Summary
Rask myokard- og hjerteavslapping er viktig for normal fysiologi. Mekaniske avslapningsmekanismer er nå kjent for å være avhengig av belastningshastighet. Denne protokollen gir en oversikt over oppkjøp og analyse av eksperimenter for å studere den mekaniske kontrollen av avslapning ytterligere.
Abstract
Diastolisk dysfunksjon er en vanlig fenotype på tvers av kardiovaskulære sykdomspresentasjoner. I tillegg til forhøyet hjertestivhet (forhøyet venstre ventrikkel endediastolisk trykk) er nedsatt hjerterelaksasjon en viktig diagnostisk indikator på diastolisk dysfunksjon. Mens avslapning krever fjerning av cytosolisk kalsium og deaktivering av sarkomeriske tynne filamenter, har målretting av slike mekanismer ennå ikke gitt effektive behandlinger. Mekaniske mekanismer, som blodtrykk (dvs. etterbelastning), har blitt teoretisert for å modifisere avslapning. Nylig viste vi at modifisering av belastningshastigheten til en strekning, ikke etterbelastning, var både nødvendig og tilstrekkelig til å modifisere den påfølgende avslapningshastigheten av myokardvev. Belastningshastighetsavhengigheten av avslapning, kalt mekanisk kontroll av avslapning (MCR), kan vurderes ved hjelp av intakte hjertetrabekler. Denne protokollen beskriver utarbeidelse av en smådyrmodell, eksperimentelt system og kammer, isolering av hjertet og påfølgende isolering av en trabecula, forberedelse av eksperimentkammeret og eksperimentelle og analyseprotokoller. Bevis for forlengelse av stammer i det intakte hjertet tyder på at MCR kan gi nye arenaer for bedre karakterisering av farmakologiske behandlinger, sammen med en metode for å vurdere myofilamentkinetikk i intakte muskler. Derfor kan studier av MCR belyse en vei til nye tilnærminger og nye grenser i behandlingen av hjertesvikt.
Introduction
Hjerterelaksasjon er svekket ved nesten alle former for hjertesvikt (inkludert hjertesvikt med redusert ejeksjonsfraksjon) og ved mange hjerte- og karsykdommer. I tillegg til mange metoder for å evaluere hjertefunksjonen i permeabiliserte muskler, får evalueringen av intakte hjertemuskler interesse. Slike vev vurderes losset (ender fri til kontrakt) eller lastet (lengde eller kraftstyrt). Historisk har intakte isolerte myocytter blitt evaluert i en ubelastet tilstand, hvor cellelegemet er fritt til å forkortes under sammentrekning. Intakte hjertetrabekler evalueres ofte under isometriske forhold, der lengden ikke får endre seg, men stress (kraft per tverrsnittsareal) genereres. Både intakte myocytt- og trabeculae-metoder begynner å konvergere med modifikasjoner av belastning 1,2.
Protokoller for belastningsklemming av en muskel (dvs. kontroll av en muskels utviklede stress ved en spesifisert verdi som simulerer fysiologiske etterbelastninger) har blitt utviklet over flere tiår 3,4,5. I intakte hjertevev tillater belastningsklemmer forskere å etterligne in vivo hjertesyklusen ved hjelp av isotoniske eller Windkessel-lignende etterbelastninger 6,7,8,9. Målet med denne protokollen er å skaffe data som brukes til å kvantifisere MCR (dvs. belastningshastighetsavhengigheten av avslapningshastigheten)8,9.
Mens MCR-protokollen er tilpasset fra tidligere arbeid, er fokuset på denne protokollen (sammenlignet med lignende protokoller som bruker intakt hjertevev) på biomekaniske mekanismer som modifiserer avslapning. Det er flere protokoller som bruker lastklemming 3,4,5,7,10 og protokoller som fokuserer på Windkessel-modeller 1,2,11, men denne protokollen beskriver spesifikt hvordan strekk før avslapning endrer avslapningshastigheten. Vi har vist at denne kontrollen skjer i en proto-diastolisk periode8, en fase opprinnelig beskrevet av Wiggers12. I normalt friske hjerter gjennomgår myokardiet en forlengende belastning under utstøting før aortaklafflukking (dvs. før isovolumisk relaksasjon)13. Dette etterlignes ved å forlenge varigheten av etterbelastningskontroll til muskelen begynner å strekke seg. Klinisk dokumentasjon tyder på at denne forlengelsen kan svekkes eller gå tapt ved sykdomstilstander14, og implikasjonene og mekanismene for endrede endesystoliske belastningshastigheter er ikke fullstendig klarlagt. Gitt de sparsomme behandlingsalternativene for diastoliske sykdommer og hjertesvikt med en bevart ejeksjonsfraksjon, antyder vi at MCR kan gi innsikt i nye mekanismer som ligger til grunn for nedsatt relaksasjon.
Mens grovdisseksjonen beskrevet her fokuserer på gnagere, kan trabecula-isolering utføres fra ethvert intakt hjerte, og har tidligere blitt brukt med en human hjertetrabecula8. På samme måte kan datainnsamlingen og analysen også brukes på kardiomyocytter eller andre isolerte muskeltyper 1,10. Diskusjonen inkluderer kommentarer til mulige endringer og tilpasninger til metoden, sammen med begrensninger, for eksempel forsiktighet mot å bruke papillære muskler på grunn av de mekaniske egenskapene til akkordae9.
Protocol
Følgende protokoll er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Wayne State University. Protokollen beskriver her trinn for bruk av forsøkspersoner med gnagere, men kan tilpasses for bruk i andre modellorganismer.
1. Forberedelse
- Få tak i eksperimentelle faget og la det akklimatisere seg til laboratoriet.
- Klargjør 250 ml perfusjonsoppløsning og 250 ml modifisert Tyrodes oppløsning (tabell 1), ved å oksygenere hver til 10-20 ppmO2, med pH 7,3.
- Klargjør en 5 ml sprøyte med kanyle påmontert. Fyll sprøyten med perfusjonsoppløsning. Bruk kanyler som er 23 G for en mus, og 18 eller 16 G for henholdsvis en liten eller stor rotte. Skyv en 1 mm lengde av polyetylen (PE) slange på enden av en stump nål (Table of Materials), for å forhindre at aorta glir av kanylen etter å ha blitt bundet.
- Fullstendig klargjøring av disseksjons- og kanyleringsområdet (figur 1)
- Fyll to rene veiebåter minst halvveis med perfusjonsløsning. Senk kanylespissen i perfusjonsløsning med minst en dobbeltsløyfe sutur plassert rundt kanylen. Hold sprøyten på plass med en stangklemme.
- Plasser kirurgisk saks, en hemostat, iris tang, et par små buede saks, og to # 3 tang for enkel tilgang.
- Forbered det eksperimentelle systemet (figur 2) ved å prime og sirkulere den modifiserte Tyrodes løsning gjennom hele eksperimentsystemet. Sørg for at kammeret er helt fullt og stabilt.
- Slå på alle datainnsamlingsbokser, inkludert krafttransduseren, lengdemotoren, pacingsystemet, temperaturkontrollsystemet og datainnsamlingsdatamaskinen.
- Kopier og gi nytt navn til en malmappe som inneholder de nødvendige DAP- og pekerfilene for å referere til det gjeldende eksperimentet. Åpne programvaren for datainnsamling.
- Forbered trabecula-isolasjonsverktøyene (Vannas saks, #5 eller #55 tang, glasssonde) ved å senke spissene i 10% (w / v) bovint serumalbumin (BSA) i ultrarent vann eller perfusjonsløsning, for å belegge metallet med protein (figur 2B).
MERK: Hele eksperimentsystemet må utarbeides før disseksjon.
2. Grov disseksjon og kanylering
- Registrer identifikasjon, kroppsvekt og annen relevant informasjon om dyrets emne.
- Injiser eventuelt 1000 E/kg heparin i sterilt saltvann til gnageren via intraperitoneal injeksjon minst 10 minutter før eutanasi, for å minimere risikoen for koagulering før koronar perfusjon.
- Plasser dyret i et induksjonskammer og induser generell anestesi ved bruk av 3% -5% isofluran fordampet i 100% oksygen, i henhold til standard prosedyre.
MERK: Slå på eventuelle eksterne åtseletere, duntrekkbord eller avtrekkshetter som brukes for å minimere eksponering for isofluran. - Når gnageren mister sin rette refleks og pustefrekvensen har bremset:
- (For en rotte) fjern dyret fra induksjonskammeret og legg det liggende på en disseksjonspute, med fortsatt anestesi gjennom en nesekegle.
- (For en mus) utfør cervikal dislokasjon umiddelbart etter fjerning av dyret fra induksjonskammeret. Nesekeglen er ikke nødvendig. Vri isofluran fordamper til 0%.
- Hvis nødvendig, fest gnagerens øvre lemmer til disseksjonsputen vekk fra brystveggen ved hjelp av tape støttet av pinner, og pass på at du ikke stikker inn i dyret. Sjekk for riktig anestesi dybde (mangel på tå-klemme respons) før du fortsetter til disseksjon.
- Ved hjelp av kirurgisk saks (Mayo for rotter, Metzenbaum for mus), like under xyphoidprosessen, kutt huden tverrgående over hele bredden av gnagerens mage inn i bukhinnen.
- Bruk kirurgisk saks, gjør to vertikale kutt parasagittal (opp sidene av brystveggen) på både venstre og høyre side av brystveggen fra tverrsnittet. Deretter kutter du over membranen, forbinder de parasagittale kuttene og frigjør thoraxrommet.
- Klem og løft xyphoidprosessen ved hjelp av en hemostat mot gnagerens hode, for å bevege brystbenet og brystveggen opp mot gnagerens hode, og utsette thoraxrommet og hjertet. Hvis nødvendig, forleng raskt de parasagittale kuttene til nær det andre vertebrale rommet, for å eksponere hjertet fullt ut og / eller bryte perikardmembranen.
- Ved hjelp av buede iristang, løft forsiktig hjertet for å visualisere de store fartøyene. Plasser tangen mellom myokardiet og ryggraden til gnageren, klem ned på de større karene og løft hjertet, pass på at du ikke klemmer atriene eller ventrikulære segmentene.
- Mens du løfter hjertet litt, plasserer du raskt den buede irissaksen (konkav opp) mellom de buede iristangene og gnagerens ryggrad, og kutter de store karene og lungene bort fra hjertet. Flytt hjertet raskt inn i en veiebåt eller beger som inneholder fersk perfusjonsløsning, og rist for å fjerne blod fra hjertet.
- Vri isofluran fordamper til 0%, hvis ikke allerede gjort. Hvis store segmenter av lunge-, perikardiale eller andre vev forblir festet til hjertet, kutt forsiktig bort og kast dem på dette tidspunktet for å minimere forstyrrelser i kanyleringen.
- Bruk de buede iristangene, flytt hjertet inn i en ren veiebåt eller beger, med den forberedte kanylen nedsenket. Kanyler aorta, fest aorta ved å stramme den sløyfede silkesuturen, og skyll med opptil 5 ml perfusjonsløsning.
- Fjern hjertet fra kanylen og legg det i en silikonelastomerbelagt veieform for å forberede seg på trabecula-isolasjon.
3. Isolering og likevekt av trabecula
- Plasser hjertet i silikonelastomerbelagt tallerken under et stereomikroskop og belys det.
- Finn den høyre ventrikulære utstrømningskanalen. Fest venstre atrium og ventrikulær apex til silikonelastomeren i parabolen.
- Bruk lange Vannas saks, kutt fra høyre ventrikulær utstrømningskanal til toppunktet langs septum. Skjær fra høyre ventrikkels utløpskanal til høyre atrium nær aorta, og skjær deretter gjennom høyre atrium (figur 3B).
- Bruk tang, trekk forsiktig opp den høyre ventrikulære (RV) frie veggen fra utstrømningskanalen, vær forsiktig så du ikke strekker vevet.
MERK: Eksperimenter kan finne tynne, hvite bindevevstråder, som kan kuttes uten bekymring. Større, rosa (vev) fargede tråder bør vurderes med forsiktighet, da de kan være trabeculae som kan isoleres. - Fest den frie veggen i høyre ventrikkeltrekant til parabolen for å eksponere høyre ventrikkel (figur 3C).
- Bruk en glasspipette som er smeltet og dannet med en tynn (<500 μm diameter), men ikke skarp ende, søk det eksponerte endokardiet for frittstående trabekler (figur 3C).
MERK: En frittstående trabecula er en muskelstrimmel som man kan undersøke under. Bruk trabeculae som har parallelle sider (konstant bredde), unngå trekantede papillære muskler. Vær forsiktig under denne prosessen og påfølgende disseksjon, da påføring av belastning på trabecula kan forårsake skade og redusere den utviklede kraften. - Dissekere trabeculaen ved hjelp av små Vannas saks. Legg igjen et ≥1 mm kubet stykke vev i hver ende av trabeculaen for å tillate festing. Ikke strekk trabeculaen der det er mulig, og minimer kontakt med metallverktøy, da begge også kan forårsake skade på muskelen. Flytt pinnene som holder hjertet etter behov for å minimere belastningen på muskelen nær trabeculae identifisert.
- Skjær ~2 tommer av enden av en 7 ml overføringspipette, trekk trabekulaen sakte inn i pipetten og overfør den til en ny veieform som inneholder 50 % perfusjonsoppløsning og 50 % modifisert Tyrodes løsning. La muskelen balansere til økningen i ekstracellulært kalsium i den blandede løsningen i flere minutter.
- Gjenta trinn 3.7-3.8 for å dissekere ytterligere trabecula på dette tidspunktet, for å få ytterligere trabecula som backup.
- Slå av pumpen som leverer superfusjon og/eller sug til eksperimentkammeret. Bruk den store overføringspipetten til å flytte trabekulaen inn i eksperimentkammeret fylt med Tyrodes løsning.
- Fest ett >1 mm kubestykke vev på enden av trabekulaen til en krok på krafttransduseren, og fest deretter den andre kuben til motoren.
MERK: Separer motoren og krafttransduseren når du monterer den første siden for bedre tilgang til transduseren, og flytt deretter krokene så tett sammen som mulig når du monterer den andre kuben av vev mens trabeculaen forblir slakk. - Start superfusjon på nytt og begynn å pace muskelen for å bestemme terskelspenningen. Tempo på 20% over terskelspenningen i ca. 1 time for å la trabecula likevekte.
- På slutten av denne likevektsperioden, strekk sakte muskelen ved hjelp av mikrometeret som er koblet til motoren til optimal utviklet stressgenerering oppnås, ved å observere den utviklede (minimum til topp) spenningen. Slutt å øke muskellengden når den passive diastoliske spenningen stiger raskere enn toppspenningen, noe som indikerer at den optimale lengden er passert.
- Slå av den overførte mikroskopbelysningen, og belys trabekulaen ved hjelp av en svanehalsbelysning i bratt vinkel. Ved hjelp av et kamera koblet gjennom mikroskooptikken som tidligere har blitt kalibrert, ta et bilde av trabecula under diastol inn i eksperimentell mappe. Hvis trabeculaen er bredere enn kameraets synsfelt, ta flere bilder over muskelen.
- Åpne bildene i et bildebehandlingsprogram som rapporterer pikselavstander.
- Mål pikselavstanden til muskeldiameteren fire ganger langs lengden. Mål muskellengden (trabecula) i piksler, unntatt den store kuben av vev.
- Hvis muskellengden er lengre enn synsfeltet, bruk referansepunkter langs muskelen for å måle hele lengden.
- Bruk malen i eksperimentmappen til å beregne gjennomsnittet av diametermålene, og konverter diameteren og lengdene fra piksler til mm ved hjelp av en tidligere kalibrering. Beregn tverrsnittsarealet som π*diameter 2/4 i mm2, og muskellengden i μm.
4. Innsamling av data
- Når muskelen er balansert, åpner du datainnsamlingsprogramvaren, velger Eksperimenter | Lengdekontroll, og angi den kalibrerte trabekulalengden (FL) og tverrsnittsarealet (areal [m2]) i kalibreringsboksen.
- Fra malmappen (trinn 1.7) kontrollerer du at freeform_file.txt peker til riktig mappe, og åpner filen freeform.dap i et tekstredigeringsprogram. Sett isotonnivået (isoton) til 32 000 i *.dap-filen.
- Velg kategorien Frihåndsform i Lengdekontroll-boksen, og bla til den aktuelle frihåndslistefilen. Kontroller at dataarkiveringsbanen også er riktig mappe for lagring av data. Begynn å hente data fra fullstendig isometriske rykninger ved å trykke på Run Experiment, før du henter belastningsklemmedata ved hjelp av en tilbakemeldingskontroll med proporsjonale parametere og integrasjonsforsterkningsparametere.
- Innhent lastklemte data ved å definere etterbelastningen (isoton) i *.dap-filen, og gjenta verdier for proporsjonal forsterkning (propgain) og integrasjonsparametere (Ki) ved å lagre filen i tekstredigeringsprogrammet. Trykk på Kjør eksperiment i programvaregrensesnittet for datainnsamling.
- Forsikre deg om at klemmen inkluderer forlengelse tilbake til sin opprinnelige lengde (noen ganger referert til som avslapningsbelastning5) under denne iterasjonen for å oppnå det maksimale strekkhastighetsområdet, ved å sette modus (flswitch) fra en og øke terskelen for å avslutte lastklemmen (flthreshold) fra null.
- Kontroller enden av lastklemmen ved å endre modus (flswitch) fra en til null. Gjenta anskaffelsen mens du endrer enden av lastklemmen fra null forlengelse til fullstendig forlengelse tilbake til startlengden.
- For å øke lengden, øk gradvis terskelen for å avslutte belastningsklemmen (flthreshold) fra null til muskelen nesten forlenges tilbake til sin opprinnelige lengde.
- Tilbakestill modus (flswitch = 1) og terskel (flthreshold = 0), og kjør en siste datainnsamling.
- Hvis ønskelig, kan du endre etterbelastningen i studien ved å gjenta trinn 4.4-4.6. Denne anskaffelsen kan gjøres umiddelbart.
- Hvis ønskelig, modifiser forspenningen ved å strekke eller forkorte muskelen, eller behandle muskelen ved å tilsette forbindelser til Tyrodes løsning. Hvis du endrer forspenningen eller tilsetter forbindelser, må du vente minst 20 minutter for å sikre at den langsomme kraftresponsen 9,15 har stabilisert seg og/eller at forbindelsen trenger helt inn i muskelen.
- Når datainnsamlingen er fullført, fjern trabeculaen. Hvis nødvendig, frys eller fiks trabekulaen for biokjemisk eller histologisk analyse.
- Rengjør arbeidsområdene og eksperimentsystemet, skyll alle slanger med vann og slå av alle komponenter.
5. Dataanalyse
- Åpne datafilene ved hjelp av et kvantitativt analyseprogram ved å dirigere programmet til riktig filbane.
- Kvantifiser avspenning ved å sikre at dataanalyseprogrammet analyserer den klemte takten, og at programmet korrekt oppnår starten på lastklemmen.
- Sørg for at enden av lastklemmen er identifisert, slik at relaksasjonshastigheten (1 / τ) kvantifiseres fra den maksimale negative deriverte av stress under en isometrisk relaksasjon.
- Bruk Glantz-metoden16 for å bestemme denne eksponentielle tidskonstanten, eller annen passende kvantifisering av relaksasjon (minimum derivert av stress, logistisk tidskonstant17 eller kinematisk modell18).
- Sørg for at dataanalyseprogrammet beregner tøyningshastigheten ved å ta tidsderivert av belastningen, der tøyningen beregnes som lengden som en funksjon av tid delt på lengde ved optimal sammentrekning.
- Gjenta trinnene ovenfor for alle spor av en gitt tilstand.
- Plott forholdet mellom relaksasjonshastigheten og belastningshastigheten, og begrens maksimumsdataene til en fysiologisk belastningshastighet på mindre enn 1 s-1. Ekskluder data ved lave belastningshastigheter (figur 4C), da relaksasjonsfasen kanskje ikke gjenspeiler det eksponentielle henfallet17,18.
- Få hellingen på linjen mellom relaksasjonshastigheten og belastningshastigheten, og registrer stigningstallet som indeksen for MCR.
- Gjenta analysen ovenfor for hver forhørt tilstand.
Representative Results
Et representativt datasett er vist i figur 4, og ytterligere resultater finnes i tidligere publikasjoner 8,9. Kort fortalt beregnes belastningshastigheten fra derivatet av stammen, like før isometrisk avslapning. Belastning er lengden som en funksjon av tid dividert med lengden på muskelen ved optimal lengde. Relaksasjonsfrekvens beregnes som 1/τ, hvor τ er den eksponentielle tidskonstanten16. Flere belastningshastigheter og deres resulterende avslapningshastigheter kreves for å bestemme mekanisk kontroll av avslapning (MCR). Disse dataene er plottet på en avslapningsrate versus belastningshastighetsgraf. Linjens helning gir MCR-indeksen.
Merk at systoliske og diastoliske belastningshastigheter ikke sannsynligvis vil overstige 1 s-1. Derfor bør skråningen bare inneholde belastningshastigheter < 1 s-1. Relaksasjonshastigheten ved lave belastningshastigheter kan bli forvirret av endringer i minimumstidsderivatet av stress (dStress / dtmin), og i disse tilfellene kan data fra strekninger mindre enn ca. 0,15 s-1 ignoreres.
Figur 1 Oppsett av grov disseksjon og hjertekanyleringsområde. Fra høyre mot venstre: a. Anestesiinduksjonskammeret for dyret ligger nær disseksjonsområdet. b. En snorkel for valgfri flyktig gassrenser. c. En disseksjonspute, hvor dyret vil bli plassert liggende, er flankert av (med urviseren) d. en nesekjegle, for å gi fortsatt anestesi til gnageren, e. hemostater, f. kirurgisk saks, g. buet fin saks plassert for enkel tilgang med den dominerende (skjærende) hånden, h. buede iritang plassert for enkel tilgang med den ikke-dominerende hånden. Øvre lemmer av gnageren kan festes til disseksjonsputen ved hjelp av tape, og i. en disseksjonsfat (eller liten beger) med perfusjonsoppløsning bør plasseres i nærheten for å skylle hjertet. j. Et område iscenesatt for kanylering må plasseres i nærheten. En sprøyte med egnet kanyle er montert på et ringstativ. k. (Innfelt) Et nærmere bilde av en 16 G kanyle, med 1 mm PE205-rør festet og en sutur løst knyttet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksperimentelt område og verktøy. (A) Eksperimentelt område. Det eksperimentelle kammeret og datainnsamlingssystemet er utarbeidet på et nærliggende invertert mikroskop (venstre). Trabecula isolasjon og montering skjer under et stereoskop (høyre). (B) Tips av to tang, store og små Vannas saks, og en tilpasset glasssonde er forberedt ved å suge i 10% BSA løsning. (C) Ytterligere disseksjonsverktøy. En silikon elastomerbelagt tallerken gjør det mulig å montere hjertet under fin disseksjon. En 7 ml overføringspitte med endekutt vises under fat- og glasssonden. Kuttspissen på overføringspipetten kastes, og en forstørret boring brukes til å overføre muskelen, med minimal risiko for strekking eller dehydrering. (D) Forstørret bilde av enden av en glasspipette, som er ca. 2 mm lang og 0,25-0,5 mm i diameter. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Veiledning for disseksjon. (A) Grov disseksjon bør begynne med et tverrgående kutt (1. grønt) gjennom huden inn i bukhulen under xyphoidprosessen (nedre ribber og xyphoid er indikert med en tynn grå linje). Parasagittale kutt fra bukhulen opp i brystkassen skal følge (2. blågrønne og 3. blå linjer), hvoretter membranen skal kuttes. En hemostat kan deretter brukes til å klemme xyphoid-prosessen og heve brystveggen mot hodet. (B) Et intakt rottehjerte festet til en silisium-elastomerfat, orientert med utsikt over høyre ventrikkelutstrømningskanal (RVOT), høyre atrium (RA), aorta (Ao) og venstre atrium (LA). Det første settet med kutt skal være fra RVOT til toppunktet langs septum (1. Gul linje). Et annet sett med kutt bør være fra RVOT langs bunnen av hjertet og deretter over høyre atrium (2. oransje linje). (C) RVOT kan trekkes forsiktig bort fra aorta for å åpne hjertet og feste det tilbake. Gule og oransje linjer tilsvarer kutt beskrevet i B. Frittstående trabeculae finnes ofte nær bunnen av RV-friveggen og nær septum, men kan forekomme hvor som helst (røde linjer indikerer vanlige steder). (D) Forstørret bilde av glasssonden under en trabecula (gul pil indikerer skjæringspunktet mellom trabecula og sonde). (E) En trabecula (rød pil) er montert på det eksperimentelle systemet mellom en krafttransduser (venstre) og motor (sentrum-høyre), og er flankert av to pacingledninger (horisontalt over og under trabecula). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative spor og resultater . (A) En enkelt hjertetrabekula opplyst ved hjelp av et svanehals LED-lys i en bratt (~ 75 °) vinkel fra mikroskoplinsens akse, noe som forbedrer kontrasten til trabekulaen. I dette eksemplet er to bilder flislagt for å vise trabekulaens fulle lengde. (B) Spenningstid (øverst) og tøyningstid (nederst) kurver for samme trabekula. En isometrisk rykning, sammen med tre belastningsklemmerykninger ved økende systoliske belastningshastigheter er vist. (C) Representativ MCR-beregning. MCR er definert som helningen på linjen mellom relaksasjonshastigheten og belastningshastigheten. Som nevnt i diskusjonen, kan belastningshastigheter begrenses for å gi en kvantitativ, reproduserbar MCR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Løsninger. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Discussion
Mekanisk kontroll av avslapning (MCR) kvantifiserer avhengigheten av myokardial avslapningshastighet på belastningshastigheten til muskelavslapningen 8,9. Belastningshastighet, i stedet for etterbelastning, er både nødvendig og tilstrekkelig til å endre avslapningshastigheten8. Siden intervensjoner for å modifisere kalsiumhastigheten ikke har vist seg å forbedre hjerteavslappingen vesentlig, kan mekanisk inngrep gi ny innsikt i mekanismen og gi en ny behandling for diastolisk dysfunksjon.
Protokollen for å modifisere myokardstammehastigheten beskrevet her benytter en isoton belastningsklemme 8,9. En styrke ved den isotone lastklemmen er den kvantitative kontrollen av etterbelastningsspenningen. Windkessel-lignende protokoller kan brukes til å undersøke endringer i etterbelastning, forbelastning og hjertearbeid 2,6,7. En rampe som ikke styres av lastklemmen, kan også brukes til å bedre isolere endringen i belastning fra belastningshastighet. Uansett ser ikke etterbelastningen i seg selv ut til å være en sterk modifikator av avslapningshastigheten8.
Protokollen kan også tilpasses for å nærme seg mer fysiologiske forhold for temperatur og tempohastighet. De gjeldende protokolldetaljene ble brukt til å vise tilstedeværelsen av MCR. Gjennomføring av eksperimenter under fysiologiske forhold anbefales generelt, avhengig av eksperimentelle spørsmål. Imidlertid kan eksperimenter utført ved 37 °C, eller ved høye tempohastigheter, raskere indusere nedkjøring (skade) på muskelen. Det kan være behov for en løsning med forbedret oksygenbæreevne. Videre må datainnsamlingen kunne prøve lengden og kraften raskt nok til å løse de raske rykningene og gi tilbakemeldingskontroll.
Gjeldende protokoll beskriver ikke måling av kalsium eller måling og kontroll av sarkomerlengder. Kalsiummålinger er adressert i andre protokoller11, mens sarkomerlengdemåling kan legges til med passende utstyr. Sarkomerlengdekontroll benyttes ikke i nåværende MCR-studier, fordi muskellengde er den mest korrelative parameteren til den kliniske tilstanden19. Videre sarkomerlengdekontroll (vs. muskellengdekontroll) vil gi spesifikke svar på kinetiske spørsmål, men vil neppe øke translasjonskunnskapen på grunn av intersarkomervariasjon og minimumsforståelsen av sarkomerlengdeendringer in vivo.
Tre eksperimentelle hensyn er fremhevet her for å øke reproduserbarheten av dataene.
For det første kan frittstående hjertetrabekler være vanskelig å finne hos noen dyr (upubliserte resultater og kommunikasjon). Mens rykningsmuskler kan finnes hos de fleste rotter, er en rimelig suksessrate for å skaffe data fra trabecula hos rotter en av tre. Trabecula-suksessen kan være høyere med Brown Norway x Lewis F1-rotter, som også har vært brukt historisk20 og rapportert å ha flere trabeculae (upublisert kommunikasjon). For mus vil suksessratene sannsynligvis være lavere, med mindre enn en av 10 forventet for mus med BL/6-bakgrunn; Imidlertid forventes en høyere rate for mus med FVBN-bakgrunn (upublisert kommunikasjon og observasjoner).
For det andre kan skade på muskler redusere produksjonen. Hvis de utviklede kreftene er mindre enn 10 mN mm-2 ved 25 ° C og 0,5 Hz pacing, kan etterforskere trenge å utføre feilsøking for å vurdere om utilsiktet strekking eller kontakt mellom metalltang og muskel oppstår, hvis løsninger ikke er riktig forberedt, eller hvis pacing eller eksperimentelt utstyr fungerer som det skal. Andre protokoller som benytter intakt trabecula har foreslått å bruke Luer-lock sprøyter som overføringsfartøy11. Selv om dette er mulig, spesielt hvis brukeren kontrollerer en svært langsom strømningshastighet eller mindre muskelsegment, bruker den nåværende protokollen en mye større boreoverføringspipette for å minimere mulig skade. Et annet trinn hvor iskemisk skade kan oppstå er under disseksjon. Aorta bør kanyleres og skylles med perfusjonsoppløsning innen 3 minutter etter første abdominale kutt (rotte) eller cervikal dislokasjon (mus), tilsvarende grensene listet opp i kardiomyocyttisolasjonsprotokollene21,22. Dette minimerer tiden når hjertevevet ikke blir utsatt for den kardioplegi-lignende perfusjonsløsningen. Videre produserer disseksjoner som varer mer enn 30 minutter vanligvis ikke rykninger trabecula. Dermed bør operatørene øve rask, men forsiktig disseksjon for å minimere skade. Et tverrsnittsareal over 0, 2 mm 2 (2 x 10-7 m2) kan lide av kjerneiskemi20.
For det tredje bør måten musklene er festet til motoren og krafttransduseren vurderes på. Denne protokollen fokuserer for tiden på kroker og frittstående trabekler. Den noen ganger raske belastningshastigheten på strekningen før avslapning kan føre til at en muskel glir hvis den ikke er festet riktig, og det er grunnen til at den nåværende protokollen ikke bruker "kurver" for å holde trabecula23,24. Alternative monteringsmetoder (lim, klips, etc25,26) kan også vurderes og valideres. Protokollen beskrevet her bruker trabeculae og ikke papillære muskler. Papillærmuskelens akkordae induserer en serieelastisitet som kan hemme endringer i MCR9. Den nøyaktige plasseringen av festene i muskelen vil imidlertid neppe påvirke tiltakene, fordi trabekulalengden (og diameteren) varierer betydelig.
En begrensning ved å stikke hull i muskelendene med kroker er at selve monteringspunktet også kan bli skadet. Mulig rive av det festede muskelvevet med hyppige sammentrekninger (avhengig av deres styrke) kan endre lengden eller serieelastisiteten. Denne rivehastigheten er vanskelig å kontrollere. På samme måte kan skader på vevet og kroken forverres under strekking, noe som også potensielt kan forårsake problemer. Visuell inspeksjon, og de utviklede kraftverdiene som gjenstår >80 % av den likevektige isometriske kraften, bør brukes til å vurdere om preparatet er skadet og bør utelukkes.
En annen begrensning eller vurdering påvirker hvilke eksperimentelle spørsmål som kan besvares av metoden. For eksempel, vurder bruk av 2,3-butandionmonoksim (BDM) i perfusjonsløsningen. BDM er en fosfatase, som kan endre funksjonen av muskelen. I tillegg betyr den lange perioden med lossing og mangel på pacing at den latente fosforyleringstilstanden sannsynligvis har endret seg. Derfor bør forsiktighet utvises hvis man prøver å direkte vurdere muskelkontraktiliteten til et dyr (vs. forskjeller mellom genotyper eller behandlinger), da kontraktiltilstanden sannsynligvis har endret seg. Virkningen av fosforylering kan imidlertid vurderes farmakologisk ved å legge til en agonist eller antagonist av banen.
Oppsummert gir MCR innsikt i hvordan avspenning reguleres av muskelbevegelser (belastningshastighet). MCR kan bidra til å gi bedre innsikt i diagnostisering og overvåking av diastolisk sykdom, sammen med mål for farmakologisk intervensjon, for eksempel modifisering av myosinkinetikk. Protokollen og rådene som er skissert her, beskriver kunnskap utviklet over flere års studier, og bør gjelde for andre systemer og modeller for hjertesykdom.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av National Institutes of Health (1R01HL151738) og American Heart Association (18TPA34170169).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 or 16 gauge blunted needle/canula | for cannulation of rat aorta, use 1mm of PE160 or PE205 tubing as stop | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime | Sigma-Aldrich | B0753-25G | |
| 23 gauge blunted needle/canula | for cannulation of mouse aorta, use 1mm of PE50 tubing as stop | ||
| 5 mL syringe | BD Luer-Lock | 309646 | |
| 95% Oxygen/5% CO2 | AirGas | Z02OX9522000043 | |
| Anethesia system | EZ Systems | EZ-SA800 | Can use any appropriate anethesia method/system |
| Bovine Serum Albumin | Fisher BioReagents | BP-1600 | to coat tips of fine forcepts, scissors |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Containers/dissection dishes | FisherBrand | 08-732-113 | Weigh dishes for creating dissection plates |
| Crile Hemostat | Fine Science Tools | 13005-14 | for mouse gross dissection |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Data acquisition software | SLControl | ||
| Data acquisition system | MicrostarLabs | DAP5216a | Can use any DAQ. This is a PCI based data acqusition for use with SLControl; must have a PC with a PCI slot |
| Data analysis software | Mathworks | Matlab | Custom Script |
| Dumont #3 Forceps | Fine Science Tools | 11231-30 | 2x for cannulation of aorta |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | 2x for trabecula isolation |
| Experimental system | Aurora Scientific | 801C | Can use any appropriate experimental chamber with force and length control |
| Fine Scissors, curved | Fine Science Tools | 14061-09 | for removal of heart |
| Gooseneck Piggyback Illuminator | AmScope | LED-6WA | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| Imaging software | IrfanView | ||
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15915 | for removal of heart |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670-100G | |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Mayo Scissors | Fine Science Tools | 14110-15 | for rat gross dissection |
| Metzenbaum Scissors | Fine Science Tools | 14116-14 | for mouse gross dissection |
| Microscope connected camera | Flir | BFS-U3-27S5M-C | Includes acquisition software |
| Microscope/digital imaging system | Olympus | IX-73 | Can use any appropriate microscope. Needed to measure muscle length, cross sectional area |
| Mounting Pin/Needle | BD PrecisionGlide | 305136 | For holding heart to dish. 27 G x 1-1/4 |
| Mounting Pin/Needle | Fine Science Tools | 26000-40 | For holding heart to dish. 0.4mm diameter insect pin (Alt to 27G needle) |
| Oxygen (O2) | AirGas | OX USP300 | |
| Peristaltic Pump | Rainin | Rabbit | Can be any means to create flow in experimental chamber |
| pH and Oxygen sensor | Mettler Toledo | SevenGo pH and DO | |
| Potassium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 237205-100G | |
| Potassium Chloride | Fisher Chemical | P217-500 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | 795488-500G | |
| Rochester-pean Hemostat | World Precision Instruments | 501708 | for rat gross dissection |
| Silk Suture, Size: 4/0 | Fine Science Tools | 18020-40 | cut to ~1.5 inch pieces, soaked in water |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1KG | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | S7907-100G | |
| Stereomicroscope | AmScope | SM-1TX | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | for opening of the RV |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 3097358-1004 | For creating dissection plates |
| Syringe Holder | Harbor Frieght | Helping Hands 60501 | Can be used as alternate for ring stand |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625-1KG | |
| Transfer Pipette | FisherBrand | 13-711-7M | cut ~1" from tip to widen bore |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | for trabecula isolation |
References
- Iribe, G., Helmes, M., Kohl, P. Force-length relations in isolated intact cardiomyocytes subjected to dynamic changes in mechanical load. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 292 (3), 1487-1497 (2007).
- Dowrick, J. M., et al. Work-loop contractions reveal that the afterload-dependent time course of cardiac Ca(2+) transients is modulated by preload. Journal of Applied Physiology. 133 (3), 663-675 (2022).
- ter Keurs, H. E., Rijnsburger, W. H., van Heuningen, R., Nagelsmit, M. J. Tension development and sarcomere length in rat cardiac trabeculae. Evidence of length-dependent activation. Circulation Research. 46 (5), 703-714 (1980).
- Sonnenblick, E. H. Force-velocity relations in mammalian heart muscle. The American Journal of Physiology. 202, 931-939 (1962).
- Brutsaert, D. L., Rademakers, F. E., Sys, S. U. Triple control of relaxation: implications in cardiac disease. Circulation. 69 (1), 190-196 (1984).
- Taberner, A. J., Han, J. C., Loiselle, D. S., Nielsen, P. M. F. An innovative work-loop calorimeter for in vitro measurement of the mechanics and energetics of working cardiac trabeculae. Journal of Applied Physiology. 111 (6), 1798-1803 (2011).
- De Tombe, P. P., Little, W. C. Inotropic effects of ejection are myocardial properties. Am J Physiol. 266, 1202-1213 (1994).
- Chung, C. S., Hoopes, C. W., Campbell, K. S. Myocardial relaxation is accelerated by fast stretch, not reduced afterload. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 103, 65-73 (2017).
- Schick, B. M., et al. Reduced preload increases Mechanical Control (strain-rate dependence) of Relaxation by modifying myosin kinetics. Archives of Biochemistry and Biophysics. 707, 108909 (2021).
- Parikh, S. S., Zou, S. Z., Tung, L. Contraction and relaxation of isolated cardiac myocytes of the frog under varying mechanical loads. Circulation Research. 72 (2), 297-311 (1993).
- Dowrick, J. M., et al. Simultaneous brightfield, fluorescence, and optical coherence tomographic imaging of contracting cardiac trabeculae ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (176), e62799 (2021).
- Wiggers, C. J. Studies on the consecutive phases of the cardiac cycle I. The duration of the consecutive phases of the cardiac cycle and the criteria for their precise determination. American Journal of Physiology-Legacy Content. 56 (3), 415-438 (1921).
- Rosen, B. D., et al. Late systolic onset of regional LV relaxation demonstrated in three-dimensional space by MRI tissue tagging. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1740-1746 (2004).
- Saito, M., et al. The differences in left ventricular torsional behavior between patients with hypertrophic cardiomyopathy and hypertensive heart disease. International Journal of Cardiology. 150 (3), 301-306 (2011).
- Monasky, M. M., Biesiadecki, B. J., Janssen, P. M. L. Increased phosphorylation of tropomyosin, troponin I, and myosin light chain-2 after stretch in rabbit ventricular myocardium under physiological conditions. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (5), 1023-1028 (2010).
- Raff, G. L., Glantz, S. A. Volume loading slows left ventricular isovolumic relaxation rate. Evidence of load-dependent relaxation in the intact dog heart. Circulation Research. 48, 813-824 (1981).
- Matsubara, H., Takaki, M., Yasuhara, S., Araki, J., Suga, H. Logistic time constant of isovolumic relaxation pressure-time curve in the canine left ventricle. Better alternative to exponential time constant. Circulation. 92 (8), 2318-2326 (1995).
- Chung, C. S., Kovacs, S. J. Physical determinants of left ventricular isovolumic pressure decline: model prediction with in vivo validation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1589-1596 (2008).
- Campbell, K. B., Kirkpatrick, R. D., Tobias, A. H., Taheri, H., Shroff, S. G. Series coupled non-contractile elements are functionally unimportant in the isolated heart. Cardiovascular Research. 28 (2), 242-251 (1994).
- Raman, S., Kelley, M. A., Janssen, P. M. Effect of muscle dimensions on trabecular contractile performance under physiological conditions. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 451 (5), 625-630 (2006).
- Czeiszperger, T. L., Wang, M. P., Chung, C. S. Membrane stabilizer Poloxamer 188 improves yield of primary isolated rat cardiomyocytes without impairing function. Physiol Rep. 8 (4), 14382 (2020).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Loiselle, D. S., Johnston, C. M., Han, J. C., Nielsen, P. M. F., Taberner, A. J. Muscle heat: a window into the thermodynamics of a molecular machine. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 310 (3), 311-325 (2016).
- de Tombe, P. P., ter Keurs, H. E. Force and velocity of sarcomere shortening in trabeculae from rat heart. Effects of temperature. Circulation Research. 66 (5), 1239-1254 (1990).
- Palmer, B. M., Bell, S. P. Preparing excitable cardiac papillary muscle and cardiac slices for functional analyses. Frontiers in Physiology. 13, 817205 (2022).
- Brunello, E., et al. Myosin filament-based regulation of the dynamics of contraction in heart muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (14), 8177-8186 (2020).
