Summary
אנו משתמשים בכלי מעבדה פשוטים כדי לבחון את ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של Arabidopsis ו- Medicago. העציצים גדלים באופן הידרופוני על גבי רשת ומפוזרים באמצעות מברשת אמנותית כדי לחשוף את ה-RSA. התמונות מצולמות באמצעות סריקה או מצלמה ברזולוציה גבוהה, ולאחר מכן מנותחות באמצעות ImageJ כדי למפות תכונות.
Abstract
ידע מקיף בפיתוח ארכיטקטורת מערכת שורשי צמחים (RSA) הוא קריטי לשיפור יעילות השימוש בחומרים מזינים ולהגברת סבילות זני היבול לאתגרים סביבתיים. פרוטוקול ניסויי מוצג להקמת המערכת ההידרופונית, גידול צמחים, התפשטות RSA והדמיה. הגישה השתמשה במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה המכילה רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. הגדרות ניסוי מודגמות על ידי הערכת RSA של הצמחים תחת אספקת חומרים מזינים משתנים (פוספט [Pi]). המערכת הוקמה כדי לבחון את RSA של Arabidopsis, אבל זה בקלות להסתגל לחקור צמחים אחרים כמו Medicago sativa (אספסת). צמחי Arabidopsis thaliana (Col-0) משמשים במחקר זה כדוגמה להבנת הצמח RSA. זרעים מעוקרים על פני השטח על ידי טיפול באתנול ואקונומיקה מסחרית מדוללת, ונשמרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לריבוד. הזרעים מונבטים וגדלים על מדיום נוזלי של חצי MS על רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט. העציצים גדלים בתנאי גידול סטנדרטיים למספר הימים הרצוי, נקטפים בעדינות מהרשת ושקועים בצלחות אגר המכילות מים. כל מערכת שורשים של הצמחים נפרסת בעדינות על צלחת מלאה במים בעזרת מברשת אמנות עגולה. לוחות פטרי אלה מצולמים או נסרקים ברזולוציה גבוהה כדי לתעד את תכונות ה-RSA. תכונות השורש, כגון שורש ראשוני, שורשים רוחביים ואזור הסתעפות, נמדדות באמצעות תוכנת ImageJ הזמינה באופן חופשי. מחקר זה מספק טכניקות למדידת מאפייני שורשי צמחים בסביבות סביבתיות מבוקרות. אנו דנים כיצד (1) לגדל את הצמחים, לאסוף ולהפיץ דגימות שורש, (2) להשיג תמונות של דגימות RSA מפוזרות, (3) ללכוד את התמונות, ו-(4) להשתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת תכונות שורש. יתרונה של השיטה הנוכחית הוא המדידה הרבגונית, הקלה והיעילה של תכונות ה-RSA.
Introduction
ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA), שהיא תת-קרקעית, היא איבר חיוני לגידול צמחים ולפרודוקטיביות 1,2,3. לאחר השלב העוברי, הצמחים עוברים את השינויים המורפולוגיים המשמעותיים ביותר שלהם. האופן שבו השורשים גדלים בקרקע משפיע מאוד על צמיחת חלקי הצמח מעל פני הקרקע. צמיחת שורשים היא הצעד הראשון בנביטה. זוהי תכונה אינפורמטיבית שכן היא מגיבה באופן ייחודי לחומרים מזינים זמינים שונים 1,2,3,4. RSA מפגין רמה גבוהה של פלסטיות התפתחותית, כלומר הסביבה משמשת תמיד לקבלת החלטות על פיתוח 2,5. שינויים בסביבה הקשו על ייצור היבול בתרחיש הנוכחי. באופן רציף, ה-RSA משלב אותות סביבתיים בבחירות התפתחותיות5. כתוצאה מכך, הבנה מעמיקה של העקרונות העומדים מאחורי התפתחות שורשים חיונית ללמידה כיצד צמחים מגיבים לסביבות משתנות 2,5.
ה-RSA חש ריכוזים תזונתיים משתנים ומבצע שינויים פנוטיפיים 4,6,7,8,9,10,11,12. מחקרים מראים שמורפולוגיה של שורשים/RSA היא פלסטית מאוד בהשוואה למורפולוגיה של יורה 1,3. מיפוי תכונות RSA יעיל ביותר ברישום ההשפעה שלשינוי סביבת הקרקע הסובבת 1,11,12.
באופן כללי, פערים בהשפעה של חוסרים תזונתיים שונים על פנוטיפ השורש דווחו במחקרים קודמים רבים 3,11,13,14,15. לדוגמה, ישנם מספר דיווחים מנוגדים על שינויים הנגרמים על ידי רעב פוספט (Pi) במספר, אורך וצפיפות של שורשים רוחביים (LR). עלייה בצפיפות LR דווחה תחת מצב חסר Pi 6,8. לעומת זאת, ירידה בצפיפות LR בתנאים של מחסור ב-Pi דווחה גם על ידי מחברים אחרים 3,13,16. אחד הגורמים הבולטים לחוסר עקביות זה הוא השימוש במדיום הג'לינג הנוטה לזיהום יסודי, אשר אגר מכיל לעתים קרובות10. חוקרים בדרך כלל מגדלים את צמחי הניסוי שלהם על מערכת לוחות מבוססת אגר ורושמים את תכונות השורש. תכונות RSA רבות מוסתרות או מעוגנות לעתים קרובות בתוך חומר האגר ולא ניתן לתעדן. ניסויים הקשורים לגרימת מחסור בחומרים מזינים, שבהם משתמשים לעתים קרובות מוציאים רכיב אחד לחלוטין מהמדיום, אינם יכולים להתבצע בתווך ג'ל הנוטה לזיהום יסודי11,14,15. חומרים מזינים רבים נמצאים לעתים קרובות בכמויות משמעותיות במדיה אגר, כולל P, Zn, Fe, ועוד רבים 11,14,15. יתר על כן, צמיחת RSA איטית יותר במדיה מבוססת אגר מאשר בתווך נוזלי שאינו מבוסס אגר. כתוצאה מכך, יש צורך לבסס גישה חלופית שאינה מבוססת אגר לכימות ורישום איכותי של הפנוטיפ של RSA. כתוצאה מכך, פותחה השיטה הנוכחית, שבה מגדלים פלנטלים במערכת הידרופונית מבוססת קופסת מגנטה על גבי רשת פוליפרופילן הנתמכת על ידי טריזי פוליקרבונט 1,10,11.
מחקר זה מציג גרסה מאולתרת מפורטת של השיטה הקודמת שתוארה על ידי Jain et al.10. אסטרטגיה זו כווננה לדרישות הנוכחיות בביולוגיה של שורשי הצמח וניתן להשתמש בה גם עבור צמחים כמו אספסת, מלבד צמחי מודל. הפרוטוקול הוא הדרך העיקרית למדוד את השינויים ב-RSA, והוא דורש רק ציוד פשוט. הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד לפנוטיפ מספר תכונות שורש, כגון שורשים ראשוניים ורוחביים בתווך נורמלי ושונה (חסר Pi). הוראות שלב אחר שלב ורמזים מועילים אחרים שלוקטו מחוויותיו של המחבר מסופקים כדי לעזור לחוקרים לעקוב אחר המתודולוגיות המוצעות בשיטה זו. המחקר הנוכחי נועד לספק שיטה פשוטה ויעילה לחשיפת כל מערכת השורשים של צמחים, כולל LR מסדר גבוה יותר. שיטה זו כוללת פיזור ידני של מערכת השורשים באמצעות מברשת עגולה בצבעי מים, המאפשרת שליטה מדויקת בחשיפת השורשים 1,10,11,12. זה לא דורש ציוד יקר או תוכנה מסובכת. שיטה זו שיפרה את ספיגת החומרים המזינים ואת קצב הצמיחה; לצמחים יש תמיסה עשירה בחומרים מזינים הנספגת בקלות על ידי שורשיהם. השיטה הנוכחית מתאימה לחוקרים המעוניינים למפות בפירוט את תכונות מערכת השורשים של הצמח, במיוחד במהלך ההתפתחות המוקדמת (10-15 ימים לאחר הנביטה). הוא מתאים למערכות שורשים קטנות, צמחי מודל כמו ארבידופסיס וטבק, וצמחים לא קונבנציונליים כמו אלפלפה עד שמערכת השורשים שלהם נכנסת לקופסאות המג'נטה.
השלבים לניתוח פנוטיפי של התפתחות RSA בארבידופסיס מתוארים בפרוטוקול זה כדלקמן: (1) שיטת עיקור פני השטח של זרעים לצמחים (Arabidopsis), (2) השלבים להקמת המערכת ההידרופונית, ולאחר מכן זריעת זרעים על מדיום, (3) הליך הוצאת הזריעה המלאה והתפשטות על צלחת פטרי לניתוח RSA, (4) כיצד להקליט את התמונות עבור RSA, ו-(5) לחשב פרמטרים חשובים של RSA באמצעות תוכנת ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול כולו מסוכם באופן סכמטי באיור 1, ומציג את כל השלבים החיוניים הכרוכים בחשיפת ארכיטקטורת מערכת השורשים (RSA) של צמחים. שלבי הפרוטוקול מפורטים להלן:
1. עיקור פני השטח של זרעי Arabidopsis
- מעבירים כף מדידה זעירה (כ-100 זרעים = כ-2.5 מ"ג) של זרעים לצינור מיקרופוגה, ומשרים למשך 30 דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר (RT). הליך זה כולו מתבצע במצב אספטי.
- צנטריפוגה קצרה את צינור המיקרופוגה המכיל זרעים ב 500 x גרם במשך 5 שניות, באמצעות כל צנטריפוגה שולחנית ב RT כדי לתת לזרעים לשקוע.
- מרוקנים את המים, מוסיפים 700 מיקרוליטר של אתנול 70% (v/v), מערבלים למשך מספר שניות ומסתובבים. חזור על מערבולות וסחרור במידת הצורך, אך ודא שזמן הטיפול של אתנול 70% נשאר 3 דקות.
- לאחר 3 דקות, יש לשטוף מיד פעם אחת במים סטריליים. שמור על שלב שטיפת אתנול בזמן ככל האפשר, כמו חשיפה ממושכת אתנול מקטין נביטה.
- טפלו בזרעים עם אקונומיקה מסחרית מדוללת (4% v/v) עם טיפה של Tween-20 למשך 7 דקות. מערבבים את הזרעים עם תמיסת אקונומיקה על ידי היפוך הצינורות במהירות 8-12 פעמים, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה (500 x גרם במשך 5 שניות ב- RT). קצף נראה מופיע בצינור.
- דקרו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה בנפח 1 מ"ל ושטפו את הזרעים בחמש שטיפות לפחות במים סטריליים, לאחר אותו הליך מערבול.
- השאירו את פני השטח מעוקרים זרעים במים לדגור במשך 2-3 ימים ב 4 ° C עבור ריבוד10.
2. הגדרת מערכת הידרופונית לנביטת זרעים
- ממלאים חצי קופסת מגנטה סטנדרטית במים מזוקקים ומבצעים אוטוקלאב. בצעו אוטוקלבציה של יריעת הפוליקרבונט (צבע ברור ומרקם חלק) וחתכו מלבנים בגודל 4X8 ס"מ, כאשר נקודת האמצע מחורצת יותר ממחצית הדרך של המלבן כך ששני מלבנים עשויים להיצמד זה לזה ליצירת צורת X10. השתמש בהגדרה זו כדי להחזיק את רשת הפוליפרופילן (ריבועים בגודל 6 ס"מ x 6 ס"מ בגודל נקבוביות 250 מיקרומטר, או בהתאם לדרישה) חתוכה מגיליונות בגודל 12x 24 אינץ'10.
הערה: פוליפרופילן עמיד מאוד לחומצות, אלקליות וכימיקלים אחרים; לכן, זה כבר בחר. Autoclaving נוטה לעוות רשת פוליפרופילן; לפיכך, מומלץ לשאת בנפרד עטוף ברדיד אלומיניום. מומלץ להשתמש בתנאי אוטוקלאבינג אופייניים של 16 דקות, 121°C, 15 psi או 775 מ"מ כספית. - הוסף מדיה בסיסית סטרילית חצי MS עם ויטמינים + 1.5% (w/v) סוכרוז, כפי שתואר על ידי Shukla et al.1, לכל קופסה כדי להגיע לקצה התחתון של רשת פוליפרופילן בזרימה למינרית. כל ההליכים מתבצעים בתנאים אספטיים.
- זרעו את הזרעים המעוקרים על פני השטח על הרשת (גודל נקבוביות של 250 מיקרומטר) באופן הידרופוני ואפשרו להם לגדול במשך 3 ימים.
- לאחר 3 ימים, מעבירים את השתילים לרשת (גודל נקבוביות 500 מיקרומטר) ומאפשרים להם לגדול במשך יומיים.
- לאחר יומיים (סה"כ 5 ימים), להעביר את השתילים על מדיה הבקרה (כלומר, שונה MS מזין מדיה 1 המכיל 2.0 mM NH 4 NO 3, 1.9 mM KNO3, 0.15 mM MgSO 4·7H 2O,0.1 mM MnSO4· H2O, 3.0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0.1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0.3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5.0 μM KI, 0.1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0.1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0.1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1.25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O,1.5% סוכרוז, 1.25 mM MES, pH 5.7 מותאם עם 0.1 M MES [pH 6.1]) ולמדיה הניסיונית (למשל, טיפול P- [0 mM]; KH2 PO 4 מוחלף ב 0.62 mM K2SO4 מהרכב אמצעי הבקרה כאמור לעיל1. עבור טיפולי פאי עודפים, הריכוז של KH 2 PO4 גדל בתווך טרשת נפוצה שונה [2.5, 5.0, 10.0, 20.0 מילימול]1) ולתת לזרעים לגדול במשך 7 ימים.
הערה: גודל נקבוביות רשת גדול יותר (500 מיקרומטר) מאפשר קטיף חלק של שתילים שלמים ללא כל נזק או צורך לחתוך בהיפוקוטיל. הצמחים גדלים בתנאי גידול סטנדרטיים (כלומר, 16 שעות אור / 8 שעות כהות פוטופריוד, 150 μmol·m-2·s-1 עוצמת אור, 60%-70% לחות) ב 23 ° C.
3. בחינת RSA
- הכינו צלחות אגר (1.1%) לפיזור שורשים (גודל צלחת פטרי: 150 מ"מ x 15 מ"מ).
- הוסף 10-20 מ"ל של מי ברז מסוננים autoclaved לצלחת Petri, כאמור לעיל. מוציאים בעדינות את השתילים מהרשת (500 מיקרומטר) וטובלים אותם במים על הצלחות.
- מורחים בעדינות את שורש העציץ בצלחת המלאה במים בעזרת מברשת אמנותית עגולה בצבעי מים (גדלים: מס' 14, 16, 18 ו-20).
הערה: בעת ביצוע התפשטות מערכת השורשים, ראשית לתפוס את השורש הראשוני ולהפיץ אותו לקו ישר, כפי שהוא משמש ציר. לאחר מכן, פזרו את ה-LR באופן סימטרי בכל צד של השורש הראשוני, במידת האפשר. לאחר מכן, להפיץ את LR מסדר שני מקושר LR מסדר ראשון. תהליך ההתפשטות הזה הוא סוג של אמנות; עשו זאת בעדינות, לאט, כמו אמן שמצייר תמונה של ה-RSA. - הטו מעט את הצלחת כדי להסיר את המים.
הערה: בשלב זה, ניתן להשהות את ההליך על ידי הצבת לוחות התפשטות אלה ב -4 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, כאשר נדרש עיבוד תמונה, הוציאו את הלוחות והניחו אותם ב- RT לזמן מה. נגבו את המים המעובים, ואז ניתן יהיה לעבד את התמונה בנוחות.
4. הקלטת תמונות עבור RSA
- סרקו או צלמו את לוחות הפטרי הללו בהתאם.
הערה: לקבלת תמונות באיכות גבוהה, רזולוציית 600 dpi מומלצת לסריקה, ולפחות מצלמת 12 מגה פיקסל מומלצת לצילום. - מדוד את תכונות ארכיטקטורת מערכת הבסיס באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) הזמינה באופן חופשי. כדי לבצע במהירות את השלבים למדידת אורך השורש באמצעות תוכנת ImageJ, עיין בדוגמה "מדידת אורך מתאר DNA"17.
הערה: שלבים אלה מבוצעים כדי למדוד את אורכי הבסיס בתמונות שצולמו באמצעות סורק או מצלמה ברזולוציה גבוהה.- השתמש במרחק נתון של אורך כדי להגדיר את קנה המידה. המרחק הידוע של סרגל קנה המידה באיור 3 הוא 2 ס"מ. בחרו בכלי קו ישר מסרגל הכלים ImageJ (הכלי החמישי משמאל). השתמשו בכלי קו ישר ליצירת בחירת קו המתווה את סרגל קנה המידה. סיים חלוקה לרמות על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה כפולה או לחיצה בתיבה בהתחלה.
- מדוד את אורך סרגל קנה המידה הידוע בפיקסלים באמצעות סרגל הכלים Analyze > Measure . רשום לעצמך את אורך הפיקסלים.
- פתח את תיבת הדו-שיח הגדרת קנה מידה על-ידי לחיצה על הכרטיסיה הגדרת קנה מידה בכרטיסיה ניתוח . בשדה 'מרחק בפיקסלים ', הזינו את אורך הפיקסלים (כפי שצוין לעיל). לאחר מכן, בשדה מרחק ידוע , הזן את הערך, כפי שמוצג בסרגל קנה המידה (כאן, הוא 20 מ"מ). הגדר את יחידת האורך כ - mm. יחסי הגודל של הפיקסלים הם 1.0. עכשיו, קנה המידה מוגדר על ידי x מספר פיקסלים למילימטר. כדי לנעול את קנה המידה עבור תמונה מסוימת זו, לחץ על אישור.
- צרו בחירת שורה המתארת את אורך השורש בעזרת הכלי קו מקוטע . סיים חלוקה לרמות על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני, לחיצה כפולה או לחיצה בתיבה בהתחלה. לחץ וגרור את ה"נקודות אחיזה" הקטנות בשחור-לבן לאורך המיתאר כדי להתאים את בחירת הקו בהתאם לצורך.
- השתמש בפקודה Measure תחת הכרטיסייה Analyze של ImageJ כדי לכמת את אורך השורש. כדי להעביר את הנתונים הנמדדים לגיליון אלקטרוני, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על החלון תוצאות , בחר העתק הכל מהתפריט המוקפץ, עבור לגיליון האלקטרוני ולאחר מכן הדבק את הנתונים.
הערה: כמתואר לעיל, הגדר את קנה המידה באמצעות המרחק הידוע של סרגל קנה המידה באפשרות ImageJ set scale scale. זה נותן את מספר הפיקסלים ליחידת אורך. הוא נדרש להגדיר מחדש את קנה המידה בכל פעם, בכל פעם שתמונה חדשה מנותחת.
- מדידה וחישוב של תכונות RSA
- מדדו את אורך השורש הראשוני בין צומת ההיפוקוטיל לקצה קצה השורש.
- מדוד את אורך LR מסדר ראשון ושני.
- מדוד את אזור ההסתעפות (BZ) של השורש הראשי. אזור ההסתעפות של השורש הראשוני (BZ PR) משתרע על פני נקודת ההתפרצות הראשונה של LR עד לנקודת ההתפרצות האחרונה שלLR.
- רשום את מספר ה- LRs, שהוא מספר ה- LR שמקורו בגבוליחסי הציבור של BZ.
- מדוד את האורך הממוצע של LR מסדר ראשון ומעלה. גזור את האורך הממוצע של LR מסדר ראשון (1° LR) (סנטימטר לכל שורש) על ידי חלוקת האורך הכולל של 1° LR במספר הכולל של 1° LR.
- מדוד את האורך הממוצע של LR מסדר שני. חשב את האורך הממוצע של LR מסדר שני (2° LR) על ידי חלוקת האורך הכולל של 2° LR במספר הכולל של 2° LR.
- מדוד את צפיפות LR של 1°. חשב את צפיפות LR של 1° (מספר של 1° LR ליחידת אורך של BZPR) על ידי חלוקת מספר ה- LR של 1° באורך ה- PR של BZ.
- מדוד את צפיפות LR של 2°. חשב את צפיפות LR של 2° על ידי חלוקת מספר ה- LR של 2° באורך ה- BZ של 1° LR (מספר של 2° LR ליחידת אורך של BZ של שורשים רוחביים של 1°).
- מדוד את אורך השורש הכולל (TRL). זהו המצרף של השורש הראשוני, 1° LR ו-2° LR (ויותר, אם קיים).
5. מדידת שיער שורש
הערה: למרות שהמערכת ההידרופונית אינה טובה בקידום צמיחת והתפתחות שיער שורשי, למרות היותה חזקה כמו שהיא במצעי צמיחה מוצקים, עדיין חשוב ללמוד אותה בהקשר הנוכחי. בצע את השלבים הבאים כדי לנתח את התפתחות שיער השורש בחתך של 5 מ"מ מקצה השורש העיקרי של השתילים.
- חותכים קטע של 2 ס"מ מהשורש הראשוני מקצה השורש.
- הרכיבו את מקטע השורש על שקופית באמצעות 10% גליצרול כאמצעי הרכבה.
- מקם את השקופית מתחת למיקרוסקופ סטריאו.
- השתמש במנשא הצירי כדי להמחיש וללכוד תמונות של שערות השורש.
- נתח את התמונות כדי ללמוד את המבנה והמאפיינים של שערות השורש באמצעות תוכנת ImageJ כפי שתואר קודם לכן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התכונות המורפומטריות השונות של ארכיטקטורת מערכת שורשים (RSA) נמדדות באמצעות כלי מעבדה פשוטים, והשלבים מתוארים באופן סכמטי באיור 1. פרטי המערך ההידרופוני מדגימים את הפוטנציאל של הפרוטוקול במדידת RSA (איור 1 ואיור 2).
בהתחשב בהבדלים שנצפו בחומרים הג'לינגיים, השתמשנו במערכת גידול הידרופונית כדי לבצע את כל המחקרים 3,10. כהוכחת היתכנות, המערכת ההידרופונית הזו פועלת היטב, ומשקפת את הפנוטיפ המנוגד לכאורה בתנאים לקויים ומספיקים של פאי (איור 3). זרעי ארבידופסיס טופחו הידרופונית במשך 5 ימים בתווך של חצי טרשת נפוצה על רשת פוליפרופילן, כפי שמודגם באיור 2. הצמחים הושתלו לאחר 5 ימים בתנאים לקויים ומספיקים של פאי, והורשו לגדול במשך 7 ימים (איור 3).
הדגמת תכונות RSA תחת אספקת חומרים מזינים מגוונים (Pi)
עקבנו אחר תוכנית מבוססת לנתח ולרשום את התכונות של RSA3. תכונות RSA שונות נותחו תחת משטרי פאי מנוגדים בתנאים הידרופוניים (איור 3). הטיפול בחסר Pi (0 mM Pi) השתמש בפנוטיפ שורש שדווח בדרך כלל, והציג RSA קצר יותר, רדוד יותר ומסועף פחות בהשוואה למצב המספיק של Pi (איור 3A). אורך השורש הראשוני נחלש משמעותית במצב של חסר פאי (איור 3A,B). אורך שורש ראשוני, שנצבר במהירות בנוכחות פאי (1.25 מילימול), מראה את יעילות המערכת ההידרופונית המשקפת את השינויים הפיזיו-מורפולוגיים כראוי (איור 3A,B). ה-TRL ירד משמעותית במצב של מחסור ב-Pi (איור 3B). אזור ההסתעפות (BZPR), כפי שמוצג באיור 3A, נחלש באופן משמעותי במצב של חסר Pi (איור 3B).
מבין תכונות אלה, המושפע ביותר היה TRL, בגלל ההבדל הגבוה במספר LR בין שני תנאי Pi. הצמיחה הנמרצת של RSA בתנאי Pi מספיק (1.25 mM) נבעה מגידול משמעותי במספר ואורך של 1° LR. לפיכך, שינוי RSA מהיר התרחש, בעיקר בשל השינוי בפיתוח LR. מדדנו את מספר ה-LR שמקורם בגבול אזור ההסתעפות של השורש הראשוני, מכיוון שהם נחשבים משמעותיים יותר 1,3,18. האורך הממוצע של 1° LR (סנטימטר לכל שורש) הופחת באופן משמעותי במצב של מחסור ב-Pi (איור 3C). האורך הממוצע של 2° LR הופחת באופן דומה, עקב תנאי P0; עם זאת, הוא היה נמוך יותר בכמות מהאורך הממוצע של 1° LR (איור 3C). מספר ה-LR של 1° ו-2° LR ירד מאוד בתנאי P0 בהשוואה לתנאי P1.25 (איור 3D). צפיפות 1° LR (מספר 1° LR לסנטימטר של אורךBZ PR) לא השתנתה בתנאי P0 ביחס לתנאי P1.25 (איור 3E). צפיפות 2° LR (מספר 2° LR לסנטימטר של BZ של 1° LR) גם לא הראתה שינוי משמעותי (איור 3E). כתוצאה מכך, קביעת צפיפות ה-LR חיונית להשגת תובנה מועילה לגבי פלסטיות ה-RSA.
ניתוח התפתחות שיער שורש תחת משטרי פוספט (Pi) משתנים
השפעת אספקת פאי על התפתחות שיער שורש נחקרה בשורש הראשוני של שתילים. נמצא כי אורך שיער השורש עלה עם עלייה בריכוזים של פאי עד 2.5 מילימול, אך ירד ב 5 מ"מ ו -10 מילימול. אולם ב-20 מילימול, אורך שיער השורש חזר לרמות הקרובות לשיא (איור משלים 1). מספר שערות השורש היה גבוה משמעותית ועמד על 0 מילימטר בהשוואה לכל שאר שערות ה-Pi, כאשר המספר הגבוה ביותר נצפה היה 20 מילימטר (איור משלים 1).
יישום השיטה הנוכחית על צמחים שאינם ארבידופסיס
בדקנו את היתכנות השיטה הנוכחית על צמחים שאינם ארבידופסיס, תוך נטילת Medicago sativa (אספסת) כצמח ניסוי. הפרוטוקול שונה בהתאם לדרישה של שני היבטים: (1) שיטת עיקור פני השטח של הזרעים, ו-(2) גודל הנקבוביות של רשת הפוליפרופילן (כיום גדולה יותר, 1,000 מיקרומטר). פרוטוקול עיקור וריבוד זרעי פני השטח תמיד צריך להיות אופטימלי בהתאם לצמחים שנבחרו לחקור. עבור אספסת, ננקטו צעדים כמתואר על ידי שבועות ואחרים 19. לאחר עיקור פני השטח, הזרעים הודגרו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 7 ימים לריבוד. לאחר מכן, עקבנו אחר אותו הליך המתואר בפרוטוקול זה עם שינוי בגודל נקבוביות הרשת. כפי שניתן לראות באיור 4A,B, הצמחים גדלו היטב, עם RSA שונה תחת אספקה משתנה של פאי. איור 4C מציג את הפלסטיות של מערכת השורשים מתחת ל-1.25, 0 ו-20 מילימטר של תמיסת מזון Pi. עודף פאי (20 מילימטר) ואספקת פאי לקויה הובילו לירידה בהתפתחות מערכת השורשים, בהשוואה למצב פאי מספיק (1.25 מילימטר) (בקרה) (איור 4C). ניתן למפות את ה-RSA עבור תכונות שונות באמצעות תוכנת ImageJ המתוארת בפרוטוקול. לפיכך, הפרוטוקול הוא פשוט, יעיל, וניתן לשנות אותו בקלות בהתאם למיני הצמחים שנבחרו. הוא מציע הזדמנות ללמוד את RSA של מיני צמחים מגוונים בתנאים תזונתיים שונים.
איור 1: סכמה של ההליך. התרשים הסכמטי מתאר את השלבים העיקריים הכרוכים בפרוטוקול השיטה למיפוי RSA. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תצוגה של מערך הידרופוני בקופסאות מגנטה לגידול צמחים . (כפי שתואר על-ידי Jain et al.10, עם שינויים). (A) שני חלקים מלבניים (4 ס"מ x 8 ס"מ) עם חריצים של טריזי פוליקרבונט להרכבת המערך. (B) הרכבה של טריזי פוליקרבונט זה לתוך זה באמצעות חריץ שהופך לצורת X כדי לתמוך במשטח הרשת. (C) יריעת רשת פוליפרופילן בגודל 250 מיקרומטר (6 ס"מ x 6 ס"מ). (D) מבט מלמעלה על הרכבת טריזי פוליקרבונט בקופסת המג'נטה. (E) הרכבת רשת הפוליפרופילן על טריזי הפוליקרבונט בקופסת מגנטה מלאה במדיה. (F) תצוגה של צמחי Arabidopsis שנבטו על הרשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדגמה של אפנון RSA טיפוסי בתנאים תזונתיים משתנים (חסר Pi [0 מילימול] ומספיק [1.25 מילימול]) באמצעות שיטת הפנוטיפ הזו. שתילי Arabidopsis (Col-0) גדלים הידרופונית במדיה של 0.5x MS במשך 5 ימים, ולאחר מכן נתונים למחסור ב-Pi ולאספקה מספקת (0 ו-1.25 מילימול, בהתאמה) ומגודלים במשך 7 ימים, כפי שמוצג באיור 2. (A) עציצים בודדים נשלפים מרשת הפוליפרופילן (500 מיקרומטר) ונמרחים על לוחות אגר פטרי בעזרת מברשת אמנות עגולה ומים. נתונים של תכונות RSA מוצגים עבור (B) אורך שורש ראשוני (PR), אורך שורש כולל (TRL), אזור הסתעפות (BZ), (C) ממוצע (Av.) אורך שורש רוחבי מסדר ראשון (1° LR), ממוצע (Av.) אורך שורש רוחבי מסדר שני (2° אורך LR), (D) מספר של 1° LR ו- 2° LR, ו- (E) צפיפות 1° LR ו- 2° LR. ערכים הם אמצעים ± SE; n = 21. נתון זה שונה מ-Shukla et al.1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הדגמה של מערכת שורשי אספסת (Medicago sativa) כדוגמה כדי להראות את הישימות של שיטה זו על צמחים אחרים מלבד Arabidopsis. (A) מבט מהצד על קופסת המג'נטה המראה את צמיחת צמחי אלפלפה. (B) התצוגה העליונה של קופסת המג'נטה מראה את הופעת הנבטה על רשת הפוליפרופילן (גודל נקבוביות של 1,000 מיקרומטר). (C) ארכיטקטורת מערכת השורשים הטיפוסית (RSA) של אפנון אלפלפה בתנאים תזונתיים משתנים (חסר Pi [0 מילימול], עודף Pi [20 מילימול], ומספיק או בקרה [1.25 מילימול]) באמצעות שיטת פנוטיפ RSA זו. שתילי אלפלפה גדלים הידרופונית במדיה של 0.5x MS במשך 5 ימים, נתונים לאספקה חסרה, מספקת ועודפת של Pi (0, 1.25 ו- 20 מילימול, בהתאמה), ומגודלים במשך 7 ימים. עציצים בודדים נשלפים מרשת הפוליפרופילן (1,000 מיקרומטר) ונמרחים על לוחות אגר פטרי, כפי שמוצג ב-C, בעזרת מברשת אמנות ומים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור משלים 1: ריכוזי פאי עודפים שונים מווסתים את התפתחות שיער השורש. שתילי WT גודלו באופן הידרופוני, כמתואר בפרוטוקול. (A) חתך של 1-2 ס"מ מקצה השורש הראשוני נחתך והורכב על מגלשה עם 10% גליצרול, ותועד אזור של 5 מ"מ מהקצה למספר שיער השורש ואורכו. הנתונים מוצגים עבור (B) אורך שיער השורש ו-(C) מספר שערות השורש באזור של 5 מ"מ של קצה השורש הראשי. ערכים הם אמצעים ± SE; n = 10 (B ו - C). עמודות עם אותיות אלפא שונות שונות שונות באופן משמעותי (p ≤ 0.05) בהתאם למבחן t הזוגי של התלמיד. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עבודה זו הדגימה מיפוי RSA באמצעות ציוד מעבדה פשוט. באמצעות שיטה זו, שינויים פנוטיפיים נרשמים ברמה המעודנת. היתרון של אסטרטגיה זו הוא שחלק הצילומים לעולם לא בא במגע עם התקשורת, ולכן הפנוטיפ של הצמחים הוא מקורי. שיטה זו כוללת הקמת מערכת הידרופונית לגידול צמחים כמתואר בפרוטוקול. לאחר מכן, מוציאים כל עציץ בשלמותו ומניחים אותו על צלחת פטרי מלאה באגר. לאחר מכן מערכת השורשים מורשית להתפשט באופן ידני באמצעות מברשת אמנותית, והתמונות נלקחות לניתוח באמצעות תוכנת ImageJ 1,10,11,12.
נביטת זרעים דורשת עיקור פני השטח של זרעים כדי להסיר חיידקים, פטריות ווירוסים. אלכוהול - 70% אתנול - משמש לחיטוי משטחי זרעים. כדי לחטא זרעים מבלי להרוס אותם, זמן הטיפול של עיקור אלכוהול צריך להיות בזהירות. נביטת זרעים פוחתת כאשר עיקור אלכוהול מוגזם. תזמוני הטיפול משתנים עם מיני צמחים שונים (למשל, עבור Arabidopsis, מגבלת הזמן היא 3 דקות 1,10,11,12,20 בלבד, ואילו עבור Medicago sativa, זה 5 דקות 19. על מנת לאפשר קטיף חלק של RSA לניתוח, חשוב להגביל את מספר הזרעים לכל רשת או קופסת מגנטה, כדי למנוע הסתבכות של מערכת השורשים בינה לבין עצמה 1,10,11,12. ניתן להשיג זאת על ידי שימוש במספר קטן יותר של זרעים לכל רשת. לדוגמה, שימוש בארבעה זרעים לכל רשת יכול לעזור להפחית את הסיכון לשזירה תוך מתן אפשרות לצמיחה והתפתחות איתנה של מערכות השורשים. חשוב לציין כי מספר הזרעים האופטימלי לרשת תלוי במיני הצמחים הספציפיים ובמטרות ניתוח RSA. לדוגמה, אם ניסוי דורש רקמה עבור דרישות עיבוד נוספות במורד הזרם כמו בידוד RNA, במקרה זה, זריעה בתפזורת מומלצת (100 זרעים לרשת במקרה של Arabidopsis)1,10,11,12. קטיף עציצים מהרשת הוא תהליך עדין הדורש טיפול ותשומת לב מירבית 1,10,11. חשוב לגשת למשימה זו לאט, בעדינות ובזהירות כדי להימנע מפגיעה בעציצים העדינים. כדי לקטוף עציצים מהרשת, מומלץ להשתמש בפינצטה עדינה או במלקחיים כדי לתפוס את העציצים בעדינות אך בחוזקה. יש להרים בזהירות את העציצים מהרשת כדי למנוע הפרעה למערכת השורשים או גרימת נזק כלשהו לצמחים. חשוב להיות סבלניים ולקחת את הזמן להסיר בזהירות כל עציץ מהרשת כדי להבטיח שהם לא ניזוקו במהלך התהליך. זהו תהליך הדרגתי שיש לבצע לאט, בעדינות ובזהירות כדי להבטיח את הצלחת הניסוי. על מנת למדוד במדויק את RSA של צמחים, חיוני לסמן סולם על לוח פטרי כדי לאפשר מדידה מדויקת 1,10,11. ניתן לעשות זאת על ידי שימוש בטוש קבוע כדי לצייר קו על לוח פטרי במרחק ידוע, כגון 1 ס"מ או 2 ס"מ. יש למקם את הסולם לאורך קצה צלחת הפטרי במיקום גלוי. באמצעות מברשת, חשוב גם לנקוט בזהירות מרבית בעת מריחת RSA. יש למקם בזהירות את השורש הראשוני במרכז לוח הפטרי, ואת השורשים הרוחביים יש לפרוש משני צידי השורש הראשוני. מערכת השורשים צריכה להיות שקועה חלקית במים כדי להקל על ההתפשטות. כדי למדוד כל צלחת פטרי חדשה, יש להגדיר את קנה המידה בתוכנת ImageJ בכל פעם.
ניתן להשתמש בשינויים מעטים כדי לשפר את היעילות, הלא פולשניות והיעילות של ניתוח RSA1. שיפור אחד כזה הוא לשנות את גודל הנקבוביות של רשת הפוליפרופילן המשמשת להחזקת הצמחים. ניתן להתאים את גודל הנקבוביות של הרשת לצרכים הספציפיים של מיני הצמחים הנחקרים ולייעל את הצמיחה וההתפתחות של מערכות השורשים 1,10,11,12. לדוגמה, גודל נקבוביות רשת גדול יותר (500 מיקרומטר) מאפשר קטיף חלק של שתילים שלמים מבלי לחתוך את hypocotyl, אשר היה נהוג קודם לכן10,11,12. יתר על כן, גודל נקבוביות גדול יותר עשוי להתאים יותר למיני צמחים גדולים יותר RSA, בעוד שגודל נקבוביות קטן יותר עשוי להתאים יותר למיני צמחים קטנים יותר. שינוי נוסף שניתן לבצע הוא לעטוף את רשת הפוליפרופילן ברדיד אלומיניום כדי למנוע ממנו להתכופף. זה יכול לעזור לשמור על הצורה והשלמות של הרשת, מה שהופך אותה מתאימה לשמש כמטריצה לרצפה שטוחה. בנוסף לשינויים אלה, ניתן להשתמש בטכניקות פתרון בעיות אחרות כדי לטפל בכל בעיה שעלולה להתעורר במהלך ניתוח RSA. לדוגמה, אם הצמחים אינם גדלים או מתפתחים כצפוי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי הסביבה, כגון הטמפרטורה, הלחות ורמות האור. אם מערכות השורשים שזורות, ייתכן שיהיה צורך בהפחתת מספר הזרעים לכל רשת, כאמור לעיל.
אחד היתרונות העיקריים של ניתוח RSA הוא שהוא מאפשר לחקור מערכות שורשים של צמחים ללא צורך באגר. אגר משמש בדרך כלל כחומר ממצק בתרביות רקמת צמחים ובניסויים בנביטת זרעים. עם זאת, שימוש באגר יכול להכניס זיהום יסודי שיכול ליצור ממצאים פוטנציאליים ולהשפיע על דיוק התוצאות10. על ידי אי הכללת הדרישה לאגר, ניתוח RSA מבטל את הסיכון לזיהום יסוד שמקורו באגר ואת הפוטנציאל לחפצים. זה הופך את ניתוח RSA לשיטה אמינה ומדויקת יותר לחקר מערכות שורשי צמחים 1,3,10,11,12. לדוגמה, ההשפעות של חסך פאי על צפיפות השורשים הצידית היו נושא למספר דיווחים סותרים. דווח כי צפיפות LR עולה כאשר Pi נמוך 6,8. לעומת זאת, ירידה בצפיפות השורשים הצידית נמצאה גם בתנאי חסר פאי 3,13,16. ניתן לייחס פערים אלה למערכת מדיה צמיחה מבוססת אגר, שבה עובדים משתמשים במותגים שונים של אגר כדי לג'ל מדיה בדרגות שונות של זיהום פאי10. שוב, ניסויים המבקשים להמחיש את ההשפעה של מחסור ב-Zn על RSA עשויים שלא להתבצע כראוי תוך שימוש בשיטת צלחת פטרי המבוססת על אגר, מכיוון שמדיום הג'לינג מבוסס האגר כולל גם זיהום Zn11. לכן, ביצוע ניתוח RSA עשוי שלא להיות מתאים לחקור מחסור תזונתי באמצעות מדיום ג'לינג מבוסס אגר. שנית, צמחים הגדלים על מצע ג'לינג מבוסס אגר אינם מתפתחים במהירות כמו אלה המעובדים באופן הידרופוני. שלישית, מכיוון שה- RSA מוטבע בדרך כלל בתווך אגר, תכונות שורש רבות אינן מוצגות כראוי. רביעית, הוצאת ה-RSA מהמדיום גורמת לעיתים קרובות נזק משמעותי ל-RSA והופכת אותו לטכניקת דגימה הרסנית.
הטכניקה ההידרופונית הקודמת, כפי שפורסמה על ידי Jain et al.10, השתמשה ברשת פוליפרופילן בגודל של 250 מיקרומטר, שהיו לה נקבוביות צרות יותר שלא אפשרו לשלוף את ה-RSA השלם. כתוצאה מכך, במקרה הספציפי הזה, נאלצנו לחתוך את הצמחים מאזור ההיפוקוטיל כדי להפריד את ה-RSA, ולהפוך אותו לשיטת דגימה הרסנית10,11,12. השיטה הקיימת מאולתרת כדי להפוך אותה לבלתי הרסנית באמצעות רשת פוליפרופילן בעלת גודל נקבוביות גדול יותר (500 מיקרומטר) המאפשרת לשלוף צמחי ארבידופסיס שלמים ללא פגע מבלי לגרום נזק ל-RSA1. כדאי לציין כי תמיד נוכל להתאים את גודל הנקבוביות של רשת הפוליפרופילן, בהתאם לסוג הצמח. לדוגמה, איור 4 מדגים כיצד גישה דומה יכולה לשמש למיפוי RSA של צמחים שונים, כמו למשל Medicago sativa (אספסת). בחרנו בגודל נקבוביות פוליפרופילן של 1 מ"מ כדי להתאים למערכת השורשים של Medicago.
חסרון אחד של מערכת זו עשוי להיות התפתחות של שערות שורש, אשר לעתים קרובות אינן משגשגות במערכות הידרופוניות בהשוואה למערכות לוחות אגר. הסיבה העיקרית היא הזמינות הקלה של חומרים מזינים במדיה נוזלית ולא במדיה מוצקה. אף על פי שצפינו בהתפתחות של שערות שורש (לא חזקות) באמצעות אותה מערכת וקיבלנו את התוצאות (איור משלים 1). הזמינות של פאי משפיעה מאוד על התפתחות שיער שורש10,11. כאן, אורך שיער השורש גדל בתחילה עד 2.5 מילימול, ולאחר מכן ירד.
בסך הכל, היתרונות העיקריים של המערכת הם: (1) זוהי שיטה פשוטה ומדויקת שאינה דורשת ציוד מתקדם מתוחכם; (2) השיטה מאפשרת גידול מהיר של הצמחים בשל אופיו ההידרופוני; (3) זוהי שיטה שאינה הרסנית; (4) פריסה ידנית של ה-RSA מאפשרת הצגה נאותה של כל תכונה, חושפת את ה-RSA הנסתר, ומציעה שליטה מלאה למשתמש; ו-(5) השיטה משתמשת בתוכנת הדמיה זמינה באופן חופשי (כלומר, ImageJ), שגם היא פשוטה לשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים למשרד החקלאות האמריקאי (מענק 58-6406-1-017) על תמיכתו במחקר זה. אנו מודים גם למרכז הביוטכנולוגיה WKU, אוניברסיטת מערב קנטקי, באולינג גרין, KY, ארה"ב, ולמנהל המכון המרכזי CSIR לצמחי מרפא וריח, לאקנאו, הודו, על אספקת מתקני המכשיר והתמיכה (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). SS מודה על התמיכה הכספית מאוניברסיטת סנט ג'וזף, פילדלפיה, ארה"ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
