Summary
Arabidopsis ve Medicago'nun kök sistem mimarisini (RSA) incelemek için basit laboratuvar araçları kullanıyoruz. Fideler ağ üzerinde hidroponik olarak yetiştirilir ve RSA'yı ortaya çıkarmak için bir sanat fırçası kullanılarak yayılır. Görüntüler tarama veya yüksek çözünürlüklü bir kamera kullanılarak alınır, daha sonra özellikleri haritalamak için ImageJ ile analiz edilir.
Abstract
Bitki kök sistemi mimarisi (RSA) geliştirme hakkında kapsamlı bilgi, besin kullanım verimliliğini artırmak ve mahsul çeşidinin çevresel zorluklara karşı toleransını artırmak için kritik öneme sahiptir. Hidroponik sistemin kurulması, plantlet büyümesi, RSA yayılımı ve görüntüleme için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Yaklaşım, polikarbonat kamalarla desteklenen polipropilen ağ içeren macenta kutu tabanlı bir hidroponik sistem kullandı. Deneysel ortamlar, çeşitli besin (fosfat [Pi]) kaynağı altında plantletlerin RSA'sının değerlendirilmesiyle örneklendirilmiştir. Sistem, Arabidopsis'in RSA'sını incelemek için kuruldu, ancak Medicago sativa (Yonca) gibi diğer bitkileri incelemek için kolayca uyarlanabilir. Arabidopsis thaliana (Col-0) plantletleri bu araştırmada RSA bitkisini anlamak için bir örnek olarak kullanılmıştır. Tohumlar, etanol ve seyreltilmiş ticari ağartıcı muamelesi yapılarak yüzey sterilize edilir ve tabakalaşma için 4 ° C'de tutulur. Tohumlar çimlenir ve polikarbonat kamalarla desteklenen bir polipropilen ağ üzerinde sıvı bir yarım MS ortamında yetiştirilir. Fideletler, istenen sayıda gün boyunca standart büyüme koşulları altında yetiştirilir, ağdan yavaşça toplanır ve su içeren agar plakalarına batırılır. Plantletlerin her kök sistemi, yuvarlak bir sanat fırçası yardımıyla su dolu plakaya yavaşça yayılır. Bu Petri plakaları, RSA özelliklerini belgelemek için yüksek çözünürlükte fotoğraflanır veya taranır. Birincil kök, yanal kökler ve dallanma bölgesi gibi kök özellikleri, serbestçe kullanılabilen ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Bu çalışma, kontrollü çevresel ortamlarda bitki kök özelliklerini ölçmek için teknikler sunmaktadır. (1) bitki yavrularının nasıl yetiştirileceğini ve kök örneklerinin nasıl toplanacağını ve yayılacağını, (2) yayılmış RSA örneklerinin resimlerini nasıl elde edeceğinizi, (3) görüntüleri nasıl yakalayacağımızı ve (4) kök özniteliklerini ölçmek için görüntü analiz yazılımının nasıl kullanılacağını tartışıyoruz. Mevcut yöntemin avantajı, RSA özelliklerinin çok yönlü, kolay ve verimli bir şekilde ölçülmesidir.
Introduction
Yeraltında bulunan kök sistem mimarisi (RSA), bitki büyümesi ve verimliliği için hayati bir organdır 1,2,3. Embriyonik aşamadan sonra, bitkiler en önemli morfolojik değişikliklerine uğrarlar. Köklerin toprakta yetişme şekli, bitki parçalarının toprak üzerindeki büyümesini büyük ölçüde etkiler. Kök büyümesi çimlenmede ilk adımdır. Mevcut farklı besin maddelerine benzersiz bir şekilde yanıt verdiği için bilgilendirici bir özelliktir 1,2,3,4. RSA, yüksek derecede gelişimsel plastisite sergiler, bu da çevrenin her zaman gelişim 2,5 hakkında karar vermek için kullanıldığı anlamına gelir. Çevredeki değişiklikler, mevcut senaryoda mahsul üretimini daha da zorlaştırmıştır. RSA, çevresel sinyalleri gelişimsel seçimlere sürekli olarak dahil eder5. Sonuç olarak, kök gelişiminin ardındaki ilkelerin tam olarak anlaşılması, bitkilerin değişen ortamlara nasıl tepki verdiğini öğrenmek için gereklidir 2,5.
RSA, değişen besin konsantrasyonlarını algılar ve fenotipik değişiklikleri 4,6,7,8,9,10,11,12 yapar. Çalışmalar, kök morfolojisinin / RSA'nın sürgün morfolojisine kıyasla oldukça plastik olduğunu göstermektedir 1,3. RSA özellik haritalaması, çevredeki toprak ortamını değiştirmenin etkisini kaydetmede oldukça etkilidir 1,11,12.
Genel olarak, çeşitli besin eksikliklerinin kök fenotipi üzerindeki etkisindeki tutarsızlıklar daha önceki birçok çalışmada bildirilmiştir 3,11,13,14,15. Örneğin, yanal köklerin (LR'ler) sayısında, uzunluğunda ve yoğunluğunda fosfat (Pi) açlığına bağlı değişiklikler hakkında birkaç zıt rapor vardır. Pi eksikliği durumu 6,8 altında LR yoğunluğunda bir artış bildirilmiştir. Buna karşılık, Pi eksikliği koşulları altında LR yoğunluğunda bir azalma diğer yazarlar tarafından da bildirilmiştir 3,13,16. Bu tutarsızlıkların öne çıkan nedenlerinden biri, agarın sıklıkla10 içerdiği elementel kontaminasyona eğilimli jelleşme ortamının kullanılmasıdır. Araştırmacılar tipik olarak deneysel bitkilerini agar bazlı bir plaka sistemi üzerinde yetiştirir ve kök özelliklerini kaydeder. Çok sayıda RSA özelliği sıklıkla agar materyali içinde gizlenir veya yerleşir ve belgelenemez. Kullanıcıların genellikle bir bileşeni ortamdan tamamen dışladığı besin eksikliğini indüklemeyle bağlantılı deneyler, elementel kontaminasyona eğilimli jelleşme ortamı11,14,15'te gerçekleştirilemez. Agar ortamında, P, Zn, Fe ve daha birçok11,14,15 dahil olmak üzere çok sayıda besin maddesi sıklıkla önemli miktarlarda bulunur. Ayrıca, RSA büyümesi agar bazlı ortamlarda, agar bazlı olmayan sıvı ortama göre daha yavaştır. Sonuç olarak, RSA'nın fenotipini ölçmek ve nitel olarak kaydetmek için alternatif bir agar tabanlı olmayan yaklaşım oluşturmaya ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, plantletlerin polikarbonat kamalar 1,10,11 ile desteklenen bir polipropilen ağın üzerinde macenta kutu bazlı bir hidroponik sistemde yetiştirildiği mevcut yöntem geliştirilmiştir.
Bu çalışma, Jain ve ark.10 tarafından açıklanan daha önceki yöntemin ayrıntılı bir doğaçlama versiyonunu sunmaktadır. Bu strateji, bitki kök biyolojisindeki mevcut talepler için ayarlanmıştır ve model bitkiler dışındaki Yonca gibi bitkiler için de kullanılabilir. Protokol, RSA'daki değişiklikleri ölçmenin birincil yoludur ve yalnızca basit ekipman gerektirir. Mevcut protokol, normal ve modifiye edilmiş ortamda (Pi eksikliği) birincil ve lateral kökler gibi çeşitli kök özelliklerinin nasıl fenotiplendirileceğini göstermektedir. Yazarın deneyimlerinden toplanan adım adım talimatlar ve diğer yararlı ipuçları, araştırmacıların bu yöntemde sunulan metodolojilerle birlikte takip etmelerine yardımcı olmak için sağlanmıştır. Bu çalışma, yüksek dereceli LR'ler de dahil olmak üzere bitkilerin tüm kök sistemini ortaya çıkarmak için basit ve etkili bir yöntem sunmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, kök sisteminin yuvarlak bir suluboya sanat fırçası ile manuel olarak yayılmasını içerirve köklerin maruz kalması üzerinde hassas kontrol sağlar 1,10,11,12. Pahalı ekipman veya karmaşık yazılım gerektirmez. Bu yöntem, besin alımını ve büyüme oranını iyileştirmiştir; Bitkiler, kökleri tarafından kolayca emilen besin açısından zengin bir çözeltiye sahiptir. Mevcut yöntem, bir bitkinin kök sisteminin özelliklerini, özellikle erken gelişim sırasında (çimlenmeden 10-15 gün sonra) ayrıntılı olarak haritalamak isteyen araştırmacılar için uygundur. Küçük kök sistemleri, Arabidopsis ve tütün gibi model bitkiler ve kök sistemleri macenta kutularına sığana kadar Yonca gibi geleneksel olmayan bitkiler için uygundur.
Arabidopsis'te RSA gelişiminin fenotipik analizi için adımlar bu protokolde şu şekilde özetlenmiştir: (1) bitkiler için tohum yüzeyi sterilizasyonu yöntemi (Arabidopsis), (2) hidroponik sistemi kurma adımları, ardından bir ortamda tohum ekimi, (3) tüm tohumların çıkarılması ve RSA analizi için Petri plakasına yayılması prosedürü, (4) RSA için görüntülerin nasıl kaydedileceği ve (5) ImageJ yazılımını kullanarak önemli RSA parametrelerinin hesaplanması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm protokol, Şekil 1'de şematik olarak özetlenmiştir ve plantletlerin kök sistem mimarisini (RSA) ortaya çıkarmada yer alan tüm temel adımları göstermektedir. Protokol adımları aşağıda ayrıntılı olarak verilmiştir:
1. Arabidopsis tohum yüzeyi sterilizasyonu
- Küçük bir kepçe (yaklaşık 100 tohum = yaklaşık 2.5 mg) tohumu bir mikrofüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında (RT) damıtılmış suda 30 dakika bekletin. Tüm bu prosedür aseptik durumda gerçekleştirilir.
- Tohum içeren mikrofüj tüpünü 500 x g'de 5 saniye boyunca kısaca santrifüjleyin, tohumların yerleşmesini sağlamak için RT'deki herhangi bir masa üstü santrifüjü kullanın.
- Suyu boşaltın, 700 μL% 70 (v / v) etanol ekleyin, birkaç saniye vorteks yapın ve döndürün. Gerekirse vorteks ve eğirmeyi tekrarlayın, ancak% 70 etanolün tedavi süresinin 3 dakikada kalmasını sağlayın.
- 3 dakika sonra, hemen steril suyla bir kez durulayın. Etanol yıkama adımını mümkün olduğunca zamanında tutun, çünkü uzun süreli etanol maruziyeti çimlenmeyi azaltır.
- Tohumlara seyreltilmiş ticari ağartıcı (% 4 v / v) ile 7 dakika boyunca bir damla Ara-20 ile muamele edin. Tüpleri 8-12 kez hızlı bir şekilde ters çevirerek tohumları ağartıcı çözelti ile karıştırın, ardından kısa bir santrifüj (RT'de 5 s için 500 x g ). Tüpte köpük görülür.
- 1 mL'lik bir pipet kullanarak süpernatantı boşaltın ve aynı vorteks prosedürünü izleyerek tohumları steril suyla en az beş yıkama ile durulayın.
- Yüzey sterilize edilmiş tohumları suda bırakın ve tabakalaşma10 için 4 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.
2. Tohum çimlenmesi için hidroponik bir sistem kurulması
- Standart bir macenta kutusunu damıtılmış suyla doldurun ve otoklavlayın. Polikarbonat levhayı otoklavlayın (net renk ve pürüzsüz doku) ve 4 cm x 8 cm dikdörtgenleri, dikdörtgenin yarısından fazlasına kadar çentikli bir orta nokta ile kesin, böylece iki dikdörtgen bir X şekli10 oluşturmak için birlikte yuvalanabilir. 12x 24 inç levhalardan kesilmiş polipropilen ağı (250 μm gözenek boyutunda 6 cm x 6 cm kareler veya gereksinime bağlı olarak) tutmak için bu kurulumu kullanın10.
NOT: Polipropilen asitlere, alkalilere ve diğer kimyasallara karşı oldukça dirençlidir; bu nedenle tercih edilmiştir. Otoklavlama, polipropilen ağı bozma eğilimindedir; Bu nedenle, alüminyum folyoya sarılmış olarak ayrı ayrı taşınması önerilir. 16 dakika, 121 °C, 15 psi veya 775 mm Hg'lik tipik otoklavlama koşulları önerilir. - Shukla ve ark.1 tarafından tarif edildiği gibi, laminer bir akışta polipropilen ağın alt kenarına ulaşmak için her kutuya vitamin +% 1.5 (w / v) sakkaroz içeren steril yarı MS bazal ortam ekleyin. Tüm prosedürler aseptik koşullar altında gerçekleştirilir.
- Yüzeyle sterilize edilmiş tohumları ağ üzerine (250 μm gözenek boyutu) hidroponik olarak ekin ve 3 gün boyunca büyümelerini sağlayın.
- 3 gün sonra, fideleri bir ağa (500 μm gözenek boyutu) aktarın ve 2 gün boyunca büyümelerini sağlayın.
- 2 gün sonra (toplam 5 gün), fideleri kontrol ortamına aktarın (yani, 2.0 mM NH 4 NO 3, 1.9 mM KNO3, 0.15 mM MgSO 4 · 7H2O, 0.1 mM MnSO4 · içeren modifiye MS besin maddesi1 Y 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4·2H2O, %1,5 sakaroz, 1,25 mM MES, pH 5,7 0,1 M MES [pH 6,1]) ile ayarlanmıştır) ve deneysel ortama (örneğin, P- [0 mM] tedavisi; KH2 PO 4, yukarıda1'de belirtildiği gibi kontrol ortamı bileşiminden 0,62 mM K2SO4 ile değiştirilir. Aşırı Pi tedavileri için, modifiye MS ortamında [2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mM]1) KH2PO4 konsantrasyonu arttırılır ve tohumların 7 gün boyunca büyümesine izin verilir.
NOT: Daha büyük bir ağ gözenek boyutu (500 μm), hipokotilde herhangi bir hasar veya kesme ihtiyacı olmadan tüm fidelerin düzgün bir şekilde toplanmasını kolaylaştırır. Fidancıklar 23 ° C'de standart büyüme koşulları altında (yani, 16 saat ışık / 8 saat karanlık fotoperiyot, 150 μmol · m -2 · s-1 ışık yoğunluğu,% 60 -% 70 nem) büyür.
3. RSA'nın incelenmesi
- Kök yayılması için agar (% 1.1) plakaları hazırlayın (Petri plaka boyutu: 150 mm x 15 mm).
- Yukarıda belirtildiği gibi Petri plakasına 10-20 mL otoklavlanmış filtrelenmiş musluk suyu ekleyin. Fideleri ağdan (500 μm) yavaşça çekin ve plakalardaki suya batırın.
- Her bir plantletin kökünü yuvarlak bir suluboya sanat fırçası yardımıyla su dolu plakaya nazikçe yayın (boyutlar: no. 14, 16, 18 ve 20).
NOT: Kök sisteminin yayılmasını gerçekleştirirken, önce birincil kökü tutun ve bir eksen görevi gördüğü için düz bir çizgiye yayın. Ardından, LR'leri mümkün olan her yerde, birincil kökün her iki tarafına simetrik olarak yayın. Bundan sonra, birinci dereceden LR'a bağlı ikinci dereceden LR'yi yayın. Bu yayılma süreci bir tür sanattır; RSA'nın resmini çizen bir sanatçı gibi nazikçe, yavaşça yapın. - Suyu çıkarmak için plakayı hafifçe eğin.
NOT: Bu noktada, bu yayılma plakaları 4 ° C'ye koyarak prosedür duraklatılabilir. Daha sonra, görüntü işleme gerektiğinde, plakaları çıkarın ve bir süre RT'ye yerleştirin. Yoğunlaştırılmış suyu silin ve ardından görüntü rahatça işlenebilir.
4. RSA için görüntü kaydetme
- Bu Petri plakalarını uygun şekilde tarayın veya fotoğraflayın.
NOT: Yüksek kaliteli fotoğraflar elde etmek için, tarama için 600 dpi çözünürlük önerilir ve fotoğrafçılık için en az 12 megapiksel kamera önerilir. - Ücretsiz olarak kullanılabilen ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) kullanarak kök sistem mimarisi özelliklerini ölçün. ImageJ yazılımını kullanarak kök uzunluğunu ölçme adımlarını hızlı bir şekilde takip etmek için lütfen "DNA kontur uzunluğunu ölçme"17 örneğine bakın.
NOT: Bu adımlar, yüksek çözünürlüklü bir tarayıcı veya kamera kullanılarak çekilen resimlerdeki kök uzunluklarını ölçmek için izlenir.- Ölçeği ayarlamak için belirli bir uzunluk mesafesini kullanın. Şekil 3'teki ölçek çubuğunun bilinen mesafesi 2 cm'dir. ImageJ araç çubuğundan Düz Çizgi aracını seçin (soldan beşinci araç). Ölçek çubuğunun ana hatlarını çizen bir çizgi seçimi oluşturmak için Düz Çizgi aracını kullanın. Sağ tıklatarak, çift tıklatarak veya başlangıçtaki kutuyu tıklatarak anahat oluşturmayı bitirin.
- Analiz > Ölçü araç çubuğunu kullanarak bilinen ölçek çubuğunun uzunluğunu piksel cinsinden ölçün. Piksel uzunluğunu not edin.
- Analiz sekmesindeki Ölçeği Ayarla sekmesini tıklatarak Ölçeği Ayarla iletişim kutusunu açın. Piksel Cinsinden Uzaklık alanına piksel uzunluğunu girin (yukarıda belirtildiği gibi). Ardından, Bilinen Mesafe alanına, ölçek çubuğunda gösterildiği gibi değeri girin (burada 20 mm'dir). Uzunluk Birimi'ni mm olarak ayarlayın. Piksel-en boy oranı 1.0'dır. Şimdi, ölçek milimetre başına x piksel sayısı ile belirtilir. Bu belirli görüntünün ölçeğini kilitlemek için Tamam'a tıklayın.
- Segmentlere Ayrılmış Çizgi aracını kullanarak kök uzunluğunu özetleyen bir çizgi seçimi oluşturun. Sağ tıklatarak, çift tıklatarak veya başlangıçtaki kutuyu tıklatarak anahat oluşturmayı bitirin. Satır seçimini gerektiği gibi ayarlamak için anahat boyunca küçük siyah beyaz "tutamaçları" tıklayıp sürükleyin.
- Kökün uzunluğunu ölçmek için ImageJ'nin Analiz sekmesi altındaki Measure komutunu kullanın. Ölçülen verileri bir e-tabloya aktarmak için Sonuçlar penceresini sağ tıklayın, açılır menüden Tümünü Kopyala'yı seçin, e-tabloya geçin ve ardından verileri yapıştırın.
NOT: Yukarıda açıklandığı gibi, ImageJ ölçek kümesi seçeneğindeki ölçek çubuğunun bilinen mesafesini kullanarak ölçeği ayarlayın. Bu, birim uzunluk başına piksel sayısını verir. Her defasında, yeni bir görüntü analiz edildiğinde ölçeğin yeni olarak ayarlanması gerekir.
- RSA özelliklerinin ölçülmesi ve hesaplanması
- Hipokotil bileşke ile kök ucunun ucu arasındaki birincil kök uzunluğunu ölçün.
- Birinci ve ikinci dereceden LR uzunluğunu ölçün.
- Birincil kökün dallanma bölgesini (BZ) ölçün. Birincil kökün dallanma bölgesi (BZPR), ilk LR çıkış noktasından son LR ortaya çıkan noktasına kadar uzanır.
- BZPR sınırları içinde ortaya çıkan LR'lerin sayısı olan LR sayısını kaydedin.
- Birinci ve yüksek dereceden LR'lerin ortalama uzunluğunu ölçün. 1° LR'nin toplam uzunluğunu toplam 1° LR sayısına bölerek birinci dereceden LR'nin (1° LR) (kök başına santimetre) ortalama uzunluğunu elde edin.
- İkinci dereceden LR'ın ortalama uzunluğunu ölçün. 2° LR'nin toplam uzunluğunu toplam 2° LR sayısına bölerek ikinci dereceden LR'nin (2° LR) ortalama uzunluğunu hesaplayın.
- 1° LR yoğunluğunu ölçün. 1° LR sayısını BZPR uzunluğuna bölerek 1° LR yoğunluğunu (BZPR'nin birim uzunluğu başına 1° LR sayısı) hesaplayın.
- 2° LR yoğunluğunu ölçün. 2° LR sayısını 1° LR'lerin BZ'sinin uzunluğuna bölerek 2° LR yoğunluğunu hesaplayın (1° yanal köklerin BZ'sinin birim uzunluğu başına 2° LR sayısı).
- Toplam kök uzunluğunu (TRL) ölçün. Bu, birincil kök, 1° LR ve 2° LR (ve varsa daha fazlası) uzunluklarının toplamıdır.
5. Kök kılı ölçümü
NOT: Hidroponik sistem, kök kıllarının büyümesini ve gelişimini teşvik etmede iyi olmasa da, katı büyüme ortamında olduğu kadar sağlam olmasına rağmen, mevcut bağlamda incelenmesi hala önemlidir. Fidelerin birincil kökünün ucundan 5 mm'lik bir bölümde kök kılı gelişimini analiz etmek için aşağıdaki adımları izleyin.
- Birincil kökün 2 cm'lik bir bölümünü kök ucundan kesin.
- Kök bölümünü, montaj ortamı olarak% 10 gliserol kullanarak bir slayt üzerine monte edin.
- Slaytı stereo mikroskop altına yerleştirin.
- Kök kıllarının görüntülerini görselleştirmek ve yakalamak için eksenel taşıyıcıyı kullanın.
- Daha önce açıklandığı gibi ImageJ yazılımını kullanarak kök kılların yapısını ve özelliklerini incelemek için görüntüleri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kök sistem mimarisinin (RSA) farklı morfometrik özellikleri basit laboratuvar araçları kullanılarak ölçülür ve adımlar Şekil 1'de şematik olarak gösterilmiştir. Hidroponik kurulumun ayrıntıları, protokolün RSA'yı ölçmedeki potansiyelini göstermektedir (Şekil 1 ve Şekil 2).
Jelleştirici ajanlarda gözlenen farklılıklar göz önüne alındığında, tüm çalışmaları yürütmek için hidroponik bir yetiştirme sistemi kullandık 3,10. Kavramın bir kanıtı olarak, bu hidroponik sistem, Pi eksikliği ve yeterli koşullar altında görünür zıt fenotipi yansıtan iyi çalışır (Şekil 3). Arabidopsis tohumları, Şekil 2'de gösterildiği gibi, bir polipropilen ağ üzerinde yarım MS'lik bir ortamda 5 gün boyunca hidroponik olarak yetiştirildi. Plantletler 5 gün sonra Pi eksikliği ve yeterli koşullara nakledildi ve 7 gün boyunca büyümesine izin verildi (Şekil 3).
RSA özelliklerinin çeşitli besin (Pi) arzı altında gösterilmesi
RSA3'ün özelliklerini analiz etmek ve kaydetmek için yerleşik bir şema izledik. Farklı RSA özellikleri, hidroponik koşullarda zıt Pi rejimleri altında analiz edildi (Şekil 3). Pi eksik tedavisi (0 mM Pi), Pi yeterli durumuna kıyasla daha kısa, daha sığ ve daha az dallanmış bir RSA sergileyen tipik olarak bildirilen bir kök fenotipini çağırdı (Şekil 3A). Primer kök uzunluğu Pi eksikliği durumu altında anlamlı olarak azaldı (Şekil 3A, B). Pi varlığında hızla kazanılan primer kök uzunluğu (1.25 mM), fizyomorfolojik değişiklikleri yeterince yansıtan hidroponik sistemin etkinliğini göstermektedir (Şekil 3A,B). Pi eksikliği durumu altında TRL anlamlı olarak azaldı (Şekil 3B). Dallanma bölgesi (BZPR), Şekil 3A'da gösterildiği gibi, Pi eksikliği koşulu altında önemli ölçüde zayıflamıştır (Şekil 3B).
Bu özelliklerden en çok etkilenen, iki Pi koşulu arasındaki LR sayısındaki yüksek fark nedeniyle TRL idi. RSA'nın Pi yeterli koşulu (1.25 mM) altında güçlü büyümesi, 1 ° LR'lerin sayısındaki ve uzunluğundaki önemli bir artıştan kaynaklanıyordu. Böylece, esas olarak LR gelişimindeki değişiklik nedeniyle hızlı bir RSA değişikliği meydana geldi. Birincil kökün dallanma bölgesi sınırları içinde ortaya çıkan LR'lerin sayısını ölçtük, çünkü daha anlamlı oldukları düşünülüyor 1,3,18. 1° LR'nin ortalama uzunluğu (kök başına santimetre) Pi eksikliği durumunda önemli ölçüde azaltılmıştır (Şekil 3C). Ortalama 2° LR uzunluğu, P0 koşulu nedeniyle benzer şekilde azaltılmıştır; ancak, miktar olarak ortalama 1° LR uzunluğundan daha düşüktü (Şekil 3C). 1° LR ve 2° LR'lerin sayısı, P0 koşulu altında P1.25 koşuluna kıyasla büyük ölçüde azalmıştır (Şekil 3D). 1° LR yoğunluğu (BZPR uzunluğunun santimetresi başına 1° LR sayısı), P 0 koşulu altında P1.25 koşuluna göre değiştirilmemiştir (Şekil 3E). 2° LR yoğunluğu (1° LR'lerin BZ'sinin santimetresi başına 2° LR sayısı) da önemli bir değişiklik göstermemiştir (Şekil 3E). Sonuç olarak, LR'lerin yoğunluğunun belirlenmesi, RSA plastisitesi hakkında yararlı bilgiler edinmek için çok önemlidir.
Değişen fosfat (Pi) rejimleri altında kök kılı gelişiminin analizi
Pi kaynağının kök kılı gelişimi üzerindeki etkisi, fidelerin birincil kökünde incelenmiştir. Kök kıl uzunluğunun Pi konsantrasyonlarının artmasıyla 2.5 mM'ye kadar arttığı, ancak 5 mM ve 10 mM'de azaldığı bulunmuştur. Bununla birlikte, 20 mM'de, kök kıl uzunluğu zirveye yakın seviyelere geri döndü (Ek Şekil 1). Kök kıllarının sayısı, diğer tüm Pi kaynaklarına kıyasla 0 mM'de anlamlı derecede yüksekti ve en yüksek sayı 20 mM'de gözlendi (Ek Şekil 1).
Mevcut yöntemin Arabidopsis dışındaki bitkilere uygulanması
Mevcut yöntemin Arabidopsis dışındaki bitkiler üzerindeki fizibilitesini inceledik ve Medicago sativa (Yonca) bir test tesisi olarak aldık. Protokol iki hususun gerekliliğine göre değiştirilmiştir: (1) tohum yüzeyi sterilizasyon yöntemi ve (2) polipropilen ağın gözenek boyutu (şimdi daha büyük, 1.000 μm). Yüzey tohumu sterilizasyonu ve tabakalaşma protokolünün, çalışılacak seçilen bitkilere bağlı olarak her zaman optimize edilmesi gerekir. Yonca için, adımlar Weeks ve ark.19 tarafından açıklandığı gibi izlendi. Yüzey sterilizasyonundan sonra, tohumlar tabakalaşma için 7 gün boyunca 4 ° C'de inkübe edildi. Bundan sonra, bu protokolde açıklanan aynı prosedürü ağ gözenek boyutunun değiştirilmesiyle izledik. Şekil 4A, B'de gösterildiği gibi, fidanetler iyi yetiştirilmiş, çeşitli Pi kaynakları altında değiştirilmiş bir RSA ile. Şekil 4C, kök sistemi plastisitesini 1.25, 0 ve 20 mM Pi besin çözeltisi altında göstermektedir. Aşırı Pi (20 mM) ve eksik Pi arzı, Pi yeterli (1.25 mM) koşuluna (kontrol) kıyasla kök sisteminin gelişiminin azalmasına neden olmuştur (Şekil 4C). RSA, protokolde açıklanan ImageJ yazılımı kullanılarak farklı özellikler için eşlenebilir. Bu nedenle, protokol basit, verimlidir ve seçilen bitki türlerine göre kolayca değiştirilebilir. Farklı besin koşulları altında çeşitli bitki türlerinin RSA'sını inceleme fırsatı sunar.
Şekil 1: Prosedürün şeması. Şematik diyagram, RSA'yı eşlemek için yöntem protokolünde yer alan ana adımları özetler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Plantletleri yetiştirmek için macenta kutularda hidroponik kurulumun gösterimi . (Jain ve ark.10 tarafından açıklandığı gibi, modifikasyonlarla). (A) Kurulumun montajı için polikarbonat kama çentikli iki dikdörtgen parça (4 cm x 8 cm). (B) Polikarbonat takozların, ağ yüzeyini desteklemek için bir X şekline dönüşen çentik yoluyla birbirine montajı. (C) 250 μm polipropilen örgü levha (6 cm x 6 cm). (D) Eflatun kutudaki polikarbonat takozların montajının üstten görünümü. (E) Polipropilen ağın, polikarbonat kamalar üzerine, ortamla doldurulmuş bir macenta kutu içinde montajı. (F) Ağ üzerinde çimlenmiş Arabidopsis plantletlerinin bir gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Bu fenotipleme yöntemi kullanılarak değişen besin koşulları altında tipik RSA modülasyonunun gösterilmesi (Pi eksikliği [0 mM] ve yeterli [1.25 mM]). Arabidopsis (Col-0) fideleri 5 gün boyunca 0.5x MS ortamında hidroponik olarak yetiştirilir ve daha sonra Pi eksikliği ve yeterli miktarda (sırasıyla 0 ve 1.25 mM) maruz bırakılır ve Şekil 2'de gösterildiği gibi 7 gün boyunca yetiştirilir. (A) Münferit plantletler polipropilen ağdan (500 μm) çıkarılır ve yuvarlak bir sanat fırçası ve su yardımıyla agar Petri plakalarına yayılır. RSA özelliklerinin verileri (B) birincil kök (PR) uzunluğu, toplam kök uzunluğu (TRL), dallanma bölgesi (BZ), (C) ortalama (Av.) birinci dereceden yanal kök uzunluğu (1° LR uzunluğu), ortalama (Av.) ikinci dereceden yanal kök uzunluğu (2° LR uzunluğu), (D) 1° LR ve 2° LR sayısı ve (E) 1° LR ve 2° LR yoğunluğu için sunulur. Değerler SE ± araçlardır; n = 21. Bu rakam Shukla ve ark.1'den değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bu yöntemin Arabidopsis dışındaki diğer bitkilere uygulanabilirliğini göstermek için örnek olarak Medicago sativa (Yonca) kök sisteminin gösterilmesi. (A) Yonca fidancıklarının büyümesini gösteren macenta kutusunun yandan görünümü. (B) Eflatun kutunun üstten görünümü, sürgünün polipropilen ağ (gözenek boyutu 1.000 μm) üzerinde ortaya çıkışını gösterir. (C) Bu RSA fenotipleme yöntemini kullanarak değişen besin koşulları altında (Pi eksikliği [0 mM], fazla Pi [20 mM] ve yeterli veya kontrol [1.25 mM]) altında Yonca modülasyonunun tipik kök sistemi mimarisi (RSA). Yonca fideleri 5 gün boyunca 0.5x MS ortamında hidroponik olarak yetiştirilir, Pi eksik, yeterli ve fazla miktarda (sırasıyla 0, 1.25 ve 20 mM) maruz bırakılır ve 7 gün boyunca yetiştirilir. Tek tek plantletler polipropilen ağdan (1.000 μm) çıkarılır ve C'de gösterildiği gibi bir sanat fırçası ve su yardımıyla agar Petri plakalarına yayılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Farklı aşırı Pi konsantrasyonları kök kılı gelişimini modüle eder. WT fideleri, protokolde açıklandığı gibi hidroponik olarak yetiştirildi. (A) Birincil kökün ucundan 1-2 cm'lik bir kesit doğranmış ve %10 gliserol içeren bir slayt üzerine monte edilmiş ve kök kıl sayısı ve uzunluğu için uçtan 5 mm'lik bir bölge belgelenmiştir. Veriler (B) kök kıl uzunluğu ve (C) birincil kök ucunun 5 mm'lik bir bölgesindeki kök kıllarının sayısı için sunulur. Değerler SE ± araçlardır; n = 10 (B ve C). Farklı alfa harflerine sahip çubuklar, Student'ın eşleştirilmiş t-testine göre anlamlı derecede farklılık gösterir (p ≤ 0.05). Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, RSA'nın basit laboratuvar ekipmanlarını kullanarak haritalandırıldığını göstermiştir. Bu yöntemi kullanarak, fenotipik değişiklikler rafine seviyede kaydedilir. Bu stratejinin yararı, sürgün kısmının asla medya ile temas etmemesidir, bu nedenle plantletlerin fenotipi orijinaldir. Bu yöntem, protokolde açıklandığı gibi plantlet yetiştirmek için bir hidroponik sistem kurmayı içerir. Daha sonra, her plantlet bozulmadan çıkarılır ve agar dolu bir Petri plakasına yerleştirilir. Kök sisteminin daha sonra bir sanat fırçası kullanılarak manuel olarak yayılmasına izin verilir ve fotoğraflar ImageJ yazılımı 1,10,11,12 ile analiz edilmek üzere çekilir.
Tohum çimlenmesi, bakteri, mantar ve virüsleri gidermek için tohum yüzeyi sterilizasyonu gerektirir. Alkol -% 70 etanol - tohum yüzeylerini sterilize etmek için kullanılır. Tohumları yok etmeden dezenfekte etmek için, alkol sterilizasyonunun tedavi süresinin dikkatlice takip edilmesi gerekir. Tohum çimlenmesi, alkol sterilizasyonu aşırıya kaçtığında azalır. Tedavi zamanlamaları farklı bitki türlerine göre değişir (örneğin, Arabidopsis için zaman sınırı sadece 3 dakika 1,10,11,12,20 iken, Medicago sativa için 5 dakika 19'dur). RSA'nın analiz için düzgün bir şekilde toplanmasını kolaylaştırmak için, kök sisteminin kendi aralarında dolaşmasını önlemek için ağ veya macenta kutu başına tohum sayısını sınırlamak önemlidir 1,10,11,12. Bu, ağ başına daha az sayıda tohum kullanılarak elde edilebilir. Örneğin, ağ başına dört tohum kullanmak, kök sistemlerinin sağlam büyümesine ve gelişmesine izin verirken dolaşıklık riskini azaltmaya yardımcı olabilir. Ağ başına optimum tohum sayısının, belirli bitki türlerine ve RSA analizinin hedeflerine bağlı olduğuna dikkat etmek önemlidir. Örneğin, bir deney RNA izolasyonu gibi daha ileri aşağı akış işleme gereksinimleri için doku gerektiriyorsa, bu durumda, toplu ekim önerilir (Arabidopsis durumunda ağ başına 100 tohum)1,10,11,12. Ağdan plantet toplamak, azami özen ve dikkat gerektiren hassas bir işlemdir 1,10,11. Hassas bitki yavrularına zarar vermemek için bu göreve yavaşça, nazikçe ve dikkatlice yaklaşmak önemlidir. Ağdan plantlet toplamak için, plantletleri nazikçe ama sıkıca kavramak için ince cımbız veya forseps kullanılması önerilir. Kök sistemlerini rahatsız etmemek veya plantletlere zarar vermemek için plantletler ağdan dikkatlice çıkarılmalıdır. Sabırlı olmak ve işlem sırasında zarar görmemelerini sağlamak için her bir plantleti ağdan dikkatlice çıkarmak için zaman ayırmak önemlidir. Deneyin başarısını sağlamak için yavaş, nazik ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken kademeli bir süreçtir. Plantletlerin RSA'sını doğru bir şekilde ölçmek için, Petri plakası üzerinde hassas ölçüm 1,10,11'e izin verecek şekilde bir ölçek işaretlemek çok önemlidir. Bu, Petri plakasına 1 cm veya 2 cm gibi bilinen bir mesafede bir çizgi çizmek için kalıcı bir işaretleyici kullanılarak yapılabilir. Ölçek, Petri plakasının kenarı boyunca görünür bir yere yerleştirilmelidir. Bir fırça kullanarak, RSA'yı yayarken azami özen göstermek de önemlidir. Birincil kök, Petri plakasının ortasına dikkatlice yerleştirilmeli ve yanal kökler birincil kökün her iki tarafına da yayılmalıdır. Yayılmayı kolaylaştırmak için kök sistemi kısmen suya batırılmalıdır. Her yeni Petri plakasını ölçmek için, ölçeği her seferinde ImageJ yazılımında ayarlamak gerekir.
RSA analizinin verimliliğini, invazivliğini ve etkinliğini artırmak için birkaç değişiklik yapılabilir1. Böyle bir gelişme, plantletleri tutmak için kullanılan polipropilen ağın gözenek boyutunu değiştirmektir. Ağın gözenek boyutu, incelenen bitki türlerinin özel ihtiyaçlarına uyacak ve kök sistemlerinin büyümesini ve gelişimini optimize edecek şekilde ayarlanabilir 1,10,11,12. Örneğin, daha büyük bir ağ gözenek boyutu (500 μm), daha önce10,11,12 uygulanan hipokotili kesmeden tüm fidelerin düzgün bir şekilde toplanmasını kolaylaştırır. Ayrıca, daha büyük bir gözenek boyutu daha büyük bitki türleri RSA için daha uygun olabilirken, daha küçük bir gözenek boyutu daha küçük bitki türleri için daha uygun olabilir. Yapılabilecek bir diğer modifikasyon, bükülmesini önlemek için polipropilen ağın alüminyum folyoya sarılmasıdır. Bu, ağın şeklini ve bütünlüğünü korumaya yardımcı olabilir, bu da onu düz bir zemin matrisi olarak hizmet etmeye uygun hale getirir. Bu değişikliklere ek olarak, RSA analizi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları ele almak için başka sorun giderme teknikleri de kullanılabilir. Örneğin, fidancıklar beklendiği gibi büyümüyor veya gelişmiyorsa, sıcaklık, nem ve ışık seviyeleri gibi çevresel koşulları ayarlamak gerekebilir. Kök sistemleri dolaşıksa, yukarıda belirtildiği gibi, ağ başına tohum sayısının azaltılması gerekli olabilir.
RSA analizinin temel avantajlarından biri, agar'a ihtiyaç duymadan bitki kök sistemlerinin incelenmesine izin vermesidir. Agar, bitki doku kültüründe ve tohum çimlenme deneylerinde katılaşıcı bir ajan olarak yaygın olarak kullanılır. Bununla birlikte, agar kullanımı, potansiyel olarak artefaktlar üretebilecek ve sonuçların doğruluğunu etkileyebilecek elementel kontaminasyona neden olabilir10. RSA analizi, agar gereksinimini dışlayarak, agar kaynaklı elementel kontaminasyon riskini ve artefakt potansiyelini ortadan kaldırır. Bu, RSA analizini bitki kök sistemlerini incelemek için daha güvenilir ve doğru bir yöntem haline getirir 1,3,10,11,12. Örneğin, Pi yoksunluğunun lateral kök yoğunluğu üzerindeki etkileri bir dizi çelişkili rapora konu olmuştur. Pi 6,8 düşük olduğunda LR yoğunluğunun arttığı bildirilmiştir. Buna karşılık, yanal kök yoğunluğunda bir düşüş Pi eksikliği olan koşullarda da bulunmuştur 3,13,16. Bu tutarsızlıklar, işçilerin farklı derecelerde Pi kontaminasyonu10 ile medyayı jelleştirmek için farklı agar markalarını kullandıkları agar tabanlı büyüme ortamı sistemine atfedilebilir. Yine, Zn eksikliğinin RSA üzerindeki etkisini göstermeye çalışan deneyler, agar bazlı Petri plakası yöntemi kullanılarak yeterince gerçekleştirilemeyebilir, çünkü agar bazlı jelleşme ortamı da Zn kontaminasyonunu içerir11. Bu nedenle, RSA analizi yapmak, agar bazlı jelleşme ortamını kullanarak besin eksikliğini araştırmak için uygun olmayabilir. İkincisi, agar bazlı jelleşme ortamında yetiştirilen bitkiler, hidroponik olarak yetiştirilenler kadar hızlı gelişmez. Üçüncüsü, RSA tipik olarak bir agar ortamına gömülü olduğundan, çok sayıda kök özelliği doğru görüntülenmez. Dördüncüsü, RSA'nın ortamdan çıkarılması genellikle RSA'ya önemli ölçüde zarar verir ve onu yıkıcı bir örnekleme tekniği haline getirir.
Jain ve ark.10 tarafından yayınlanan önceki hidroponik teknik, bozulmamış RSA'nın çekilmesini sağlamayan daha dar gözeneklere sahip olan 250 μm'lik bir polipropilen ağ boyutu kullandı. Sonuç olarak, bu özel durumda, RSA'yı ayırmak için plantletleri hipokotil bölgesinden kesmek zorunda kaldık ve onu yıkıcı bir örnekleme yöntemine dönüştürdük10,11,12. Mevcut yöntem, RSA1'e herhangi bir zarar vermeden tüm Arabidopsis plantletlerinin bozulmadan çıkarılmasına izin veren daha büyük bir gözenek boyutuna (500 μm) sahip bir polipropilen ağ kullanılarak tahribatsız hale getirmek için doğaçlama yapılmıştır. Bitkinin türüne bağlı olarak, polipropilen ağın gözenek boyutunu her zaman ayarlayabileceğimize dikkat etmek önemlidir. Örneğin, Şekil 4, Medicago sativa (Yonca) gibi farklı bitkilerin RSA'sını haritalamak için benzer bir yaklaşımın nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Medicago kök sistemine uyum sağlamak için 1 mm'lik polipropilen gözenek boyutunu seçtik.
Bu sistemin bir dezavantajı, agar plaka sistemlerine kıyasla hidroponik sistemler altında genellikle gelişmeyen kök kıllarının gelişimi olabilir. Birincil neden, besinlerin katı ortamlardan ziyade sıvı ortamlarda kolayca bulunabilmesidir. Her ne kadar aynı sistemi kullanarak kök kıllarının gelişimini (sağlam değil) gözlemlemiş ve sonuçları elde etmiş olsak da (Ek Şekil 1). Pi'nin mevcudiyeti kök kılı gelişimini güçlü bir şekilde etkiler10,11. Burada, kök kıl uzunluğu başlangıçta 2.5 mM'ye kadar artmış, daha sonra azalmıştır.
Toplamda, sistemin temel avantajları şunlardır: (1) herhangi bir sofistike üst düzey ekipman gerektirmeyen basit ve hassas bir yöntemdir; (2) yöntem, hidroponik doğası nedeniyle plantletlerin hızlı büyümesine izin verir; (3) tahribatsız bir yöntemdir; (4) RSA'nın manuel olarak yayılması, her bir özelliğin uygun şekilde görüntülenmesini sağlar, gizli RSA'yı ortaya çıkarır ve kullanıcıya tam kontrol sunar; ve (5) yöntem, kullanımı da kolay olan serbestçe kullanılabilen bir görüntüleme yazılımı (yani, ImageJ) kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu araştırmayı desteklediği için ABD Tarım Bakanlığı'na (Grant 58-6406-1-017) teşekkür ederiz. Ayrıca, WKU Biyoteknoloji Merkezi, Western Kentucky Üniversitesi, Bowling Green, KY, ABD ve CSIR Merkezi Tıbbi ve Aromatik Bitkiler Enstitüsü, Lucknow, Hindistan'a enstrüman olanakları ve desteği sağladığı için teşekkür ederiz (CSIR CIMAP el yazması iletişim no. CIMAP/PUB/2022/103). SS, Saint Joseph Üniversitesi, Philadelphia, ABD'den gelen mali desteği kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
