivées en hydroponie sur des mailles et étalées à l’aide d’un pinceau d’art pour révéler le RSA. Les images sont prises à l’aide d’un balayage ou d’une caméra haute résolution, puis analysées avec ImageJ pour cartographier les traits.

Abstract

Une connaissance approfondie de l’élaboration de l’architecture du système racinaire des plantes (ASF) est essentielle pour améliorer l’efficacité de l’utilisation des éléments nutritifs et accroître la tolérance des cultivars aux défis environnementaux. Un protocole expérimental est présenté pour la mise en place du système hydroponique, la croissance des plantules, l’épandage RSA et l’imagerie. L’approche a utilisé un système hydroponique à base de boîte magenta contenant un treillis en polypropylène soutenu par des cales en polycarbonate. Les contextes expérimentaux sont illustrés par l’évaluation de l’ARS des plantules sous divers apports en éléments nutritifs (phosphate [Pi]). Le système a été établi pour examiner le RSA d’Arabidopsis, mais il est facilement adaptable pour étudier d’autres plantes comme Medicago sativa (luzerne). Les plantules d’Arabidopsis thaliana (Col-0) sont utilisées dans cette étude comme exemple pour comprendre le RSA de la plante. Les graines sont stérilisées en surface en traitant à l’éthanol et à l’eau de Javel commerciale diluée, et conservées à 4 °C pour la stratification. Les graines sont germées et cultivées sur un milieu liquide demi-MS sur un treillis de polypropylène soutenu par des coins en polycarbonate. Les plantules sont cultivées dans des conditions de croissance standard pendant le nombre de jours souhaité, délicatement choisies dans le maillage et immergées dans des plaques de gélose contenant de l’eau. Chaque système racinaire des plantules est étalé doucement sur la plaque remplie d’eau à l’aide d’un pinceau d’art rond. Ces plaques de Petri sont photographiées ou scannées à haute résolution pour documenter les traits RSA. Les caractéristiques des racines, telles que la racine primaire, les racines latérales et la zone de ramification, sont mesurées à l’aide du logiciel ImageJ disponible gratuitement. Cette étude fournit des techniques pour mesurer les caractéristiques des racines des plantes dans des environnements environnementaux contrôlés. Nous discutons de la façon (1) de cultiver les plantules et de collecter et de répandre des échantillons de racines, (2) d’obtenir des images d’échantillons de RSA étalés, (3) de capturer les images et (4) d’utiliser un logiciel d’analyse d’images pour quantifier les attributs racinaires. L’avantage de la méthode actuelle est la mesure polyvalente, facile et efficace des traits RSA.

Introduction

L’architecture du système racinaire (RSA), qui est souterraine, est un organe vital pour la croissance et la productivitédes plantes 1,2,3. Après le stade embryonnaire, les plantes subissent leurs changements morphologiques les plus importants. La façon dont les racines poussent dans le sol affecte grandement la croissance des parties de la plante au-dessus du sol. La croissance racinaire est la première étape de la germination. C’est un trait informatif car il répond de manière unique aux différents nutriments disponibles 1,2,3,4. Le RSA présente un degré élevé de plasticité développementale, ce qui signifie que l’environnement est toujours utilisé pour prendre des décisions concernant le développement 2,5. Les changements dans l’environnement ont rendu la production agricole plus difficile dans le scénario actuel. Sur une base continue, le RSA intègre les signaux environnementaux dans les choix de développement5. Par conséquent, une compréhension approfondie des principes qui sous-tendent le développement racinaire est essentielle pour apprendre comment les plantes réagissent aux environnements changeants 2,5.

Le RSA détecte les concentrations variables de nutriments et rend les altérations phénotypiques 4,6,7,8,9,10,11,12. Des études suggèrent que la morphologie racinaire/RSA est très plastique par rapport à la morphologiedes pousses 1,3. La cartographie des caractères RSA est très efficace pour enregistrer l’effet de la modification de l’environnement du sol environnant 1,11,12.

En général, des divergences dans l’effet de diverses carences nutritionnelles sur le phénotype racinaire ont été signalées dans de nombreuses études antérieures 3,11,13,14,15. Par exemple, il existe plusieurs rapports contrastés sur les changements induits par la famine de phosphate (Pi) dans le nombre, la longueur et la densité des racines latérales (LR). Une augmentation de la densité LR a été signalée dans l’état de carence en Pi 6,8. En revanche, une diminution de la densité LR dans des conditions déficientes en Pi a également été rapportée par d’autres auteurs 3,13,16. L’une des principales causes de ces incohérences est l’utilisation du milieu gélifiant élémentaire sujet à la contamination, dont la gélose en contient souvent10. Les chercheurs cultivent généralement leurs plantes expérimentales sur un système de plaques à base d’agar et enregistrent les traits racinaires. De nombreux traits RSA sont souvent dissimulés ou incrustés dans la gélose et ne peuvent pas être documentés. Les expériences liées à l’induction d’une carence en nutriments, dans lesquelles les utilisateurs excluent souvent totalement un composant du milieu, ne peuvent pas être réalisées dans un milieu gélifiant élémentaire sujet à la contamination11,14,15. De nombreux nutriments sont fréquemment présents en quantités importantes dans les milieux gélosé, y compris P, Zn, Fe et bien d’autres11,14,15. En outre, la croissance du RSA est plus lente dans les milieux liquides à base d’agar que dans les milieux liquides non à base d’agar. Par conséquent, il est nécessaire d’établir une autre approche non fondée sur la gélose pour quantifier et enregistrer qualitativement le phénotype de l’ASR. Par conséquent, la méthode actuelle a été développée, dans laquelle les plantules sont élevées dans un système hydroponique à base de boîte magenta sur un treillis de polypropylène soutenu par des coins en polycarbonate 1,10,11.

Cette étude présente une version improvisée détaillée de la méthode antérieure décrite par Jain et al.10. Cette stratégie a été adaptée aux demandes actuelles en biologie des racines des plantes et peut également être utilisée pour des plantes comme la luzerne, autres que les plantes modèles. Le protocole est le principal moyen de mesurer les changements dans RSA, et il ne nécessite qu’un équipement simple. Le présent protocole illustre comment phénotyper plusieurs caractéristiques racinaires, telles que les racines primaires et latérales en milieu normal et modifié (Pi déficient). Des instructions étape par étape et d’autres conseils utiles tirés des expériences de l’auteur sont fournis pour aider les chercheurs à suivre les méthodologies offertes dans cette méthode. La présente étude vise à fournir une méthode simple et efficace pour révéler l’ensemble du système racinaire des plantes, y compris les LR d’ordre supérieur. Cette méthode consiste à étaler manuellement le système racinaire avec un pinceau rond d’aquarelle, permettant un contrôle précis de l’exposition des racines 1,10,11,12. Il ne nécessite pas d’équipement coûteux ou de logiciel compliqué. Cette méthode a amélioré l’absorption des nutriments et le taux de croissance; Les plantes ont une solution riche en nutriments facilement absorbée par leurs racines. La méthode actuelle convient aux chercheurs qui souhaitent cartographier en détail les caractéristiques du système racinaire d’une plante, en particulier au début du développement (10-15 jours après la germination). Il convient aux petits systèmes racinaires, aux plantes modèles comme Arabidopsis et le tabac, et aux plantes non conventionnelles comme la luzerne jusqu’à ce que leur système racinaire rentre dans les boîtes magenta.

Les étapes de l’analyse phénotypique du développement du RSA chez Arabidopsis sont décrites dans ce protocole comme suit: (1) la méthode de stérilisation de la surface des semences pour les plantes (Arabidopsis), (2) les étapes de mise en place du système hydroponique, suivie du semis des graines sur un milieu, (3) la procédure de prélèvement des semis complets et d’épandage sur la plaque de Petri pour l’analyse RSA, (4) comment enregistrer les images pour RSA, et (5) calculer les paramètres RSA importants à l’aide du logiciel ImageJ.

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Protocol

L’ensemble du protocole est résumé schématiquement à la figure 1, montrant toutes les étapes essentielles impliquées dans la révélation de l’architecture du système racinaire (RSA) des plantules. Les étapes du protocole sont données en détail ci-dessous:

1. Stérilisation de la surface des graines d’Arabidopsis

  1. Transférer une petite cuillère (environ 100 graines = environ 2,5 mg) de graines dans un tube à microfuge et faire tremper pendant 30 minutes dans de l’eau distillée à température ambiante (RT). Toute cette procédure est effectuée dans l’état aseptique.
  2. Centrifuger brièvement le tube de microfuge contenant les graines à 500 x g pendant 5 s, en utilisant n’importe quelle centrifugeuse de table à TA pour laisser les graines se déposer.
  3. Décanter l’eau, ajouter 700 μL d’éthanol à 70 % (v/v), vortex pendant quelques secondes et faire tourner. Répétez le tourbillon et la rotation si nécessaire, mais assurez-vous que le temps de traitement de l’éthanol à 70 % reste à 3 min.
  4. Après 3 min, rincer immédiatement une fois à l’eau stérile. Gardez l’étape de lavage à l’éthanol aussi opportune que possible, car une exposition prolongée à l’éthanol diminue la germination.
  5. Traiter les graines avec de l’eau de Javel commerciale diluée (4 % v/v) avec une goutte de Tween-20 pendant 7 min. Mélanger les graines avec une solution d’eau de Javel en retournant rapidement les tubes 8 à 12 fois, puis en faisant une brève centrifugeuse (500 x g pendant 5 s à TA). On voit de la mousse apparaître dans le tube.
  6. Décanter le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL et rincer les graines avec au moins cinq lavages à l’eau stérile, en suivant la même procédure de vortex.
  7. Laisser les graines stérilisées en surface dans l’eau et incuber pendant 2-3 jours à 4 °C pour la stratification10.

2. Mise en place d’un système hydroponique pour la germination des graines

  1. Remplissez à moitié une boîte en magenta standard avec de l’eau distillée et autoclavez-la. Autoclaver la feuille de polycarbonate (couleur claire et texture lisse) et couper des rectangles de 4 cm x 8 cm, avec un point médian entaillé à plus de la moitié du rectangle de sorte que deux rectangles puissent s’emboîter ensemble pour former une forme de X10. Utilisez cette configuration pour maintenir la maille de polypropylène (carrés de 6 cm x 6 cm de taille de pores de 250 μm, ou selon les besoins) coupée à partir de feuilles de 12 x 24 pouces10.
    REMARQUE: Le polypropylène est très résistant aux acides, aux alcalis et à d’autres produits chimiques; par conséquent, il a été choisi. L’autoclavage a tendance à déformer les mailles de polypropylène; Par conséquent, il est recommandé d’être transporté séparément enveloppé dans du papier d’aluminium. Des conditions typiques d’autoclavage de 16 min, 121 °C, 15 psi ou 775 mm Hg sont recommandées.
  2. Ajouter des milieux basaux stériles demi-SEP contenant des vitamines + 1,5 % (p/v) de saccharose, comme décrit par Shukla et coll.1, à chaque boîte pour atteindre le bord inférieur de la maille de polypropylène dans un flux laminaire. Toutes les procédures sont effectuées dans des conditions aseptiques.
  3. Semez les graines stérilisées en surface sur le filet (taille des pores de 250 μm) en hydroponie et laissez-les pousser pendant 3 jours.
  4. Après 3 jours, transférer les plantules sur un filet (taille des pores de 500 μm) et les laisser pousser pendant 2 jours.
  5. Après 2 jours (total de 5 jours), transférer les plantules sur le milieu témoin (c.-à-d. milieu nutritif MS modifié 1 contenant 2,0 mM NH4NO 3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO 4·7H2O, 0,1 mM MnSO 4· H2O, 3,0 μM ZnSO 4·7H2O, 0,1 μM CuSO 4·5H2O, 0,3 mM CaCl 2·2H2O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H2O, 0,1 mM FeSO 4·7H2O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H2O, 1,25 mM KH 2 PO 4, 100 μMH3BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O, 1,5 % saccharose, 1,25 mM MES, pH 5,7 ajusté avec 0,1 M MES [pH 6,1]) et au milieu expérimental (p. ex. traitement P- [0 mM]; KH2 PO 4 est remplacé par 0,62 mM K2SO4 à partir de la composition du milieu de contrôle comme mentionné ci-dessus1. Pour les traitements Pi en excès, la concentration de KH 2 PO4 est augmentée dans le milieu MS modifié [2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]1) et laisser pousser les graines pendant 7 jours.
    REMARQUE: Une taille de pores de maille plus grande (500 μm) facilite la cueillette en douceur des plantules entières sans dommage ni besoin de couper l’hypocotyle. Les plantules poussent dans des conditions de croissance standard (c.-à-d. photopériode de lumière de 16 h / photopériode sombre de 8 heures, intensité lumineuse de 150 μmol·m-2·s-1, humidité de 60 % à 70 %) à 23 °C.

3. Examen de la LSF

  1. Préparer des plaques de gélose (1,1 %) pour l’étalement des racines (taille de la plaque de Petri : 150 mm x 15 mm).
  2. Ajouter 10 à 20 ml d’eau du robinet filtrée autoclavée à la plaque de Petri, comme mentionné ci-dessus. Retirez doucement les plantules du maillage (500 μm) et plongez-les dans l’eau sur les assiettes.
  3. Étalez délicatement la racine de chaque plantule dans l’assiette remplie d’eau à l’aide d’un pinceau d’aquarelle rond (tailles: n ° 14, 16, 18 et 20).
    REMARQUE: Lors de la propagation du système racinaire, saisissez d’abord la racine primaire et répartissez-la en ligne droite, car elle sert d’axe. Ensuite, répartissez les LR symétriquement de chaque côté de la racine primaire, dans la mesure du possible. Après cela, étalez le LR de second ordre lié au LR de premier ordre. Ce processus d’épandage est une sorte d’art; faites-le doucement, lentement, comme un artiste dessinant une image de la RSA.
  4. Inclinez légèrement la plaque pour éliminer l’eau.
    NOTE: À ce stade, la procédure peut être interrompue en plaçant ces plaques étalées à 4 ° C. Plus tard, lorsque le traitement de l’image est nécessaire, sortez les plaques et placez-les à RT pendant un moment. Essuyez l’eau condensée, puis l’image peut être traitée facilement.

4. Enregistrement d’images pour RSA

  1. Scannez ou photographiez ces plaques de Petri de manière appropriée.
    REMARQUE: Pour obtenir des photographies de haute qualité, la résolution de 600 ppp est recommandée pour la numérisation, et au moins un appareil photo de 12 mégapixels est recommandé pour la photographie.
  2. Mesurez les caractéristiques de l’architecture du système racine à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) disponible gratuitement. Pour suivre rapidement les étapes de mesure de la longueur de la racine à l’aide du logiciel ImageJ, veuillez vous référer à l’exemple « mesure de la longueur du contour de l’ADN »17.
    REMARQUE: Ces étapes sont suivies pour mesurer les longueurs de racine sur les images capturées à l’aide d’un scanner ou d’un appareil photo haute résolution.
    1. Utilisez une distance de longueur donnée pour définir l’échelle. La distance connue de la barre d’échelle de la figure 3 est de 2 cm. Sélectionnez l’outil Ligne droite dans la barre d’outils ImageJ (cinquième outil à partir de la gauche). Utilisez l’outil Ligne droite pour créer une sélection de ligne qui délimite la barre d’échelle. Terminez le contour en cliquant avec le bouton droit de la souris, en double-cliquant ou en cliquant dans la zone au début.
    2. Mesurez la longueur de la barre d’échelle connue en pixels à l’aide de la barre d’outils Analyser > mesurer . Notez la longueur des pixels.
    3. Ouvrez la boîte de dialogue Définir l’échelle en cliquant sur l’onglet Définir l’échelle dans l’onglet Analyser. Dans le champ Distance en pixels, entrez la longueur en pixels (comme indiqué ci-dessus). Ensuite, dans le champ Distance connue, entrez la valeur, comme indiqué par la barre d’échelle (ici, elle est de 20 mm). Définissez l’unité de longueur sur mm. Le format des pixels est de 1,0. Maintenant, l’échelle est spécifiée par le nombre x de pixels par millimètre. Pour verrouiller l’échelle de cette image particulière, cliquez sur OK.
    4. Créez une sélection de ligne qui définit la longueur de la racine à l’aide de l’outil Ligne segmentée . Terminez le contour en cliquant avec le bouton droit de la souris, en double-cliquant ou en cliquant dans la zone au début. Cliquez et faites glisser les petites « poignées » noires et blanches le long du contour pour ajuster la sélection de ligne selon vos besoins.
    5. Utilisez la commande Mesure sous l’onglet Analyser d’ImageJ pour quantifier la longueur de la racine. Pour transférer les données mesurées vers une feuille de calcul, cliquez avec le bouton droit sur la fenêtre Résultats , sélectionnez Copier tout dans le menu contextuel, basculez vers la feuille de calcul, puis collez les données.
      Remarque : Comme décrit ci-dessus, définissez l’échelle en utilisant la distance connue de la barre d’échelle dans l’option ImageJ définir l’échelle. Cela donne le nombre de pixels par unité de longueur. Il est nécessaire de régler l’échelle à chaque fois, chaque fois qu’une nouvelle image est analysée.
  3. Mesure et calcul des caractéristiques RSA
    1. Mesurer la longueur de la racine primaire entre la jonction hypocotyle et l’extrémité de la racine.
    2. Mesurez la longueur LR de premier et de deuxième ordre.
    3. Mesurez la zone de ramification (BZ) de la racine primaire. La zone de ramification de la racine primaire (BZPR) s’étend du premier point émergent LR au dernier point émergent LR.
    4. Enregistrer le nombre de LR, qui est le nombre de LR provenant des limites du PRBZ.
    5. Mesurer la longueur moyenne des LR de premier ordre et d’ordre supérieur. Calculez la longueur moyenne du LR de premier ordre (1° LR) (centimètre par racine) en divisant la longueur totale du 1° LR par le nombre total de LR 1°.
    6. Mesurez la longueur moyenne du LR de second ordre. Calculer la longueur moyenne du LR du second ordre (2° LR) en divisant la longueur totale du 2° LR par le nombre total de 2° LR.
    7. Mesurer la densité de 1° LR. Calculer la densité de 1° LR (nombre de 1° LR par unité de longueur de BZ PR) en divisant le nombre de 1° LRs par la longueur du BZPR.
    8. Mesurer la densité LR de 2°. Calculer la densité de 2° LR en divisant le nombre de 2° LRs par la longueur de la BZ de 1° LRs (nombre de 2° LRs par unité de longueur du BZ de 1° racines latérales).
    9. Mesurez la longueur totale de la racine (TRL). Il s’agit de l’agrégat de la racine primaire, des longueurs 1° LR et 2° LR (et plus si présente).

5. Mesure des poils racinaires

REMARQUE: Bien que le système hydroponique ne soit pas bon pour favoriser la croissance et le développement des poils racinaires, bien qu’il soit aussi robuste que dans les milieux de croissance solides, il est toujours important de l’étudier dans le contexte actuel. Suivez les étapes ci-dessous pour analyser le développement des poils racinaires dans une section de 5 mm à partir de l’extrémité de la racine primaire des plantules.

  1. Couper une section de 2 cm de la racine primaire de l’extrémité de la racine.
  2. Montez la section racinaire sur une lame en utilisant 10% de glycérol comme support de montage.
  3. Placez la lame sous un stéréomicroscope.
  4. Utilisez le support axial pour visualiser et capturer des images des poils racinaires.
  5. Analysez les images pour étudier la structure et les caractéristiques des poils racinaires à l’aide du logiciel ImageJ décrit précédemment.

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Representative Results

Les différents traits morphométriques de l’architecture du système racinaire (RSA) sont mesurés à l’aide d’outils de laboratoire simples, et les étapes sont représentées schématiquement à la figure 1. Les détails de la configuration hydroponique démontrent le potentiel du protocole dans la mesure du RSA (Figure 1 et Figure 2).

Compte tenu des différences observées dans les gélifiants, nous avons utilisé un système de culture hydroponique pour mener toutes les études 3,10. En tant que preuve de concept, ce système hydroponique fonctionne bien, reflétant le phénotype apparemment contrasté dans des conditions déficientes et suffisantes en Pi (Figure 3). Les graines d’Arabidopsis ont été cultivées en hydroponie pendant 5 jours dans un milieu demi-MS sur un treillis de polypropylène, comme illustré à la figure 2. Les plantules ont été transplantées après 5 jours dans des conditions Pi déficientes et suffisantes, et laissées croître pendant 7 jours (Figure 3).

Démonstration des caractéristiques RSA sous divers apports en nutriments (Pi)
Nous avons suivi un schéma établi pour analyser et enregistrer les traits du RSA3. Différents traits RSA ont été analysés sous des régimes Pi contrastés dans des conditions hydroponiques (Figure 3). Le traitement déficient en Pi (0 mM Pi) a invoqué un phénotype racinaire typiquement rapporté présentant un RSA plus court, moins profond et moins ramifié que l’état suffisant de Pi (Figure 3A). La longueur de la racine primaire était significativement atténuée dans les conditions déficientes en Pi (Figure 3A,B). La longueur de la racine primaire, rapidement acquise en présence de Pi (1,25 mM), montre l’efficacité du système hydroponique reflétant adéquatement les changements physio-morphologiques (Figure 3A,B). Le TRL a été significativement diminué dans les conditions déficientes en Pi (figure 3B). La zone de ramification (BZPR), comme le montre la figure 3A, était significativement atténuée dans la condition de carence en Pi (figure 3B).

Parmi ces traits, le plus affecté était le TRL, en raison de la forte différence de nombre LR entre les deux conditions Pi. La croissance vigoureuse du RSA dans les conditions de Pi suffisant (1,25 mM) était due à une augmentation significative du nombre et de la longueur des LR à 1°. Ainsi, un changement rapide de RSA s’est produit, principalement en raison de la modification du développement LR. Nous avons mesuré le nombre de LR provenant de la limite de la zone ramifiée de la racine primaire, car ils sont considérés comme plus significatifs 1,3,18. La longueur moyenne du 1° LR (centimètre par racine) a été significativement réduite dans l’état déficient en Pi (Figure 3C). La longueur moyenne de 2° LR a été réduite de la même manière, en raison de la condition P0; cependant, sa quantité était inférieure à la longueur moyenne de 1° LR (figure 3C). Le nombre de LR à 1° et de 2° LR a fortement diminué sous la condition P0 par rapport à la condition P1.25 (Figure 3D). La densité de 1° LR (nombre de 1° LR par centimètre de longueur BZPR) n’a pas été modifiée dans la condition P0 par rapport à la condition P1,25 (figure 3E). La densité de 2° LR (nombre de 2° LRs par centimètre du BZ de 1° LRs) n’a pas non plus montré de changement significatif (Figure 3E). Par conséquent, la détermination de la densité des LR est essentielle pour obtenir des informations utiles sur la plasticité RSA.

Analyse du développement des poils racinaires sous différents régimes de phosphate (Pi)
L’effet de l’apport de Pi sur le développement des poils racinaires a été étudié dans la racine primaire des semis. Il a été constaté que la longueur des poils des racines augmentait avec l’augmentation des concentrations de Pi jusqu’à 2,5 mM, mais diminuait à 5 mM et 10 mM. Cependant, à 20 mM, la longueur des poils racinaires est revenue à des niveaux proches du pic (figure supplémentaire 1). Le nombre de poils racinaires était significativement plus élevé à 0 mM par rapport à toutes les autres sources de Pi, le nombre le plus élevé ayant été observé à 20 mM (figure supplémentaire 1).

Application de la présente méthode à des végétaux autres qu’Arabidopsis
Nous avons examiné la faisabilité de la méthode actuelle sur des plantes autres qu’Arabidopsis, en prenant Medicago sativa (Alfalfa) comme plante d’essai. Le protocole a été modifié en fonction de l’exigence de deux aspects: (1) la méthode de stérilisation de la surface des semences et (2) la taille des pores de la maille de polypropylène (maintenant plus grande, 1 000 μm). Le protocole de stérilisation et de stratification des semences de surface doit toujours être optimisé en fonction des plantes sélectionnées à étudier. Dans le cas de la luzerne, les étapes décrites par Weeks et al.19 ont été suivies. Après stérilisation de surface, les graines ont été incubées à 4 °C pendant 7 jours pour la stratification. Après cela, nous avons suivi la même procédure décrite dans ce protocole avec une modification de la taille des pores du maillage. Comme le montre la figure 4A, B, les plantules étaient bien développées, avec un RSA modifié sous divers apports de Pi. La figure 4C montre la plasticité du système racinaire sous 1,25, 0 et 20 mM de solution nutritive Pi. L’excès de Pi (20 mM) et l’apport insuffisant en Pi ont entraîné une diminution du développement du système racinaire, par rapport à l’état suffisant de Pi (1,25 mM) (témoin) (figure 4C). Le RSA peut être mappé pour différentes caractéristiques à l’aide du logiciel ImageJ décrit dans le protocole. Par conséquent, le protocole est simple, efficace et peut être facilement modifié en fonction de l’espèce végétale sélectionnée. Il offre la possibilité d’étudier le RSA de diverses espèces végétales dans différentes conditions nutritives.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de la procédure. Le diagramme schématique décrit les principales étapes impliquées dans le protocole de méthode pour mapper le RSA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Affichage de la configuration hydroponique dans des boîtes magenta pour faire pousser des plantules. (Tel que décrit par Jain et al.10, avec modifications). (A) Deux pièces rectangulaires (4 cm x 8 cm) avec des encoches de cales en polycarbonate pour l’assemblage de l’installation. (B) L’assemblage de coins en polycarbonate les uns dans les autres par entaille se transformant en une forme de X pour soutenir la surface de la maille. C) Une feuille de maille de polypropylène de 250 μm (6 cm x 6 cm). (D) Vue de dessus de l’assemblage des cales en polycarbonate dans la boîte magenta. (E) Assemblage de la maille de polypropylène sur les cales en polycarbonate dans une boîte magenta remplie de supports. (F) Une exposition de plantules d’Arabidopsis germées sur la maille. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Démonstration d’une modulation typique du RSA dans diverses conditions nutritives (Pi déficient [0 mM] et suffisant [1,25 mM]) à l’aide de cette méthode de phénotypage. Les plantules d’Arabidopsis (Col-0) sont cultivées en hydroponie dans un milieu MS 0,5x pendant 5 jours, puis soumises à des apports insuffisants en Pi (0 et 1,25 mM, respectivement) et cultivées pendant 7 jours, comme le montre la figure 2. (A) Les plantules individuelles sont retirées de la maille de polypropylène (500 μm) et étalées sur les plaques de Petri de gélose à l’aide d’un pinceau d’art rond et d’eau. Les données sur les caractères RSA sont présentées pour (B) la longueur de la racine primaire (PR), la longueur totale de la racine (TRL), la zone de ramification (BZ), (C) la longueur moyenne (Av.) de la racine latérale du premier ordre (1° LR longueur), la moyenne (Av.) la longueur latérale de la racine latérale du second ordre (2° LR longueur), (D) le nombre de 1° LR et 2° LR, et (E) la densité de 1° LR et 2° LR. Les valeurs sont des moyens ± SE; n = 21. Cette figure a été modifiée à partir de Shukla et al.1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Démonstration du système racinaire de Medicago sativa (luzerne) à titre d’exemple pour montrer l’applicabilité de cette méthode à d’autres plantes que Arabidopsis. (A) Vue latérale de la boîte magenta montrant la croissance des plantules de luzerne. (B) La vue de dessus de la boîte magenta montre l’émergence de la pousse sur la maille de polypropylène (taille des pores de 1 000 μm). (C) L’architecture typique du système racinaire (RSA) de la modulation de la luzerne dans diverses conditions nutritives (Pi déficient [0 mM], excès de Pi [20 mM] et suffisant ou témoin [1,25 mM]) en utilisant cette méthode de phénotypage RSA. Les plantules de luzerne sont cultivées en hydroponie dans un milieu MS 0,5x pendant 5 jours, soumises à des apports déficients, suffisants et excédentaires en Pi (0, 1,25 et 20 mM, respectivement) et cultivées pendant 7 jours. Les plantules individuelles sont extraites de la maille de polypropylène (1 000 μm) et étalées sur les plaques de Petri gélosées, comme indiqué en C, à l’aide d’un pinceau d’art et d’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Différentes concentrations excessives de Pi modulent le développement des poils racinaires. Les semis WT ont été cultivés en hydroponie, comme décrit dans le protocole. (A) Une section de 1 à 2 cm à partir de l’extrémité de la racine primaire a été hachée et montée sur une lame contenant 10 % de glycérol, et une région de 5 mm de l’extrémité a été documentée pour le nombre et la longueur des poils de la racine. Les données sont présentées pour (B) la longueur des poils de la racine et (C) le nombre de poils racinaires dans une région de 5 mm de l’extrémité de la racine primaire. Les valeurs sont des moyens ± SE; n = 10 (B et C). Les barres avec différentes lettres alphabétiques diffèrent significativement (p ≤ 0,05) selon le test t apparié de Student. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Ce travail a démontré la cartographie de RSA à l’aide d’un équipement de laboratoire simple. En utilisant cette méthode, les altérations phénotypiques sont enregistrées au niveau raffiné. L’avantage de cette stratégie est que la portion de pousses n’entre jamais en contact avec les milieux, de sorte que le phénotype des plantules est original. Cette méthode consiste à mettre en place un système hydroponique pour faire pousser des plantules comme décrit dans le protocole. Ensuite, chaque plantule est retirée intacte et placée sur une plaque de Petri remplie d’agar-agar. Le système racinaire est ensuite autorisé à se répandre manuellement à l’aide d’un pinceau d’art, et des photographies sont prises pour être analysées avec le logiciel ImageJ 1,10,11,12.

La germination des graines nécessite une stérilisation de la surface des graines pour éliminer les bactéries, les champignons et les virus. L’alcool - 70% d’éthanol - est utilisé pour stériliser les surfaces des graines. Pour désinfecter les graines sans les détruire, le temps de traitement de la stérilisation à l’alcool doit être soigneusement suivi. La germination des graines diminue lorsque la stérilisation à l’alcool est excessive. Les durées de traitement varient selon les espèces végétales (p. ex., pour Arabidopsis, la limite de temps est de 3 min 1,10,11,12,20 seulement, tandis que pour Medicago sativa, elle est de 5 min 19. Afin de faciliter la cueillette en douceur du RSA pour analyse, il est important de limiter le nombre de graines par maille ou boîte magenta, afin d’éviter l’enchevêtrement du système racinaire entrelui-même 1,10,11,12. Cela peut être réalisé en utilisant un plus petit nombre de graines par maille. Par exemple, l’utilisation de quatre graines par maille peut aider à réduire le risque d’enchevêtrement tout en permettant une croissance et un développement robustes des systèmes racinaires. Il est important de noter que le nombre optimal de graines par maille dépend de l’espèce végétale spécifique et des objectifs de l’analyse RSA. Par exemple, si une expérience nécessite du tissu pour d’autres exigences de traitement en aval telles que l’isolement de l’ARN, dans ce cas, il est recommandé de semer en vrac (100 graines par maille dans le cas d’Arabidopsis)1,10,11,12. La cueillette des plantules du maillage est un processus délicat qui nécessite le plus grand soin et la plus grande attention 1,10,11. Il est important d’aborder cette tâche lentement, doucement et prudemment pour éviter d’endommager les plantules délicates. Pour cueillir les plantules du maillage, il est recommandé d’utiliser une pince à épiler fine ou une pince pour saisir les plantules doucement mais fermement. Les plantules doivent être soigneusement retirées du maillage pour éviter de perturber le système racinaire ou de causer des dommages aux plantules. Il est essentiel d’être patient et de prendre le temps de retirer soigneusement chaque plantule du filet pour s’assurer qu’elle n’est pas endommagée pendant le processus. C’est un processus progressif qui doit être mené lentement, doucement et soigneusement pour assurer le succès de l’expérience. Afin de mesurer avec précision le RSA des plantules, il est crucial de marquer une échelle sur la plaque de Petri pour permettre une mesure précise 1,10,11. Cela peut être fait en utilisant un marqueur permanent pour tracer une ligne sur la plaque de Petri à une distance connue, telle que 1 cm ou 2 cm. La balance doit être placée le long du bord de la plaque de Petri dans un endroit visible. À l’aide d’une brosse, il est également essentiel de faire très attention lors de l’épandage du RSA. La racine primaire doit être soigneusement positionnée au centre de la plaque de Petri et les racines latérales doivent être étalées des deux côtés de la racine primaire. Le système racinaire doit être partiellement immergé dans l’eau pour faciliter la propagation. Pour mesurer chaque nouvelle plaque de Petri, il faut régler l’échelle dans le logiciel ImageJ à chaque fois.

Peu de modifications peuvent être apportées pour améliorer l’efficience, le caractère non invasif et l’efficacité de l’analyse RSA1. L’une de ces améliorations consiste à modifier la taille des pores du treillis de polypropylène utilisé pour maintenir les plantules. La taille des pores du maillage peut être ajustée pour répondre aux besoins spécifiques des espèces végétales étudiées et pour optimiser la croissance et le développement des systèmes racinaires 1,10,11,12. Par exemple, une taille de pores de maille plus grande (500 μm) facilite la cueillette en douceur de plantules entières sans couper l’hypocotyle, ce qui était pratiqué auparavant10,11,12. En outre, une taille de pores plus grande peut convenir mieux aux espèces végétales plus grandes RSA, tandis qu’une taille de pores plus petite peut être plus appropriée pour les espèces végétales plus petites. Une autre modification qui peut être apportée consiste à envelopper le treillis de polypropylène dans du papier d’aluminium pour l’empêcher de se plier. Cela peut aider à maintenir la forme et l’intégrité du treillis, ce qui le rend approprié pour servir de matrice de plancher plat. Outre ces modifications, d’autres techniques de dépannage peuvent être utilisées pour résoudre les problèmes pouvant survenir lors de l’analyse RSA. Par exemple, si les plantules ne grandissent pas ou ne se développent pas comme prévu, il peut être nécessaire d’ajuster les conditions environnementales, telles que la température, l’humidité et les niveaux de lumière. Si les systèmes racinaires sont enchevêtrés, il peut être nécessaire de réduire le nombre de graines par maille, comme mentionné ci-dessus.

L’un des principaux avantages de l’analyse RSA est qu’elle permet d’étudier les systèmes racinaires des plantes sans avoir besoin d’agar. La gélose est couramment utilisée comme agent solidifiant dans les expériences de culture de tissus végétaux et de germination des graines. Cependant, l’utilisation de gélose peut introduire une contamination élémentaire qui peut potentiellement générer des artefacts et affecter la précision des résultats10. En excluant l’exigence de gélose agar, l’analyse RSA élimine le risque de contamination élémentaire dérivée de l’agar et le potentiel d’artefacts. Cela fait de l’analyse RSA une méthode plus fiable et plus précise pour étudier les systèmes racinaires des plantes 1,3,10,11,12. Par exemple, les effets de la privation de Pi sur la densité des racines latérales ont fait l’objet d’un certain nombre de rapports contradictoires. Il a été rapporté que la densité LR augmente lorsque Pi est faible 6,8. En revanche, une baisse de la densité racinaire latérale a également été observée dans des conditions déficientesen Pi 3,13,16. Ces écarts peuvent être attribuables au système de milieux de culture à base d’agar, dans lequel les travailleurs utilisent différentes marques de gélose pour gélifier les milieux présentant divers degrés de contamination au Pi10. Encore une fois, les expériences visant à illustrer l’effet de la carence en Zn sur le RSA peuvent ne pas être menées de manière adéquate en utilisant la méthode Petri-plaque à base d’agar, car le milieu gélifiant à base d’agar comprend également une contamination au Zn11. Par conséquent, il peut ne pas être approprié d’effectuer une analyse de l’ARS pour étudier la carence en éléments nutritifs à l’aide du milieu gélifiant à base de gélose. Deuxièmement, les plantules cultivées sur des milieux gélifiants à base d’agar ne se développent pas aussi rapidement que celles cultivées en hydroponie. Troisièmement, étant donné que le RSA est généralement incorporé dans un milieu de gélose (gélose), de nombreuses entités racine ne sont pas correctement affichées. Quatrièmement, le retrait du RSA du milieu cause souvent des dommages importants au RSA et en fait une technique d’échantillonnage destructive.

La technique hydroponique précédente, telle que publiée par Jain et al.10, utilisait un maillage en polypropylène de 250 μm, qui avait des pores plus étroits qui ne permettaient pas d’extraire le RSA intact. En conséquence, dans ce cas particulier, nous avons dû couper les plantules de la région hypocotyle pour séparer le RSA, le transformant en une méthode d’échantillonnage destructive10,11,12. La méthode existante est improvisée pour le rendre non destructif en utilisant un maillage en polypropylène avec une taille de pores plus grande (500 μm) qui permet d’extraire des plantules entières d’Arabidopsis intactes sans infliger de dommages au RSA1. Il est intéressant de noter que nous pouvons toujours ajuster la taille des pores du maillage en polypropylène, en fonction du type de plantule. Par exemple, la figure 4 illustre comment une approche similaire peut être utilisée pour cartographier l’ASR de différentes plantes, comme Medicago sativa (luzerne). Nous avons opté pour la taille des pores en polypropylène de 1 mm pour accommoder le système racinaire Medicago.

Un inconvénient de ce système pourrait être le développement de poils racinaires, qui souvent ne s’épanouissent pas sous les systèmes hydroponiques par rapport aux systèmes de plaques d’agar. La cause principale est la disponibilité facile des nutriments dans les milieux liquides plutôt que dans les milieux solides. Même si nous avons observé le développement de poils racinaires (non robustes) en utilisant le même système et obtenu les résultats (Figure supplémentaire 1). La disponibilité de Pi affecte fortement le développement des poils racinaires10,11. Ici, la longueur des poils de la racine a d’abord augmenté jusqu’à 2,5 mM, puis a diminué.

Dans l’ensemble, les principaux avantages du système sont: (1) il s’agit d’une méthode simple et précise qui ne nécessite aucun équipement sophistiqué haut de gamme; (2) la méthode permet une croissance rapide des plantules en raison de sa nature hydroponique; 3° il s’agit d’une méthode non destructive; (4) la diffusion manuelle du RSA permet l’affichage correct de chaque trait, révélant le RSA caché, offrant un contrôle total à l’utilisateur; et (5) la méthode utilise un logiciel d’imagerie disponible gratuitement (c.-à-d. ImageJ), qui est également simple à utiliser.

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Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions le département de l’Agriculture des États-Unis (subvention 58-6406-1-017) d’appuyer cette recherche. Nous remercions également le WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, États-Unis, et le directeur du CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Inde, pour avoir fourni les installations et le soutien de l’instrument (communication manuscrite CIMAP du CSIR n° CIMAP/PUB/2022/103). SS reconnaît le soutien financier de l’Université Saint-Joseph, Philadelphie, États-Unis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arabidospsis thaliana (Col 0) Lehle Seeds WT-02 Columbia (Col-0**, no markers)*
Art brushes Amazon or any other vendor Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm)
Automated Microscope with digital camera Leica Microsystems LAS version 4.12.0, Leica Microsystems
Imaging Software ImageJ ImageJ V
 1.8.0
Magenta box GA-7 Fisher Scientific  50-255-176
Medicago sativa Johnny's Seeds
Petri-plate (150 mm x 15 mm) USA Scientific 8609-0215 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com)
Photo camera Cannon or Nikon Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode
Plant-Agar Sigma-Aldrich A3301 Agargel  Suitable for plant tissue culture
Polycarbonate Sheets Amazon 1 mm  thick
Polypropylene Mesh Amazon Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm
Scanner Epson Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi)

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References

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 192
Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal
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Shukla, D., Trivedi, P. K., Sahi, S. … More

Shukla, D., Trivedi, P. K., Sahi, S. A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits. J. Vis. Exp. (192), e64876, doi:10.3791/64876 (2023).

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