Summary
Vi bruker enkle laboratorieverktøy for å undersøke rotsystemarkitekturen (RSA) til Arabidopsis og Medicago. Plantene dyrkes hydroponisk over netting og spres med en kunstpensel for å avsløre RSA. Bildene tas ved hjelp av skanning eller et høyoppløselig kamera, og analyseres deretter med ImageJ for å kartlegge egenskaper.
Abstract
Omfattende kunnskap om utvikling av planterotsystemarkitektur (RSA) er avgjørende for å forbedre effektiviteten av næringsbruken og øke avlingskultivartoleransen for miljøutfordringer. En eksperimentell protokoll presenteres for å sette opp det hydroponiske systemet, plantevekst, RSA-spredning og avbildning. Tilnærmingen brukte et magenta boksbasert hydroponisk system som inneholder polypropylennett støttet av polykarbonatkiler. Eksperimentelle innstillinger eksemplifiseres ved å vurdere RSA for plantene under varierende næringstilførsel (fosfat [Pi]). Systemet ble etablert for å undersøke RSA av Arabidopsis, men det er lett tilpasningsdyktig å studere andre planter som Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantetter brukes i denne undersøkelsen som et eksempel for å forstå planten RSA. Frøene overflatesteriliseres ved behandling av etanol og fortynnet kommersielt blekemiddel, og holdes ved 4 °C for stratifisering. Frøene spires og dyrkes på et flytende halv-MS-medium på et polypropylennett støttet av polykarbonatkiler. Plantene dyrkes under standard vekstforhold i ønsket antall dager, plukkes forsiktig ut fra nettet og nedsenkes i vannholdige agarplater. Hvert rotsystem av plantlets spres forsiktig på den vannfylte platen ved hjelp av en rund kunstbørste. Disse petriskålene fotograferes eller skannes i høy oppløsning for å dokumentere RSA-egenskapene. Rotegenskapene, som primærrot, laterale røtter og forgreningssone, måles ved hjelp av den fritt tilgjengelige ImageJ-programvaren. Denne studien gir teknikker for å måle planterotegenskaper i kontrollerte miljøinnstillinger. Vi diskuterer hvordan vi kan (1) dyrke plantene, og samle og spre rotprøver, (2) få bilder av oppspredte RSA-prøver, (3) ta bildene, og (4) bruke bildeanalyseprogramvare for å kvantifisere rotattributter. Fordelen med den nåværende metoden er den allsidige, enkle og effektive målingen av RSA-egenskapene.
Introduction
Rotsystemarkitekturen (RSA), som er under jorden, er et viktig organ for plantevekst og produktivitet 1,2,3. Etter embryonale scenen gjennomgår planter sine mest signifikante morfologiske forandringer. Måten røttene vokser i jorda på, påvirker i stor grad veksten av plantedeler over bakken. Rotvekst er det første trinnet i spiring. Det er en informativ egenskap da den unikt reagerer på forskjellige tilgjengelige næringsstoffer 1,2,3,4. RSA utviser en høy grad av utviklingsplastisitet, noe som betyr at miljøet alltid brukes til å ta beslutninger om utvikling 2,5. Endringer i miljøet har gjort avlingene vanskeligere i det nåværende scenariet. Kontinuerlig inkorporerer RSA miljøsignaler i utviklingsvalg5. Som et resultat er en grundig forståelse av prinsippene bak rotutvikling avgjørende for å lære hvordan planter reagerer på skiftende miljøer 2,5.
RSA registrerer varierende næringsstoffkonsentrasjoner og gjengir fenotypiske endringer 4,6,7,8,9,10,11,12. Studier tyder på at rotmorfologi/RSA er svært plastisk sammenlignet med skuddmorfologi 1,3. RSA egenskapskartlegging er svært effektiv for å registrere effekten av å endre det omkringliggende jordmiljøet 1,11,12.
Generelt er avvik i effekten av ulike næringsdefekter på rotfenotypen rapportert i mange tidligere studier 3,11,13,14,15. For eksempel er det flere kontrasterende rapporter om fosfat (Pi) sult-induserte endringer i antall, lengde og tetthet av laterale røtter (LR). Det er rapportert en økning i LR-tettheten under Pi-mangelbetingelsen 6,8. I motsetning til dette har en reduksjon i LR-tetthet under Pi-mangelfulle forhold også blitt rapportert av andre forfattere 3,13,16. En av de fremtredende årsakene til disse inkonsekvensene er bruken av det elementære forurensningsutsatte geleringsmediet, som agar ofte inneholder10. Forskere vokser vanligvis sine eksperimentelle planter på et agarbasert platesystem og registrerer rotegenskapene. Mange RSA-trekk er ofte skjult eller forankret i agarmaterialet og kan ikke dokumenteres. Eksperimenter knyttet til å indusere næringsmangel, der brukere ofte utelukker en komponent helt fra mediet, kan ikke utføres i elementær forurensningsutsatt geleringsmedium11,14,15. Tallrike næringsstoffer er ofte til stede i betydelige mengder i agarmediet, inkludert P, Zn, Fe og mange flere11,14,15. Videre er RSA-veksten langsommere i agarbaserte medier enn i ikke-agarbasert flytende medium. Som et resultat er det behov for å etablere en alternativ ikke-agarbasert tilnærming for å kvantifisere og kvalitativt registrere fenotypen av RSA. Følgelig er den nåværende metoden utviklet, der plantetter heves i et magenta boksbasert hydroponisk system på toppen av et polypropylennett støttet av polykarbonatkiler 1,10,11.
Denne studien presenterer en detaljert improvisert versjon av den tidligere metoden beskrevet av Jain et al.10. Denne strategien har blitt innstilt for dagens krav i planterotbiologi og kan også brukes til planter som Alfalfa, annet enn modellplanter. Protokollen er den primære måten å måle endringene i RSA, og den krever bare enkelt utstyr. Den foreliggende protokollen illustrerer hvordan man kan fenotype flere rottrekk, for eksempel primære og laterale røtter i normalt og modifisert medium (Pi mangelfull). Trinnvise instruksjoner og andre nyttige tips hentet fra forfatterens erfaringer er gitt for å hjelpe forskerne til å følge med metodene som tilbys i denne metoden. Denne studien tar sikte på å gi en enkel og effektiv metode for å avsløre hele rotsystemet av planter, inkludert høyere ordens LR. Denne metoden innebærer å manuelt spre rotsystemet med en rund akvarellkunstpensel, noe som gir presis kontroll over eksponeringen av røttene 1,10,11,12. Det krever ikke dyrt utstyr eller komplisert programvare. Denne metoden har forbedret næringsopptak og veksthastighet; Planter har en næringsrik løsning som lett absorberes av sine røtter. Dagens metode passer for forskere som ønsker å kartlegge egenskapene til en plantes rotsystem i detalj, spesielt under tidlig utvikling (10-15 dager etter spiring). Den er egnet for små rotsystemer, modellplanter som Arabidopsis og tobakk, og ikke-konvensjonelle planter som Alfalfa til rotsystemet passer i magenta-boksene.
Trinnene for fenotypisk analyse av RSA-utvikling i Arabidopsis er skissert i denne protokollen som følger: (1) metoden for frøoverflatesterilisering for planter (Arabidopsis), (2) trinnene for å sette opp det hydroponiske systemet, etterfulgt av frøsåing på et medium, (3) prosedyre for å ta ut de komplette såingene og spre seg på petriskålen for RSA-analyse, (4) hvordan du tar opp bildene for RSA, og (5) beregner viktige RSA-parametere ved hjelp av ImageJ-programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hele protokollen er oppsummert skjematisk i figur 1, og viser alle de essensielle trinnene som er involvert i å avsløre rotsystemarkitekturen (RSA) til plantlets. Protokolltrinnene er gitt i detalj nedenfor:
1. Arabidopsis frøoverflatesterilisering
- Overfør en liten skje (ca. 100 frø = ca. 2,5 mg) frø til et mikrofugerør, og suge i 30 minutter i destillert vann ved romtemperatur (RT). Hele denne prosedyren utføres i aseptisk tilstand.
- Sentrifuge mikrofugerøret som inneholder frø ved 500 x g i 5 s, ved hjelp av en hvilken som helst bordplatesentrifuge ved RT for å la frøene slå seg ned.
- Dekanter vannet, tilsett 700 μL 70% (v / v) etanol, virvel i noen sekunder, og spinn. Gjenta vortexing og spinning om nødvendig, men sørg for at behandlingstiden på 70% etanol forblir på 3 minutter.
- Etter 3 min, skyll straks en gang med sterilt vann. Hold etanolvasketrinnet så rettidig som mulig, da langvarig etanoleksponering reduserer spiring.
- Behandle frøene med fortynnet kommersielt blekemiddel (4% v / v) med en dråpe Tween-20 i 7 minutter. Bland frøene med blekemiddelløsning ved å invertere rørene raskt 8-12 ganger, etterfulgt av en kort sentrifuge (500 x g i 5 s ved RT). Skum er sett vises i røret.
- Dekanter supernatanten med en 1 ml pipette og skyll frøene med minst fem vasker med sterilt vann, etter samme virvelprosedyre.
- La overflaten steriliserte frø ligge i vann og rug i 2-3 dager ved 4 °C for stratifisering10.
2. Innstilling av et hydroponisk system for frøspredning
- Halvfyll en standard magentaboks med destillert vann og autoklav den. Autoklav polykarbonatarket (klar farge og glatt tekstur) og kutt 4 cm x 8 cm rektangler, med et midtpunkt hakket mer enn halvveis gjennom rektangelet slik at to rektangler kan spalte sammen for å danne en X-form10. Bruk dette oppsettet til å holde polypropylennettet (6 cm x 6 cm kvadrater med 250 μm porestørrelse, eller avhengig av kravet) kuttet fra 12x 24 tommers ark10.
MERK: Polypropylen er svært motstandsdyktig mot syrer, alkalier og andre kjemikalier; Derfor er det valgt. Autoklavering har en tendens til å forvrenge polypropylennett; Derfor anbefales det å bæres separat innpakket i aluminiumsfolie. Typiske autoklaverforhold på 16 min, 121 °C, 15 psi eller 775 mm Hg anbefales. - Legg sterilt halv-MS basalmedium med vitaminer + 1,5% (w / v) sukrose, som beskrevet av Shukla et al.1, til hver boks for å nå den nederste kanten av polypropylennettet i en laminær strømning. Alle prosedyrene utføres under aseptiske forhold.
- Så de overflatesteriliserte frøene på nettet (250 μm porestørrelse) hydroponisk og la dem vokse i 3 dager.
- Etter 3 dager, overfør plantene til et nett (500 μm porestørrelse) og la dem vokse i 2 dager.
- Etter 2 dager (totalt 5 dager), overfør plantene til kontrollmediet (dvs. modifisert MS-næringsmedium 1 inneholdende 2,0 mM NH 4 NO 3, 1,9 mM KNO3, 0,15 mM MgSO 4·7H2O,0,1 mM MnSO4· H 2 O, 3,0 μM ZnSO 4·7H 2 O, 0,1 μM CuSO 4·5H 2 O, 0,3 mM CaCl 2·2H 2 O, 5,0 μM KI, 0,1 μM CoCl 2·6H 2 O, 0,1 mM FeSO 4·7H 2 O, 0,1 mM Na 2 EDTA·2H 2 O, 1,25 mM KH 2PO 4, 100 μM H 3 BO3, 1 μM Na 2 MoO4 · 2H2O, 1,5% sukrose, 1,25 mM MES, pH 5,7 justert med 0,1 M MES [pH 6,1]) og til eksperimentelle medier (f.eks. P- [0 mM] behandling; KH2 PO 4 erstattes med 0,62 mM K2SO4 fra kontrollmediesammensetningen som nevnt ovenfor 1. For overskytende Pi-behandlinger økes konsentrasjonen av KH 2 PO4 i modifisert MS-medium [2,5, 5,0, 10,0, 20,0 mM]1) og la frøene vokse i 7 dager.
MERK: En større maskeporestørrelse (500 μm) letter jevn plukking av hele frøplanter uten skade eller behov for kutting ved hypokotylen. Plantlets vokser under standard vekstforhold (dvs. 16 t lys / 8 timer mørk fotoperiode, 150 μmol · m-2 · s-1 lysintensitet, 60% - 70% fuktighet) ved 23 ° C.
3. Undersøkelse av RSA
- Forbered agar (1,1%) plater for rotspredning (petriskplatestørrelse: 150 mm x 15 mm).
- Tilsett 10-20 ml autoklavfiltrert vann fra springen til petriskplaten, som nevnt ovenfor. Trekk forsiktig ut plantene fra nettverket (500 μm) og senk dem i vann på platene.
- Fordel forsiktig hver planterot i den vannfylte tallerkenen ved hjelp av en rund akvarellkunstpensel (størrelser: nr. 14, 16, 18 og 20).
MERK: Mens du utfører spredningen av rotsystemet, må du først få tak i den primære roten og spre den til en rett linje, da den fungerer som en akse. Spre deretter LR-ene symmetrisk på hver side av primærroten, der det er mulig. Deretter sprer du andreordens LR knyttet til førsteordens LR. Denne spredningsprosessen er en slags kunst; gjør det forsiktig, sakte, som en kunstner som tegner et bilde av RSA. - Vipp platen litt for å fjerne vannet.
MERK: På dette tidspunktet kan prosedyren settes på pause ved å sette disse spredningsplatene ved 4 °C. Senere, når bildebehandling er nødvendig, ta ut platene og legg dem på RT en stund. Tørk ut kondensvannet, og deretter kan bildet behandles praktisk.
4. Ta opp bilder for RSA
- Skann eller fotografer disse petriskålene på riktig måte.
MERK: For å skaffe fotografier av høy kvalitet, anbefales oppløsningen på 600 dpi for skanning, og minst et 12 megapikselkamera anbefales for fotografering. - Mål rotsystemarkitekturegenskapene ved hjelp av fritt tilgjengelig ImageJ-programvare (https://imagej.nih.gov/ij/index.html). Hvis du raskt vil følge trinnene for å måle rotlengden ved hjelp av ImageJ-programvaren, kan du se eksemplet "måle DNA-konturlengde"17.
MERK: Disse trinnene følges for å måle rotlengdene på bilder tatt med en skanner eller et kamera med høy oppløsning.- Bruk en gitt lengdeavstand for å angi skalaen. Den kjente avstanden til skalastangen i figur 3 er 2 cm. Velg verktøyet for rett linje på ImageJ-verktøylinjen (det femte verktøyet fra venstre). Bruk verktøyet for rett linje til å opprette en linjemarkering som viser vektestangen. Fullfør disposisjonen ved å høyreklikke, dobbeltklikke eller klikke i boksen i begynnelsen.
- Mål lengden på den kjente skaleringslinjen i piksler ved hjelp av verktøylinjen Analyser > mål . Noter piksellengden.
- Åpne dialogboksen Angi skala ved å klikke kategorien Angi skala i kategorien Analyser. I feltet Avstand i piksler angir du bildepunktlengden (som nevnt ovenfor). Deretter skriver du inn verdien i feltet Kjent avstand, som vist på skalalinjen (her er den 20 mm). Sett lengdeenheten som mm. Piksel-sideforholdet er 1,0. Nå er skalaen spesifisert av x antall piksler per millimeter. For å låse skalaen for dette bildet, klikk på OK.
- Opprett et linjeutvalg som skisserer rotlengden ved hjelp av segmenteringslinjeverktøyet . Fullfør disposisjonen ved å høyreklikke, dobbeltklikke eller klikke i boksen i begynnelsen. Klikk og dra de små svart-hvite "håndtakene" langs omrisset for å justere linjevalget etter behov.
- Bruk kommandoen Mål under kategorien Analyser i ImageJ til å kvantifisere lengden på roten. For å overføre de målte dataene til et regneark, høyreklikk på resultatvinduet , velg Kopier alle fra popup-menyen, bytt til regnearket og lim deretter inn dataene.
MERK: Som beskrevet ovenfor, still inn skalaen ved å bruke den kjente avstanden til skalalinjen i alternativet ImageJ-settskala. Dette gir antall piksler per lengdeenhet. Det kreves å sette skalaen hver gang når et nytt bilde analyseres.
- Måling og beregning av RSA-egenskaper
- Mål den primære rotlengden mellom hypokotylkrysset og rotspissens ende.
- Mål første- og andreordens LR-lengde.
- Mål forgreningssonen (BZ) til primærroten. Forgreningssonen til primærroten (BZPR) spenner over det første LR-fremvoksende punktet til det siste LR-fremvekstpunktet.
- Registrer antall LR-er, som er antall LR-er med opprinnelse innenfor grensen til BZPR.
- Mål den gjennomsnittlige lengden på LR av første og høyere orden. Utled den gjennomsnittlige lengden på førsteordens LR (1 ° LR) (centimeter per rot) ved å dele den totale lengden på 1 ° LR med det totale antallet 1 ° LR.
- Mål gjennomsnittlig lengde på andreordens LR. Beregn gjennomsnittslengden på andreordens LR (2° LR) ved å dele den totale lengden på 2° LR med det totale antallet 2° LR.
- Mål 1° LR-tettheten. Beregn 1° LR-tettheten (antall 1° LR per lengdeenhet av BZ PR) ved å dele antall 1° LR med lengden på BZPR.
- Mål 2° LR-tettheten. Beregn 2° LR-tettheten ved å dele antall 2° LR med lengden på BZ på 1° LR (antall 2° LR per lengdeenhet av BZ på 1° laterale røtter).
- Mål den totale rotlengden (TRL). Dette er summen av primærroten, 1° LR og 2° LR (og mer hvis den finnes) lengder.
5. Måling av rothår
MERK: Selv om det hydroponiske systemet ikke er bra for å fremme rothårvekst og utvikling, til tross for at det er så robust som det er i solide vekstmedier, er det fortsatt viktig å studere det i dagens sammenheng. Følg trinnene nedenfor for å analysere rothårutvikling i en 5 mm seksjon fra spissen av plantens primære rot.
- Hakk av en 2 cm seksjon av primærroten fra rotspissen.
- Monter rotseksjonen på et lysbilde med 10% glyserol som monteringsmedium.
- Plasser lysbildet under et stereomikroskop.
- Bruk aksialholderen til å visualisere og ta bilder av rothårene.
- Analyser bildene for å studere strukturen og egenskapene til rothårene ved hjelp av ImageJ-programvare som tidligere beskrevet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ulike morfometriske egenskapene til rotsystemarkitektur (RSA) måles med enkle laboratorieverktøy, og trinnene er skjematisk avbildet i figur 1. Detaljene i det hydroponiske oppsettet demonstrerer protokollens potensial for måling av RSA (figur 1 og figur 2).
Gitt de observerte forskjellene i geleringsmidler, brukte vi et hydroponisk vekstsystem for å gjennomføre alle studiene 3,10. Som et bevis på konsept fungerer dette hydroponiske systemet godt, noe som gjenspeiler den tilsynelatende kontrasterende fenotypen under Pi-mangelfulle og tilstrekkelige forhold (figur 3). Arabidopsisfrø ble hydroponisk dyrket i 5 dager i et halvt MS-medium på et polypropylennett, som illustrert i figur 2. Plantene ble transplantert etter 5 dager til Pi-mangelfulle og tilstrekkelige forhold, og fikk vokse i 7 dager (figur 3).
Demonstrasjon av RSA-egenskaper under variert næringsstoffforsyning (Pi)
Vi har fulgt et etablert skjema for å analysere og registrere egenskapene til RSA3. Ulike RSA-trekk ble analysert under kontrasterende Pi-regimer under hydroponiske forhold (figur 3). Pi-mangelfull behandling (0 mM Pi) påkalte en typisk rapportert rotfenotype med en kortere, grunnere og mindre forgrenet RSA sammenlignet med Pi-tilstrekkelig tilstand (figur 3A). Primærrotlengden ble signifikant dempet under Pi-mangeltilstanden (figur 3A,B). Primær rotlengde, raskt oppnådd i nærvær av Pi (1,25 mM), viser effektiviteten til det hydroponiske systemet som reflekterer de fysio-morfologiske endringene tilstrekkelig (figur 3A, B). TRL ble signifikant redusert under Pi-mangeltilstanden (figur 3B). Forgreningssonen (BZPR), som vist i figur 3A, ble signifikant dempet under Pi-mangeltilstanden (figur 3B).
Av disse egenskapene var den mest berørte TRL, på grunn av den høye forskjellen i LR-tallet mellom de to Pi-forholdene. Den kraftige veksten av RSA under Pi-tilstrekkelig tilstand (1,25 mM) skyldtes en betydelig økning i antall og lengde på 1 ° LR. Dermed skjedde en rask RSA-endring, hovedsakelig på grunn av endringen i LR-utviklingen. Vi målte antall LR med opprinnelse innenfor grensen til forgreningssonen til primærroten, da de anses som mer meningsfulle 1,3,18. Den gjennomsnittlige lengden på 1° LR (centimeter per rot) ble signifikant redusert i Pi-mangeltilstanden (figur 3C). Den gjennomsnittlige 2° LR-lengden ble tilsvarende redusert på grunn av P0-tilstanden; Den var imidlertid lavere i mengde enn gjennomsnittlig 1° LR-lengde (figur 3C). Antallet 1° LR og 2° LR ble kraftig redusert under P0-tilstanden sammenlignet med P1,25-tilstanden (figur 3D). 1° LR-tettheten (antall 1° LR per centimeter BZPR-lengde) ble ikke endret under P0-betingelsen i forhold til P1,25-tilstanden (figur 3E). 2° LR-tettheten (antall 2° LR per centimeter av BZ på 1° LR) viste heller ingen signifikant endring (figur 3E). Som et resultat er det viktig å bestemme tettheten av LR for å få nyttig innsikt i RSA-plastisiteten.
Analyse av rothårutvikling under varierende fosfatregimer (Pi)
Effekten av Pi-forsyning på rothårutvikling ble studert i den primære roten av frøplanter. Det ble funnet at rothårlengden økte med økende konsentrasjoner av Pi opp til 2,5 mM, men redusert ved 5 mM og 10 mM. Ved 20 mM returnerte imidlertid rothårlengden til nær toppnivå (tilleggsfigur 1). Antall rothår var signifikant høyere ved 0 mM sammenlignet med alle andre Pi-forsyninger, med det høyeste antallet observert ved 20 mM (tilleggsfigur 1).
Anvendelse av foreliggende metode på andre planter enn Arabidopsis
Vi har undersøkt muligheten for den nåværende metoden på andre planter enn Arabidopsis, med Medicago sativa (Alfalfa) som testanlegg. Protokollen har blitt modifisert i henhold til kravet om to aspekter: (1) steriliseringsmetoden for frøoverflaten, og (2) porestørrelsen på polypropylennettet (nå større, 1000 μm). Overflatefrøsteriliserings- og stratifiseringsprotokollen må alltid optimaliseres avhengig av de valgte plantene som skal studeres. For Alfalfa ble trinnene fulgt som beskrevet av uker et al.19. Etter overflatesterilisering ble frøene ruget ved 4 °C i 7 dager for stratifisering. Etter det fulgte vi samme prosedyre beskrevet i denne protokollen med en modifikasjon av porestørrelsen i nettet. Som vist i figur 4A,B var plantene godt dyrket, med en endret RSA under varierende tilførsel av Pi. Figur 4C viser rotsystemets plastisitet under 1,25, 0 og 20 mM Pi næringsoppløsning. Overflødig Pi (20 mM) og mangelfull Pi-forsyning førte til redusert utvikling av rotsystemet, sammenlignet med Pi-tilstanden (1,25 mM) (figur 4C). RSA kan kartlegges for forskjellige egenskaper ved hjelp av ImageJ-programvaren beskrevet i protokollen. Derfor er protokollen enkel, effektiv og kan enkelt endres i henhold til de utvalgte planteartene. Det gir mulighet til å studere RSA av ulike plantearter under forskjellige næringsforhold.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av prosedyren. Det skjematiske diagrammet skisserer de viktigste trinnene som er involvert i metodeprotokollen for kartlegging av RSA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Visning av hydroponisk oppsett i magenta bokser for å dyrke planter . (Som beskrevet av Jain et al.10, med modifikasjoner). (A) To rektangulære stykker (4 cm x 8 cm) med hakk av polykarbonatkiler for montering av oppsettet. (B) Montering av polykarbonatkiler i hverandre gjennom hakk som blir til en X-form for å støtte maskeoverflaten. (C) En 250 μm polypropylennettplate (6 cm x 6 cm). (D) Sett ovenfra av monteringen av polykarbonatkiler i magentaboksen. (E) Montering av polypropylennettet på polykarbonatkilene i en magenta boks fylt med medier. (F) En utstilling av Arabidopsis-plantetter spiret på nettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Påvisning av typisk RSA-modulasjon under varierende næringsforhold (Pi-mangelfull [0 mM] og tilstrekkelig [1,25 mM]) ved bruk av denne fenotypingsmetoden. Arabidopsis (Col-0) frøplanter dyrkes hydroponisk i 0,5x MS-medier i 5 dager, og deretter utsatt for Pi-mangelfulle og tilstrekkelige forsyninger (henholdsvis 0 og 1,25 mM) og dyrkes i 7 dager, som vist i figur 2. (A) Individuelle plantetter trekkes ut fra polypropylennettet (500 μm) og spres på agar petriskålene ved hjelp av en rund kunstbørste og vann. Data for RSA-egenskaper presenteres for (B) primærrot (PR) lengde, total rotlengde (TRL), forgreningssone (BZ), (C) gjennomsnittlig (Av.) første ordens lateral rotlengde (1° LR lengde), gjennomsnittlig (Av.) andre ordens lateral rotlengde (2° LR lengde), (D) antall 1° LR og 2° LR, og (E) 1° LR og 2° LR tetthet. Verdier er midler ± SE; n = 21. Denne figuren er modifisert fra Shukla et al.1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Demonstrasjon av Medicago sativa (Alfalfa) rotsystem som et eksempel for å vise anvendeligheten av denne metoden til andre planter i tillegg til Arabidopsis. (A) Sidevisning av magentaboksen som viser veksten av Alfalfa-planter. (B) Det øverste bildet av magentaboksen viser skuddets fremvekst på polypropylennettet (porestørrelse på 1000 μm). (C) Den typiske rotsystemarkitekturen (RSA) for alfalfa-modulasjon under varierende næringsforhold (Pi-mangelfull [0 mM], overflødig Pi [20 mM] og tilstrekkelig eller kontroll [1,25 mM]) ved bruk av denne RSA-fenotypingsmetoden. Alfalfaplanter dyrkes hydroponisk i 0,5x MS-medier i 5 dager, utsatt for Pi-mangelfulle, tilstrekkelige og overflødige forsyninger (henholdsvis 0, 1,25 og 20 mM), og dyrkes i 7 dager. Individuelle plantetter trekkes ut fra polypropylennettet (1000 μm) og spres på agar petriskplatene, som vist i C, ved hjelp av en kunstbørste og vann. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Ulike overskudd av Pi-konsentrasjoner modulerer rothårutvikling. WT-frøplanter ble dyrket hydroponisk, som beskrevet i protokollen. (A) Et 1-2 cm snitt fra spissen av primærroten ble hakket og montert på et lysbilde med 10% glyserol, og et 5 mm område fra spissen ble dokumentert for rothårnummer og lengde. Data presenteres for (B) rothårlengden og (C) antall rothår i et 5 mm område av den primære rotspissen. Verdier er midler ± SE; n = 10 (B og C). Søyler med forskjellige alfabokstaver varierer signifikant (p ≤ 0,05) i henhold til Student parvise t-test. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette arbeidet demonstrerte kartlegging av RSA ved hjelp av enkelt laboratorieutstyr. Ved hjelp av denne metoden registreres fenotypiske endringer på raffinert nivå. Fordelen med denne strategien er at skudddelen aldri kommer i kontakt med media, så fenotypen til plantene er original. Denne metoden innebærer å sette opp et hydroponisk system for å dyrke plantlets som beskrevet i protokollen. Deretter blir hver plante tatt ut intakt og plassert på en agarfylt petriskallerken. Rotsystemet får deretter lov til å spre seg manuelt ved hjelp av en kunstbørste, og fotografier blir tatt for å bli analysert med ImageJ-programvare 1,10,11,12.
Frøspredning krever sterilisering av frøoverflaten for å fjerne bakterier, sopp og virus. Alkohol - 70% etanol - brukes til å sterilisere frøflater. For å desinfisere frø uten å ødelegge dem, må behandlingstiden for alkoholsterilisering følges nøye. Frøspredning reduseres når alkoholsterilisering er overdrevet. Behandlingstider varierer med forskjellige plantearter (f.eks. For Arabidopsis er tidsbegrensningen bare 3 min 1,10,11,12,20, mens for Medicago sativa er det 5 min 19. For å legge til rette for jevn plukking av RSA for analyse, er det viktig å begrense antall frø per nett eller magenta boks, for å forhindre sammenfiltring av rotsystemet mellom seg 1,10,11,12. Dette kan oppnås ved å bruke et mindre antall frø per maske. For eksempel kan bruk av fire frø per nett bidra til å redusere risikoen for sammenfiltring samtidig som det muliggjør robust vekst og utvikling av rotsystemene. Det er viktig å merke seg at det optimale antall frø per nett avhenger av de spesifikke planteartene og målene for RSA-analysen. For eksempel, hvis et eksperiment krever vev for videre nedstrøms prosesseringskrav som RNA-isolasjon, anbefales i dette tilfellet bulksåing (100 frø per maske i tilfelle Arabidopsis) 1,10,11,12. Å plukke planter fra nettet er en delikat prosess som krever stor forsiktighet og oppmerksomhet 1,10,11. Det er viktig å nærme seg denne oppgaven sakte, forsiktig og forsiktig for å unngå å skade de delikate plantene. For å plukke planter fra nettet, anbefales det å bruke fin pinsett eller tang for å gripe plantlettene forsiktig, men fast. Plantlettene skal løftes forsiktig ut av nettet for å unngå å forstyrre rotsystemene eller forårsake skade på plantlettene. Det er viktig å være tålmodig og ta deg tid til å fjerne hver plante forsiktig fra nettet for å sikre at de ikke blir skadet under prosessen. Det er en gradvis prosess som bør utføres sakte, forsiktig og nøye for å sikre eksperimentets suksess. For å kunne måle RSA for planter nøyaktig, er det avgjørende å markere en skala på petriskålen for å muliggjøre presis måling 1,10,11. Dette kan gjøres ved å bruke en permanent markør for å tegne en linje på petriskplaten i kjent avstand, for eksempel 1 cm eller 2 cm. Skalaen skal plasseres langs kanten av petriskplaten på et synlig sted. Ved hjelp av en børste, er det også viktig å ta ytterste forsiktighet når du sprer RSA. Den primære roten skal plasseres nøye i midten av petrisken, og siderøttene skal spres ut på begge sider av primærroten. Rotsystemet skal være delvis nedsenket i vann for å lette spredningen. For å måle hver nye petrisklate må man angi skalaen i ImageJ-programvaren hver gang.
Få modifikasjoner kan brukes for å forbedre effektiviteten, ikke-invasiviteten og effektiviteten av RSA-analyse1. En slik forbedring er å endre porestørrelsen på polypropylennettet som brukes til å holde plantlettene. Porestørrelsen på nettet kan justeres for å passe de spesifikke behovene til planteartene som studeres og for å optimalisere veksten og utviklingen av rotsystemene 1,10,11,12. For eksempel letter en større nettporestørrelse (500 μm) jevn plukking av hele frøplanter uten å kutte hypokotylen, som tidligere ble praktisert10,11,12. Videre kan en større porestørrelse være mer egnet for større plantearter RSA, mens en mindre porestørrelse kan være mer hensiktsmessig for mindre plantearter. En annen modifikasjon som kan gjøres er å pakke polypropylennettet i aluminiumsfolie for å forhindre at det bøyer seg. Dette kan bidra til å opprettholde formen og integriteten til nettet, noe som gjør det egnet til å tjene som en flat gulvmatrise. I tillegg til disse modifikasjonene, kan andre feilsøkingsteknikker brukes til å løse eventuelle problemer som kan oppstå under RSA-analyse. For eksempel, hvis plantene ikke vokser eller utvikler seg som forventet, kan det være nødvendig å justere miljøforholdene, for eksempel temperatur, fuktighet og lysnivå. Hvis rotsystemene er viklet inn, kan det være nødvendig å redusere antall frø per nett, som nevnt ovenfor.
En av de viktigste fordelene med RSA-analyse er at det gjør det mulig å studere planterotsystemer uten behov for agar. Agar brukes ofte som størkningsmiddel i plantevevskultur og frøspiringseksperimenter. Bruk av agar kan imidlertid introdusere elementær forurensning som potensielt kan generere artefakter og påvirke nøyaktigheten av resultatene10. Ved å utelukke kravet om agar, eliminerer RSA-analyse risikoen for agar-avledet elementær forurensning og potensialet for gjenstander. Dette gjør RSA-analyse til en mer pålitelig og nøyaktig metode for å studere planterotsystemer 1,3,10,11,12. For eksempel har effektene av Pi-deprivasjon på lateral rottetthet vært gjenstand for en rekke motstridende rapporter. Det har blitt rapportert at LR-tettheten øker når Pi er lav 6,8. Derimot er det også funnet et fall i lateral rottetthet ved Pi-mangelforhold 3,13,16. Disse avvikene kan skyldes det agarbaserte vekstmediesystemet, der arbeidere bruker forskjellige merker av agar for å jellify media med varierende grad av Pi-forurensning10. Igjen kan eksperimenter som søker å illustrere effekten av Zn-mangel på RSA, ikke utføres tilstrekkelig ved bruk av den agarbaserte petriskplatemetoden, fordi det agarbaserte geleringsmediet også inkluderer Zn-forurensning11. Derfor kan det ikke være hensiktsmessig å utføre RSA-analyse for å undersøke næringsmangel ved bruk av det agarbaserte geleringsmediet. For det andre utvikler planter dyrket på agarbaserte geleringsmedier ikke så raskt som de som dyrkes hydroponisk. For det tredje, fordi RSA vanligvis er innebygd i et agarmedium, vises mange rotfunksjoner ikke riktig. For det fjerde forårsaker fjerning av RSA fra mediet ofte betydelig skade på RSA og gjør det til en destruktiv prøvetakingsteknikk.
Den forrige hydroponiske teknikken, som publisert av Jain et al.10, brukte en polypropylenmaskestørrelse på 250 μm, som hadde smalere porer som ikke gjorde det mulig å trekke ut den intakte RSA. Som et resultat, i det spesielle tilfellet, måtte vi kutte plantene fra hypocotyl-regionen for å skille RSA, og gjøre det til en destruktiv prøvetakingsmetode10,11,12. Den eksisterende metoden improviseres for å gjøre den ikke-destruktiv ved å bruke et polypropylennett med større porestørrelse (500 μm) som gjør det mulig å trekke ut hele Arabidopsis-plantetter intakt uten å påføre RSA1 skade. Det er verdt å merke seg at vi alltid kan justere porestørrelsen på polypropylennettet, avhengig av plantens type. For eksempel illustrerer figur 4 hvordan en lignende tilnærming kan brukes til å kartlegge RSA av forskjellige planter, for eksempel Medicago sativa (Alfalfa). Vi har valgt polypropylenporestørrelsen på 1 mm for å imøtekomme Medicago-rotsystemet.
En ulempe med dette systemet kan være utviklingen av rothår, som ofte ikke blomstrer under hydroponiske systemer sammenlignet med agarplatesystemer. Den primære årsaken er den enkle tilgjengeligheten av næringsstoffer i flytende medier i stedet for i faste medier. Selv om vi observerte utviklingen av rothår (ikke robust) med samme system og fikk resultatene (tilleggsfigur 1). Tilgjengeligheten av Pi påvirker sterkt rothårutviklingen10,11. Her økte rothårlengden først til 2,5 mM, for så å avta.
Til sammen er de viktigste fordelene ved systemet: (1) det er en enkel og presis metode som ikke krever noe sofistikert avansert utstyr; (2) metoden tillater rask vekst av plantene på grunn av sin hydroponiske natur; (3) det er en ikke-destruktiv metode; (4) manuell spredning av RSA tillater riktig visning av hvert trekk, avslører den skjulte RSA, og gir full kontroll til brukeren; og (5) metoden benytter en fritt tilgjengelig bildebehandlingsprogramvare (dvs. ImageJ), som også er enkel å bruke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkjenner det amerikanske landbruksdepartementet (Grant 58-6406-1-017) for å støtte denne forskningen. Vi anerkjenner også WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, USA, og direktøren, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, for å tilby instrumentfasilitetene og støtten (CSIR CIMAP manuscript communication no. CIMAP/PUB/2022/103). SS anerkjenner den økonomiske støtten fra Saint Joseph's University, Philadelphia, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd,, E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. National Institutes of Health. , Bethesda, Maryland, USA. 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
