Summary
Usamos ferramentas laboratoriais simples para examinar a arquitetura do sistema radicular (RSA) de Arabidopsis e Medicago. As plântulas são cultivadas hidroponicamente sobre malha e espalhadas usando um pincel de arte para revelar a RSA. As imagens são tiradas usando digitalização ou uma câmera de alta resolução e, em seguida, analisadas com o ImageJ para mapear traços.
Abstract
O conhecimento abrangente do desenvolvimento da arquitetura do sistema radicular das plantas (RSA) é fundamental para melhorar a eficiência do uso de nutrientes e aumentar a tolerância das cultivares aos desafios ambientais. Um protocolo experimental é apresentado para a montagem do sistema hidropônico, crescimento de plântulas, disseminação da ASR e obtenção de imagens. A abordagem utilizou um sistema hidropônico à base de caixa magenta contendo tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato. Os cenários experimentais são exemplificados pela avaliação da ASR das plântulas sob oferta variável de nutrientes (fosfato [Pi]). O sistema foi estabelecido para examinar a ASR de Arabidopsis, mas é facilmente adaptável para estudar outras plantas como Medicago sativa (Alfafa). As plântulas de Arabidopsis thaliana (Col-0) são utilizadas nesta investigação como exemplo para o entendimento da planta RSA. As sementes são esterilizadas superficialmente por tratamento com etanol e água sanitária comercial diluída e mantidas a 4 °C para estratificação. As sementes são germinadas e cultivadas em meio líquido semi-MS sobre tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato. As plântulas são cultivadas sob condições padrão de crescimento para o número desejado de dias, delicadamente retiradas da malha e submersas em placas de ágar contendo água. Cada sistema radicular das plântulas é espalhado suavemente na placa cheia de água com a ajuda de um pincel de arte redondo. Essas placas de Petri são fotografadas ou digitalizadas em alta resolução para documentar as características da RSA. As características radiculares, como raiz primária, raízes laterais e zona de ramificação, são medidas usando o software ImageJ disponível gratuitamente. Este estudo fornece técnicas para medir as características radiculares de plantas em ambientes controlados. Nós discutimos como (1) cultivar as plântulas, coletar e espalhar amostras de raízes, (2) obter fotos de amostras de RSA espalhadas, (3) capturar as imagens e (4) usar software de análise de imagens para quantificar atributos radiculares. A vantagem do presente método é a medição versátil, fácil e eficiente das características da ASR.
Introduction
A arquitetura do sistema radicular (ASR), que é subterrânea, é um órgão vital para o crescimento e produtividade das plantas 1,2,3. Após o estágio embrionário, as plantas sofrem suas alterações morfológicas mais significativas. A maneira como as raízes crescem no solo afeta muito o crescimento das partes das plantas acima do solo. O crescimento radicular é o primeiro passo para a germinação. É uma característica informativa, pois responde de forma única aos diferentes nutrientes disponíveis 1,2,3,4. A ASR apresenta alto grau de plasticidade desenvolvimental, o que significa que o ambiente é sempre utilizado para tomar decisões sobre o desenvolvimento 2,5. As mudanças no ambiente têm dificultado a produção agrícola no cenário atual. De forma contínua, a ASR incorpora sinais ambientais nas escolhas de desenvolvimento5. Como resultado, uma compreensão completa dos princípios por trás do desenvolvimento radicular é essencial para aprender como as plantas respondem às mudanças em ambientes 2,5.
A ASR detecta concentrações variáveis de nutrientes e produz alterações fenotípicas 4,6,7,8,9,10,11,12. Estudos sugerem que a morfologia radicular/ASR é altamente plástica em comparação com a morfologia da parteaérea1,3. O mapeamento das características da ASR é altamente eficaz no registro do efeito da alteração do ambiente do solo circundante 1,11,12.
Em geral, discrepâncias no efeito de várias deficiências de nutrientes sobre o fenótipo radicular foram relatadas em muitos estudos anteriores 3,11,13,14,15. Por exemplo, há vários relatos contrastantes sobre mudanças induzidas pela fome de fosfato (Pi) no número, comprimento e densidade das raízes laterais (RLs). Um aumento na densidade de RV tem sido relatado sob a condição de deficiência de Pi 6,8. Em contraste, uma diminuição na densidade de RV em condições deficientes de Pi também foi relatada por outros autores 3,13,16. Uma das causas proeminentes dessas inconsistências é o uso do meio gelificante propenso à contaminação elementar, que o ágar geralmente contém10. Os pesquisadores normalmente cultivam suas plantas experimentais em um sistema de placas à base de ágar e registram as características radiculares. Numerosas características da ASR são frequentemente ocultadas ou entrincheiradas dentro do material de ágar e não podem ser documentadas. Experimentos ligados à indução de deficiência de nutrientes, nos quais os usuários frequentemente excluem totalmente um componente do meio, não podem ser realizados em meios gelificantes propensos à contaminação elementar11,14,15. Numerosos nutrientes estão frequentemente presentes em quantidades significativas no meio ágar, incluindo P, Zn, Fe e muitos outros11,14,15. Além disso, o crescimento da ASR é mais lento em meios à base de ágar do que em meios líquidos não baseados em ágar. Como resultado, há necessidade de estabelecer uma abordagem alternativa não baseada em ágar para quantificar e registrar qualitativamente o fenótipo da ASR. Consequentemente, o método atual tem sido desenvolvido, no qual as plântulas são levantadas em um sistema hidropônico à base de caixa magenta sobre uma tela de polipropileno suportada por cunhas de policarbonato 1,10,11.
Este estudo apresenta uma versão improvisada detalhada do método anterior descrito por Jain et al.10. Esta estratégia foi ajustada para as demandas atuais em biologia radicular de plantas e também pode ser usada para plantas como a alfafa, além de plantas modelo. O protocolo é a principal forma de medir as mudanças na ASR, e requer apenas equipamentos simples. O presente protocolo ilustra como fenotipar diversas características radiculares, como raízes primárias e laterais em meio normal e modificado (Pi deficiente). Instruções passo a passo e outras dicas úteis colhidas das experiências do autor são fornecidas para ajudar os pesquisadores a seguir as metodologias oferecidas neste método. O presente estudo tem como objetivo fornecer um método simples e eficaz para revelar todo o sistema radicular das plantas, incluindo as LRs de ordem superior. Este método consiste em espalhar manualmente o sistema radicular com um pincel redondo em aquarela, permitindo um controle preciso sobre a exposição das raízes 1,10,11,12. Não requer equipamentos caros ou softwares complicados. Este método melhorou a absorção de nutrientes e a taxa de crescimento; As plantas têm uma solução rica em nutrientes facilmente absorvida por suas raízes. O presente método é adequado para pesquisadores que desejam mapear detalhadamente as características do sistema radicular de uma planta, particularmente durante o desenvolvimento inicial (10-15 dias após a germinação). É adequado para pequenos sistemas radiculares, plantas modelo como Arabidopsis e tabaco, e plantas não convencionais como alfafa até que seu sistema radicular caiba nas caixas magenta.
As etapas para a análise fenotípica do desenvolvimento da ASR em Arabidopsis são descritas neste protocolo da seguinte forma: (1) o método de esterilização da superfície das sementes para plantas (Arabidopsis), (2) as etapas para a instalação do sistema hidropônico, seguido da semeadura das sementes em um meio, (3) o procedimento para retirar as plântulas completas e espalhar na placa de Petri para análise da ASR, (4) como gravar as imagens para RSA e (5) calcular parâmetros importantes de RSA usando o software ImageJ.
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Protocol
Todo o protocolo está resumido esquematicamente na Figura 1, mostrando todas as etapas essenciais envolvidas na revelação da arquitetura do sistema radicular (ASR) das plântulas. As etapas do protocolo são dadas em detalhes abaixo:
1. Esterilização da superfície das sementes de Arabidopsis
- Transfira uma colher minúscula (aproximadamente 100 sementes = aproximadamente 2,5 mg) de sementes para um tubo de microfuga e deixe de molho por 30 min em água destilada à temperatura ambiente (TR). Todo este procedimento é realizado na condição asséptica.
- Centrifugar brevemente o tubo de microfuga contendo sementes a 500 x g por 5 s, usando qualquer centrífuga de mesa em RT para deixar as sementes se acomodarem.
- Decantar a água, adicionar 700 μL de etanol a 70% (v/v), vórtice por alguns segundos e girar. Repita o vórtice e a fiação, se necessário, mas garanta que o tempo de tratamento do etanol a 70% permaneça em 3 min.
- Após 3 min, enxaguar imediatamente uma vez com água estéril. Mantenha a etapa de lavagem com etanol o mais oportuna possível, pois a exposição prolongada ao etanol diminui a germinação.
- Tratar as sementes com água sanitária comercial diluída (4% v/v) com uma gota de Tween-20 por 7 min. Misturar as sementes com solução de água sanitária invertendo os tubos rapidamente 8-12 vezes, seguido de uma breve centrífuga (500 x g por 5 s em TR). Froth é visto aparecendo no tubo.
- Decantar o sobrenadante com pipeta de 1 mL e enxaguar as sementes com pelo menos cinco lavagens com água estéril, seguindo o mesmo procedimento de vórtice.
- Deixar as sementes esterilizadas superficialmente em água e incubar por 2-3 dias a 4 °C para estratificação10.
2. Estabelecimento de um sistema hidropônico para germinação de sementes
- Encha pela metade uma caixa magenta padrão com água destilada e autoclave-a. Autoclave a folha de policarbonato (cor clara e textura lisa) e corte retângulos de 4 cm x 8 cm, com um entalhe médio mais da metade do retângulo para que dois retângulos possam se encaixar para formar um X em formade 10. Use esta configuração para segurar a malha de polipropileno (quadrados de 6 cm x 6 cm de tamanho de poro de 250 μm, ou dependendo da necessidade) cortada a partir de folhas de 12 x 24 polegadas10.
NOTA: O polipropileno é altamente resistente a ácidos, álcalis e outros produtos químicos; portanto, optou-se. A autoclavagem tende a distorcer a tela de polipropileno; Por isso, recomenda-se que seja transportado separadamente envolto em papel alumínio. Condições típicas de autoclavagem de 16 min, 121 °C, 15 psi ou 775 mm Hg são recomendadas. - Adicionar meio basal de meia EM estéril com vitaminas + 1,5% (p/v) de sacarose, conforme descrito por Shukla et al.1, a cada caixa para alcançar a borda inferior da tela de polipropileno em fluxo laminar. Todos os procedimentos são realizados em condições assépticas.
- Semear hidroponicamente as sementes esterilizadas superficialmente na malha (poros de 250 μm) e deixá-las crescer por 3 dias.
- Após 3 dias, transferir as mudas para uma malha (poros de 500 μm) e deixá-las crescer por 2 dias.
- Após 2 dias (total de 5 dias), transferir as mudas para o meio controle (i.e., meio nutriente MS modificado 1 contendo 2,0 mM NH 4 NO 3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO 4·7H2O,0,1 mM MnSO4· H 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O, 1,5% de sacarose, 1,25 mM MES, pH 5,7 ajustado com 0,1 M MES [pH 6,1]) e ao meio experimental (por exemplo, tratamento com P- [0 mM]; KH2 PO 4 é substituído por 0,62 mM K2SO4 da composição do meio de controle como mencionado acima1. Para os tratamentos com excesso de Pi, a concentração de KH 2 PO4 é aumentada em meio MS modificado [2,5; 5,0; 10,0; 20,0 mM]1) e deixa-se as sementes crescerem por 7 dias.
NOTA: Um tamanho de poro de malha maior (500 μm) facilita a colheita suave de mudas inteiras sem qualquer dano ou necessidade de corte no hipocótilo. As plântulas crescem sob condições padrão de crescimento (isto é, fotoperíodo claro de 16 h/8 h escuro, intensidade de luz de 150 μmol·m-2·s-1, umidade de 60%-70%) a 23 °C.
3. Exame da ASR
- Preparar placas de ágar (1,1%) para espalhamento radicular (tamanho da placa de Petri: 150 mm x 15 mm).
- Adicionar 10-20 mL de água filtrada autoclavada à placa de Petri, como mencionado acima. Retire suavemente as mudas da malha (500 μm) e submerja-as em água nas placas.
- Espalhe suavemente a raiz de cada plântula na placa cheia de água com a ajuda de um pincel redondo de aquarela (tamanhos: nº 14, 16, 18 e 20).
NOTA: Ao realizar a propagação do sistema radicular, primeiro pegue a raiz primária e espalhe-a em uma linha reta, pois ela serve como um eixo. Em seguida, espalhe as LRs simetricamente em cada lado da raiz primária, sempre que possível. Depois disso, espalhe o LR de segunda ordem ligado ao LR de primeira ordem. Esse processo de difusão é uma espécie de arte; faça-o suavemente, lentamente, como um artista desenhando uma imagem da RSA. - Incline levemente a placa para retirar a água.
NOTA: Neste ponto, o procedimento pode ser pausado colocando essas placas de espalhamento a 4 °C. Mais tarde, quando o processamento da imagem for necessário, retire as placas e coloque-as em RT por um tempo. Limpe a água condensada e, em seguida, a imagem pode ser processada convenientemente.
4. Gravação de imagens para RSA
- Digitalize ou fotografe essas placas de Petri adequadamente.
NOTA: Para obter fotografias de alta qualidade, a resolução de 600 dpi é recomendada para digitalização, e pelo menos uma câmera de 12 megapixels é recomendada para fotografia. - Meça as características da arquitetura do sistema raiz usando o software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) disponível gratuitamente. Para seguir rapidamente os passos para medir o comprimento da raiz usando o software ImageJ, consulte o exemplo "medindo o comprimento do contorno do DNA"17.
Observação : estas etapas são seguidas para medir os comprimentos de raiz em imagens capturadas usando um scanner de alta resolução ou câmera.- Use uma determinada distância de comprimento para definir a escala. A distância conhecida da barra de escala na Figura 3 é de 2 cm. Selecione a ferramenta Linha reta na barra de ferramentas do ImageJ (quinta ferramenta à esquerda). Use a ferramenta Linha reta para criar uma seleção de linha que contorne a barra de escala. Conclua a estrutura de tópicos clicando com o botão direito do mouse, clicando duas vezes ou clicando na caixa no início.
- Meça o comprimento da barra de escala conhecida em pixels usando a barra de ferramentas Analisar > Medir . Anote o comprimento do pixel.
- Abra a caixa de diálogo Definir Escala clicando na guia Definir Escala na guia Analisar. No campo Distância em pixels, insira o comprimento do pixel (conforme observado acima). Em seguida, no campo Distância conhecida, insira o valor, conforme mostrado pela barra de escala (aqui, é 20 mm). Defina a Unidade de Comprimento como mm. A proporção de pixels é 1.0. Agora, a escala é especificada pelo número x de pixels por milímetro. Para bloquear a escala para esta imagem em particular, clique em OK.
- Crie uma seleção de linha que contorne o comprimento da raiz usando a ferramenta Linha segmentada . Conclua a estrutura de tópicos clicando com o botão direito do mouse, clicando duas vezes ou clicando na caixa no início. Clique e arraste as pequenas "alças" em preto e branco ao longo do contorno para ajustar a seleção de linha conforme necessário.
- Use o comando Medir na guia Analisar do ImageJ para quantificar o comprimento da raiz. Para transferir os dados medidos para uma planilha, clique com o botão direito do mouse na janela Resultados , selecione Copiar Tudo no menu pop-up, alterne para a planilha e cole os dados.
Observação : como descrito acima, defina a escala usando a distância conhecida da barra de escala na opção de escala de conjunto ImageJ. Isso fornece o número de pixels por unidade de comprimento. É necessário definir a escala todas as vezes, sempre que uma nova imagem estiver sendo analisada.
- Medição e cálculo das características do RSA
- Meça o comprimento da raiz primária entre a junção do hipocótilo até a extremidade da ponta da raiz.
- Meça o comprimento LR de primeira e segunda ordem.
- Meça a zona de ramificação (BZ) da raiz primária. A zona de ramificação da raiz primária (BZPR) abrange o primeiro ponto emergente LR até o último ponto emergente LR.
- Registre o número de LRs, que é o número de LRs originadas dentro do limite do BZPR.
- Meça o comprimento médio das LRs de primeira e de ordem superior. Derive o comprimento médio da LR de primeira ordem (1° LR) (centímetro por raiz) dividindo o comprimento total da 1° LR pelo número total de 1° LRs.
- Meça o comprimento médio do LR de segunda ordem. Calcule o comprimento médio do LR de segunda ordem (2° LR) dividindo o comprimento total do 2° LR pelo número total de 2° LRs.
- Meça a densidade de 1° LR. Calcule a densidade de 1° LR (número de 1° LRs por unidade de comprimento de BZ PR) dividindo o número de 1° LRs pelo comprimento doBZ PR.
- Meça a densidade de 2° LR. Calcular a densidade de 2° LR dividindo o número de 2° LRs pelo comprimento do BZ de 1° LRs (número de 2° LRs por unidade de comprimento do BZ de 1° raízes laterais).
- Meça o comprimento total da raiz (TRL). Este é o agregado dos comprimentos da raiz primária, 1° LR e 2° LR (e mais, se presente).
5. Medição do cabelo da raiz
NOTA: Embora o sistema hidropônico não seja bom em promover o crescimento e desenvolvimento dos pelos radiculares, apesar de ser tão robusto quanto em meios sólidos de crescimento, ainda é importante estudá-lo no contexto atual. Siga os passos abaixo para analisar o desenvolvimento dos pelos radiculares em uma seção de 5 mm a partir da ponta da raiz primária das mudas.
- Pique uma seção de 2 cm da raiz primária da ponta da raiz.
- Monte a seção da raiz em uma lâmina usando glicerol a 10% como meio de montagem.
- Coloque a lâmina sob um microscópio estéreo.
- Use o transportador axial para visualizar e capturar imagens dos pelos radiculares.
- Analise as imagens para estudar a estrutura e as características dos pelos radiculares usando o software ImageJ como descrito anteriormente.
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Representative Results
As diferentes características morfométricas da arquitetura do sistema radicular (ASR) são medidas usando ferramentas laboratoriais simples, e os passos são representados esquematicamente na Figura 1. Os detalhes do arranjo hidropônico demonstram o potencial do protocolo na mensuração da ASR (Figura 1 e Figura 2).
Dadas as diferenças observadas nos gelificantes, utilizamos um sistema hidropônico de cultivo para a realização de todos os estudos 3,10. Como prova de conceito, esse sistema hidropônico funciona bem, refletindo o fenótipo contrastante aparente sob condições deficientes e suficientes de Pi (Figura 3). Sementes de Arabidopsis foram cultivadas hidroponicamente por 5 dias em meio meio MS sobre tela de polipropileno, conforme ilustrado na Figura 2. As plântulas foram transplantadas após 5 dias em condições deficientes e suficientes de Pi, e deixadas crescer por 7 dias (Figura 3).
Demonstração de características da ASR sob oferta variada de nutrientes (Pi)
Seguimos um esquema estabelecido para analisar e registrar as características da ASR3. Diferentes características da ASR foram analisadas sob regimes de Pi contrastantes em condições hidropônicas (Figura 3). O tratamento deficiente de Pi (0 mM Pi) invocou um fenótipo de raiz tipicamente relatado exibindo uma ASR mais curta, mais rasa e menos ramificada em comparação com a condição suficiente de Pi (Figura 3A). O comprimento da raiz primária foi significativamente atenuado na condição de deficiência de Pi (Figura 3A,B). O comprimento da raiz primária, rapidamente adquirido na presença de Pi (1,25 mM), mostra a eficiência do sistema hidropônico refletindo adequadamente as alterações fisiomorfológicas (Figura 3A,B). O TRL foi significativamente reduzido na condição de deficiência de Pi (Figura 3B). A zona de ramificação (BZ PR), como mostra a Figura 3A, foi significativamente atenuada na condição de Pi deficiente (Figura 3B).
Dessas características, a mais afetada foi o TRL, devido à alta diferença no número de RV entre as duas condições de Pi. O crescimento vigoroso da ASR sob a condição Pi suficiente (1,25 mM) deveu-se a um aumento significativo no número e comprimento das RVs de 1°. Assim, ocorreu uma rápida mudança na ASR, principalmente devido à alteração no desenvolvimento da RL. Medimos o número de RL originadas dentro do limite da zona de ramificação da raiz primária, por serem consideradas maissignificativas1,3,18. O comprimento médio do 1° RL (centímetro por raiz) foi significativamente reduzido na condição de deficiência de Pi (Figura 3C). O comprimento médio do 2° LR foi igualmente reduzido, devido à condição P0; no entanto, foi menor em quantidade do que o comprimento médio de 1° LR (Figura 3C). O número de LRs de 1° e 2° LRs diminuiu fortemente na condição P0 em comparação com a condição P1,25 (Figura 3D). A densidade de 1° LR (número de 1° LRs por centímetro de comprimentoBZ PR) não foi alterada na condição P0 em relação à condição P1,25 (Figura 3E). A densidade de 2° LR (número de 2° LRs por centímetro de BZ de 1° LRs) também não apresentou alteração significativa (Figura 3E). Como resultado, determinar a densidade de LRs é essencial para obter informações úteis sobre a plasticidade da RSA.
Análise do desenvolvimento dos pelos radiculares sob diferentes regimes de fosfato (Pi)
Estudou-se o efeito do fornecimento de Pi no desenvolvimento dos pelos radiculares na raiz primária das plântulas. Verificou-se que o comprimento do pelo radicular aumentou com o aumento das concentrações de Pi até 2,5 mM, mas diminuiu em 5 mM e 10 mM. No entanto, aos 20 mM, o comprimento dos pelos radiculares retornou a níveis próximos ao pico (Figura 1 Suplementar). O número de pelos radiculares foi significativamente maior a 0 mM em relação a todos os outros suprimentos de Pi, com o maior número observado em 20 mM (Figura 1 Suplementar).
Aplicação do presente método em plantas que não Arabidopsis
Examinamos a viabilidade do presente método em plantas diferentes de Arabidopsis, tomando Medicago sativa (Alfalfa) como planta teste. O protocolo foi modificado de acordo com a exigência de dois aspectos: (1) o método de esterilização da superfície das sementes e (2) o tamanho dos poros da tela de polipropileno (agora maior, 1.000 μm). O protocolo de esterilização e estratificação de sementes superficiais sempre precisa ser otimizado dependendo das plantas selecionadas para estudo. Para a alfafa, foram seguidos os passos descritos por Weeks et al.19. Após a esterilização superficial, as sementes foram incubadas a 4 °C por 7 dias para estratificação. Em seguida, seguiu-se o mesmo procedimento descrito neste protocolo, com modificação do tamanho dos poros da tela. Como mostrado na Figura 4A,B, as plântulas estavam bem crescidas, com uma ASR alterada sob diferentes suprimentos de Pi. A Figura 4C mostra a plasticidade do sistema radicular sob 1,25, 0 e 20 mM de solução nutritiva de Pi. O excesso de Pi (20 mM) e a oferta deficiente de Pi levaram à diminuição do desenvolvimento do sistema radicular, quando comparado à condição de Pi suficiente (1,25 mM) (controle) (Figura 4C). O RSA pode ser mapeado para diferentes características usando o software ImageJ descrito no protocolo. Assim, o protocolo é simples, eficiente e pode ser facilmente modificado de acordo com a espécie vegetal selecionada. Oferece a oportunidade de estudar a ASR de diversas espécies vegetais sob diferentes condições nutricionais.
Figura 1: Esquema do procedimento. O diagrama esquemático descreve as principais etapas envolvidas no protocolo de método para mapear a RSA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visualização do setup hidropônico em caixas magenta para cultivo de plântulas . (Conforme descrito por Jain et al.10, com modificações). (A) Duas peças retangulares (4 cm x 8 cm) com entalhes de cunhas de policarbonato para montagem do setup. (B) A montagem de cunhas de policarbonato umas nas outras através de entalhe que se transforma em forma de X para suportar a superfície da malha. (C) Uma folha de malha de polipropileno de 250 μm (6 cm x 6 cm). (D) Vista superior da montagem das cunhas de policarbonato na caixa magenta. (E) Montagem da tela de polipropileno sobre as cunhas de policarbonato em caixa magenta preenchida com meio. (F) Uma exibição de plântulas de Arabidopsis germinou na malha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Demonstração da modulação típica da ASR sob diferentes condições nutricionais (Pi deficiente [0 mM] e suficiente [1,25 mM]) usando este método de fenotipagem. Plântulas de Arabidopsis (Col-0) são cultivadas hidroponicamente em meio MS 0,5x por 5 dias e, posteriormente, submetidas a suprimento deficiente e suficiente de Pi (0 e 1,25 mM, respectivamente) e cultivadas por 7 dias, como mostra a Figura 2. (A) As plântulas individuais são retiradas da malha de polipropileno (500 μm) e espalhadas nas placas de Petri em ágar com a ajuda de um pincel de arte redonda e água. Os dados das características da ASR são apresentados para (B) comprimento da raiz primária (RP), comprimento total da raiz (TRL), zona de ramificação (BZ), (C) comprimento médio (Av.) da raiz lateral de primeira ordem (1° comprimento da LR), comprimento médio (Av.) da raiz lateral de segunda ordem (2° comprimento da LR), (D) número de 1° LR e 2° LR, e (E) 1° LR e 2° LR densidade. Os valores são meios ± SE; n = 21. Esse valor foi modificado de Shukla et al.1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Demonstração do sistema radicular de Medicago sativa (Alfafa) como exemplo para mostrar a aplicabilidade deste método a outras plantas além de Arabidopsis. (A) Vista lateral da caixa magenta mostrando o crescimento das plântulas de alfafa. (B) A vista superior da caixa magenta mostra a emergência da parte aérea na malha de polipropileno (tamanho de poro de 1.000 μm). (C) A arquitetura típica do sistema radicular (ASR) da modulação da alfafa sob diferentes condições nutricionais (Pi deficiente [0 mM], excesso de Pi [20 mM] e suficiente ou controle [1,25 mM]) usando este método de fenotipagem da ASR. Mudas de alfafa são cultivadas hidroponicamente em meio MS 0,5x por 5 dias, submetidas a suprimento deficiente, suficiente e excessivo de Pi (0, 1,25 e 20 mM, respectivamente) e cultivadas por 7 dias. As plântulas individuais são retiradas da malha de polipropileno (1.000 μm) e espalhadas nas placas de Petri em ágar, como mostrado em C, com a ajuda de um pincel de arte e água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Diferentes concentrações excessivas de Pi modulam o desenvolvimento dos pelos radiculares. As plântulas WT foram cultivadas hidroponicamente, conforme descrito no protocolo. (A) Um corte de 1-2 cm da ponta da raiz primária foi picado e montado em uma lâmina com glicerol a 10%, e uma região de 5 mm da ponta foi documentada para o número e comprimento de pelos radiculares. São apresentados dados para (B) o comprimento do pelo radicular e (C) o número de pelos radiculares em uma região de 5 mm da ponta primária da raiz. Os valores são meios ± SE; n = 10 (B e C). Barras com diferentes letras alfa diferem significativamente (p ≤ 0,05) de acordo com o teste t pareado de Student. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Este trabalho demonstrou o mapeamento da ASR utilizando equipamentos laboratoriais simples. Usando este método, as alterações fenotípicas são registradas no nível refinado. O benefício dessa estratégia é que a parte aérea nunca entra em contato com a mídia, de modo que o fenótipo das plântulas é original. Este método envolve a criação de um sistema hidropônico para o cultivo de plântulas, conforme descrito no protocolo. Em seguida, cada plântula é retirada intacta e colocada em uma placa de Petri cheia de ágar. O sistema radicular é então liberado manualmente usando um pincel de arte, e as fotografias são tiradas para serem analisadas com o software ImageJ 1,10,11,12.
A germinação de sementes requer esterilização da superfície das sementes para remover bactérias, fungos e vírus. O álcool - etanol 70% - é usado para esterilizar a superfície das sementes. Para desinfetar as sementes sem destruí-las, o tempo de tratamento da esterilização alcoólica precisa ser cuidadosamente seguido. A germinação das sementes diminui quando a esterilização por álcool é exagerada. Os tempos de tratamento variam de acordo com as diferentes espécies de plantas (por exemplo, para Arabidopsis, o tempo limite é de 3 min 1,10,11,12,20 apenas, enquanto para Medicago sativa é de 5 min 19. Para facilitar a colheita suave da ASR para análise, é importante limitar o número de sementes por tela ou caixa magenta, para evitar o emaranhamento do sistema radicular entre si 1,10,11,12. Isso pode ser conseguido usando um número menor de sementes por malha. Por exemplo, o uso de quatro sementes por malha pode ajudar a reduzir o risco de emaranhamento, permitindo o crescimento e o desenvolvimento robustos dos sistemas radiculares. É importante ressaltar que o número ótimo de sementes por malha depende da espécie vegetal específica e dos objetivos da análise da ASR. Por exemplo, se um experimento requer tecido para requisitos adicionais de processamento a jusante, como o isolamento de RNA, neste caso, recomenda-se a semeadura em massa (100 sementes por malha no caso de Arabidopsis)1,10,11,12. A colheita das plântulas da tela é um processo delicado que requer o máximo de cuidado e atenção 1,10,11. É importante abordar essa tarefa de forma lenta, suave e cuidadosa para evitar danificar as delicadas mudas. Para colher as mudas da malha, recomenda-se o uso de pinças finas ou pinças para agarrar as plântulas suavemente, mas com firmeza. As plântulas devem ser cuidadosamente retiradas da malha para evitar perturbar os sistemas radiculares ou causar qualquer dano às plântulas. É essencial ter paciência e reservar um tempo para remover cuidadosamente cada plântula da malha para garantir que elas não sejam danificadas durante o processo. É um processo gradual que deve ser realizado de forma lenta, suave e cuidadosa para garantir o sucesso do experimento. Para medir com precisão a ASR das plântulas, é crucial marcar uma escala na placa de Petri para permitir a medição precisa 1,10,11. Isso pode ser feito usando um marcador permanente para desenhar uma linha na placa de Petri a uma distância conhecida, como 1 cm ou 2 cm. A escala deve ser colocada ao longo da borda da placa de Petri em um local visível. Usando uma escova, também é essencial tomar o máximo de cuidado ao espalhar a RSA. A raiz primária deve ser cuidadosamente posicionada no centro da placa de Petri, e as raízes laterais devem ser espalhadas em ambos os lados da raiz primária. O sistema radicular deve ser parcialmente submerso em água para facilitar a propagação. Para medir cada nova placa de Petri, deve-se definir a escala no software ImageJ cada vez.
Poucas modificações podem ser empregadas para melhorar a eficiência, a não invasividade e a efetividade da análise da ASR1. Uma dessas melhorias é alterar o tamanho dos poros da tela de polipropileno usada para segurar as plântulas. O tamanho dos poros da tela pode ser ajustado para atender às necessidades específicas das espécies vegetais em estudo e otimizar o crescimento e desenvolvimento dos sistemas radiculares 1,10,11,12. Por exemplo, uma malha maior de poros (500 μm) facilita a colheita suave de mudas inteiras sem cortar o hipocótilo, o que era praticado anteriormente10,11,12. Além disso, um tamanho de poro maior pode ser mais adequado para espécies de plantas maiores RSA, enquanto um tamanho de poro menor pode ser mais apropriado para espécies de plantas menores. Outra modificação que pode ser feita é envolver a malha de polipropileno em papel alumínio para evitar que ela se dobre. Isso pode ajudar a manter a forma e a integridade da malha, tornando-a adequada para servir como uma matriz de piso plano. Além dessas modificações, outras técnicas de solução de problemas podem ser empregadas para resolver quaisquer problemas que possam surgir durante a análise da RSA. Por exemplo, se as plântulas não estão crescendo ou se desenvolvendo conforme o esperado, pode ser necessário ajustar as condições ambientais, como temperatura, umidade e níveis de luz. Se os sistemas radiculares estiverem emaranhados, pode ser necessário reduzir o número de sementes por malha, como mencionado acima.
Uma das principais vantagens da análise de RSA é que ela permite estudar os sistemas radiculares das plantas sem a necessidade de ágar. O ágar é comumente usado como agente solidificador em cultura de tecidos vegetais e experimentos de germinação de sementes. No entanto, o uso de ágar pode introduzir contaminação elementar que pode potencialmente gerar artefatos e afetar a acurácia dos resultados10. Ao excluir a exigência de ágar, a análise RSA elimina o risco de contaminação elementar derivada do ágar e o potencial de artefatos. Isso torna a análise da ASR um método mais confiável e preciso para o estudo do sistema radicular das plantas1,3,10,11,12. Por exemplo, os efeitos da privação de Pi sobre a densidade radicular lateral têm sido objeto de uma série de relatos contraditórios. Tem sido relatado que a densidade de RV aumenta quando Pi é baixo 6,8. Em contraste, uma queda na densidade radicular lateral também tem sido encontrada em condições deficientes de Pi 3,13,16. Essas discrepâncias podem ser atribuídas ao sistema de meios de crescimento baseado em ágar, no qual os trabalhadores utilizam diferentes marcas de ágar para gelificar meios com diferentes graus de contaminação por Pi10. Novamente, experimentos que buscam ilustrar o efeito da deficiência de Zn na ASR podem não ser conduzidos adequadamente utilizando o método da placa de Petri à base de ágar, pois o meio gelificante à base de ágar também inclui contaminação por Zn11. Portanto, a realização da análise de ASR pode não ser apropriada para investigar a deficiência de nutrientes usando o meio gelificante à base de ágar. Em segundo lugar, as plântulas cultivadas em meios gelificantes à base de ágar não se desenvolvem tão rapidamente quanto aquelas cultivadas hidroponicamente. Em terceiro lugar, como o RSA é normalmente incorporado em um meio ágar, vários recursos de raiz não são exibidos corretamente. Quarto, a remoção da ASR do meio muitas vezes causa danos substanciais à ASR e a torna uma técnica de amostragem destrutiva.
A técnica hidropônica anterior, publicada por Jain et al.10, utilizava uma tela de polipropileno de 250 μm, que apresentava poros mais estreitos que não permitiam arrancar a ASR intacta. Como resultado, nesse caso em particular, tivemos que cortar as plântulas da região do hipocótilo para separar a ASR, transformando-a em um método destrutivo de amostragem10,11,12. O método existente é improvisado para torná-lo não destrutivo usando uma malha de polipropileno com um tamanho de poro maior (500 μm) que permite arrancar plântulas inteiras de Arabidopsis intactas sem infligir qualquer dano à RSA1. Vale ressaltar que sempre podemos ajustar o tamanho dos poros da malha de polipropileno, dependendo do tipo de muda. Por exemplo, a Figura 4 ilustra como uma abordagem semelhante pode ser usada para mapear a ASR de diferentes plantas, como a Medicago sativa (Alfafa). Optamos pelo tamanho de poro de polipropileno de 1 mm para acomodar o sistema radicular Medicago.
Uma desvantagem desse sistema pode ser o desenvolvimento de pelos radiculares, que muitas vezes não florescem sob sistemas hidropônicos em comparação com sistemas de placas de ágar. A causa primária é a fácil disponibilidade de nutrientes em meios líquidos em vez de em meios sólidos. Apesar de observarmos o desenvolvimento de pelos radiculares (não robustos) utilizando o mesmo sistema e obtivemos os resultados (Figura Suplementar 1). A disponibilidade de Pi afeta fortemente o desenvolvimento dos pelosradiculares 10,11. Neste estudo, o comprimento do cabelo da raiz aumentou inicialmente até 2,5 mM, e depois diminuiu.
Em conjunto, as principais vantagens do sistema são: (1) é um método simples e preciso que não requer nenhum equipamento sofisticado de ponta; (2) o método permite o rápido crescimento das plântulas devido à sua natureza hidropônica; (3) é um método não destrutivo; (4) a propagação manual da ASR permite a exibição adequada de cada característica, revelando a RSA oculta, oferecendo total controle ao usuário; e (5) o método emprega um software de imagem disponível gratuitamente (i.e., ImageJ), que também é simples de usar.
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Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos ao Departamento de Agricultura dos EUA (Grant 58-6406-1-017) pelo apoio a esta pesquisa. Também agradecemos ao WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, EUA, e ao Diretor do CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, Índia, por fornecer as instalações e o suporte do instrumento (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). A SS agradece o apoio financeiro da Saint Joseph's University, Filadélfia, EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
