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Biology

Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules

Published: March 3, 2023 doi: 10.3791/64903
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Biomedical Sciences, University of Illinois College of Medicine Rockford, 2Department of Health Sciences Education, University of Illinois College of Medicine Rockford

Summary

La méthodologie aide à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules. Différentes méthodologies peuvent être adoptées en fonction du niveau de cytotoxicité du matériau d’intérêt. En outre, une description de l’analyse de l’image est fournie pour aider à l’analyse des fibres d’ADN.

Abstract

L’exposition aux nanomatériaux peut provoquer un stress de réplication et une instabilité génomique dans les cellules. Le degré d’instabilité dépend de la chimie, de la taille et de la concentration des nanomatériaux, du temps d’exposition et du type de cellule exposée. Plusieurs méthodes établies ont été utilisées pour élucider l’impact des agents endogènes/exogènes sur la réplication mondiale. Cependant, les tests au niveau du réplicon, tels que le test de la fibre d’ADN, sont essentiels pour comprendre comment ces agents influencent l’initiation de la réplication, les terminaisons et la progression de la fourche de réplication. Savoir cela permet de mieux comprendre comment les nanomatériaux augmentent les risques de fixation des mutations et d’instabilité génomique. Nous avons utilisé des macrophages RAW 264.7 comme cellules modèles pour étudier la dynamique de réplication sous exposition à des nanoparticules d’oxyde de graphène. Ici, nous démontrons le protocole de base pour le test des fibres d’ADN, qui comprend le marquage par impulsions avec des analogues nucléotidiques, la lyse cellulaire, l’étalement des fibres d’ADN marquées par impulsions sur des lames, l’immunomarquage fluorescent des analogues nucléotidiques dans les fibres d’ADN, l’imagerie des intermédiaires de réplication dans les fibres d’ADN à l’aide de la microscopie confocale et l’analyse intermédiaire de réplication à l’aide d’un logiciel de notation et d’analyse assisté par ordinateur (CASA).

Introduction

Au cours de chaque cycle cellulaire, la réplication de l’ADN assure une duplication précise du génome1. La réplication chromosomique eucaryote dépend essentiellement de trois facteurs: le moment du déclenchement de plusieurs origines de réplication, la vitesse des fourches qui émergent des origines déclenchées et la fin du processus de réplication lorsque deux fourches de réplication d’origines adjacentes se rencontrent2. Pour la transmission haute fidélité de l’information génétique aux cellules filles, ainsi que pour la préservation de l’intégrité génétique, une réplication précise de l’ADN est cruciale. Les agents qui se développent à partir d’un métabolisme régulier ou qui sont dus à des matériaux environnementaux artificiels ou naturels attaquent constamment le génome. Ces agents endogènes et exogènes provoquent le ralentissement ou l’arrêt des fourches de réplication en raison de dommages à l’ADN causés par ces agents, et les fourches ralentissant ou s’arrêtant temporairement en réponse à ces difficultés sont appelées stress de réplication3. En réponse au stress de réplication, les cellules ont développé plusieurs voies moléculaires qui maintiennent la stabilité des fourches de réplication perturbées et leur permettent de redémarrer4. En termes de stabilité génétique, de survie cellulaire et de maladie humaine, ces mécanismes de réponse au stress de réplication sont apparus comme les facteurs clés pour maintenir un génome sain, assurer la survie des cellules et réduire la probabilité de formation de la maladie5.

L’un des agents exogènes capables de produire un stress de réplication est les nanoparticules. Les nanoparticules sont des particules dont la taille varie de 1 nm à 100 nm6. En raison de leurs surfaces élevées, de leurs formes distinctives et de leurs propriétés chimiques uniques, les nanoparticules sont utilisées dans diverses applications médicales, pharmaceutiques, environnementales et industrielles 7,8. Bien que les nanoparticules aient de nombreux avantages potentiels, certaines d’entre elles (en raison de leur nature héréditaire ou de leur longévité) peuvent devenir toxiques. Des nanoparticules peuvent également se former en raison de l’usure naturelle des implants médicaux et être libérées dans la région péri-prothétique 9,10.

En raison de l’exposition des humains à une myriade de nanoparticules produites pour diverses applications, la recherche dans le domaine de la toxicité des nanoparticules a considérablement augmenté au cours des 10 dernières années11. Bien que ces efforts de recherche aient révélé une abondance d’informations sur la menace potentielle que représentent les nanoparticules pour la santé humaine, les connaissances sur le potentiel de génotoxicité des nanoparticules sont encore limitées. Ce qui a été découvert jusqu’à présent, c’est que ces nanoparticules peuvent interagir physiquement avec l’ADN, favoriser les dommages à l’ADN et endommager ou interférer avec les protéines responsables de la réparation ou de la réplication de l’ADN12. Pour détecter comment ils interfèrent avec la réplication de l’ADN, le peignage des fibres d’ADN, la synthèse d’ADN radiorésistante (RDS) et l’analyse des fibres d’ADN sont généralement utilisés13,14,15,16.

La méthode de peignage des fibres d’ADN est flexible et donne des informations sur la dynamique de la fourche de réplication au niveau de la molécule unique17. En substance, une lamelle de couverture salinisée est délicatement retirée de la solution d’ADN une fois que l’ADN se lie à elle. Les molécules d’ADN sont redressées et alignées par le ménisque de la solution. L’homogénéité, l’espacement et l’alignement des fibres d’ADN permettent des mesures précises et fiables de la longueur des faisceaux de fibres. En ajustant la durée et la séquence des traitements et des médicaments utilisés pour causer du stress ou des dommages, de nombreux aspects de l’avancement de la fourchette peuvent être surveillés à l’aide de cette application. Dans cette méthode, un système de double étiquetage est utilisé, grâce auquel la vitesse et la progression de la fourche de réplication sont évaluées17,18. D’autre part, l’électrophorèse sur gel 2D tire parti du fait que, dans l’électrophorèse sur gel d’agarose, les structures d’ADN ramifiées se déplacent plus lentement que les molécules d’ADN linéaires de même masse, ce qui permet la séparation nette des deux dans un cycle 2D. En fait, cette méthode est étudiée pour séparer les molécules d’ADN en fonction de leur masse lors de la première exécution et en fonction de leur forme lors de la deuxième exécution orthogonale. Après la fragmentation de l’ADN génomique, les intermédiaires de réplication et de recombinaison peu communs développent une forme ramifiée, et ils peuvent être distingués des molécules linéaires plus courantes dans le gel 2D19.

La méthode RDS est utilisée pour déterminer comment la synthèse globale de l’ADN est affectée. Dans cette méthode, le degré d’inhibition de la réplication globale est déterminé en comparant la quantité de nucléotides marqués radioactivement incorporés, tels que la thymidine [14C], dans les cellules non traitées par rapport aux cellules traitées14,20. La différence en pourcentage de radiomarquage entre les cellules non traitées et traitées représente la mesure dans laquelle l’agent endommageant l’ADN affecte la synthèse de l’ADN. De même, une autre méthode utilise la capacité des cellules à intégrer des analogues nucléotidiques comme BrdU (5-bromo-2′-désoxyuridine) pour la cytométrie en flux afin de mesurer les taux globaux de synthèse de l’ADN21,22. Bien que ces méthodes démontrent comment les agents endommageant l’ADN ont un impact sur la synthèse globale de l’ADN, elles ne montrent pas comment les réplicons individuels sont affectés. En effet, les tests au niveau du réplicon sont impératifs pour mieux comprendre l’initiation et l’étendue de l’instabilité génomique en cas d’exposition à des particules toxiques (nanomatériaux). L’autoradiographie sur fibre d’ADN et la microscopie électronique sont quelques méthodes utilisées pour déterminer ce23,24,25,26.

Les concepts de bulles de réplication et de réplication bidirectionnelle à partir de sources inégalement espacées ont d’abord été développés à l’aide de tests à molécule unique comme la microscopie électronique et l’autoradiographie sur fibre d’ADN27,28. L’observation directe des intermédiaires de réplication ramifiée sur des molécules spécifiques dispersées sur une grille recouverte de carbone est grandement facilitée par la microscopie électronique. Cette méthode, qui est encore utilisée aujourd’hui pour suivre les changements pathologiques aux fourches de réplication, a été utilisée pour localiser la première origine eucaryote de la réplication de l’ADN28. L’autoradiographie par fibre est centrée sur le concept de l’identification autoradiographique des zones nouvellement répliquées et le marquage des chromosomes avec la thymidine tritiée. La première évaluation quantitative des densités d’origine et des taux de fourche de réplication dans les séquences génomiques métazoaires a été rendue possible par l’autoradiographie des fibres d’ADN29.

Actuellement, les méthodes de fluorographie par fibre ont pris la place de l’autoradiographie, principalement parce que la fluorographie par fibre est beaucoup plus rapide que l’autoradiographie. Dans la fluorographie par fibres, deux dérivés nucléotidiques halogénés, tels que le bromo- (Br), le chloro- (Cl) ou l’iododésoxyuridine (IdU), sont incorporés séquentiellement dans l’ADN fraîchement répliqué, puis identifiés par immunofluorescence indirecte à l’aide d’anticorps30. L’observation microscopique de l’ADN naissant qui a incorporé l’un ou les deux analogues est rendue possible par immunomarquage de l’un des analogues dans une couleur et l’autre analogue dans une couleur différente (p. ex., immunomarquage de l’ADN naissant avec rouge IdU incorporé et vert CldU incorporé) (Figure 1)21. De nombreux types différents d’intermédiaires de réplication peuvent être identifiés par l’analyse des fibres d’ADN. Les plus couramment étudiés sont les fourches allongées individuelles, les initiations et les terminaisons. Les fourches allongées individuelles ont un motif de réplication de rouge suivi de vert (rouge-vert; Figure 2A). 13 Les longueurs de ces intermédiaires sont fréquemment utilisées pour mesurer la vitesse de la fourche (c.-à-d. la longueur de la fourche/temps d’impulsion) ou la dégradation exonucléolytique de l’ADN naissant par raccourcissement de la piste (figure 2E)30,31,32. Dans une étude de Mimitou et al., il a été constaté que lors d’une exposition à long terme à l’hydroxyurée, un poison de réplication qui provoque des cassures double brin dans l’ADN, RE11 a été recruté33. MRE11 est une exonucléase connue pour son activité exonucléase 3'-5', et elle est capable de couper les extrémités de l’ADN pour la réparation. Par conséquent, lorsqu’il est exposé à des agents toxiques, on peut observer une dégradation exonucléolytique de l’ADN naissant, qui est le raccourcissement du brin d’ADN dû à l’exposition à un agent endommageant l’ADN34.

Les ruptures de fourche de réplication provoquées par des obstructions physiques (complexes ADN-protéines ou lésions ADN), des obstacles chimiques ou des mutations peuvent arrêter la réplication et nécessiter une recombinaison homologue pour la redémarrer. C’est ce qu’on appelle la progression altérée de la fourche. De nombreuses études in vitro et in vivo ont indiqué que la transcription peut, à l’occasion, empêcher l’avancement de la fourchette de réplication de cette manière35.

Les initiations sont des origines de réplication qui initient et se déclenchent pendant la première ou la deuxième impulsion. Les origines qui se déclenchent lors de la première impulsion et ont des fourches de réplication qui continuent d’être actives ont un motif vert-rouge-vert (Figure 2B, ci-dessous). Les origines qui commencent au cours de la deuxième impulsion ont un motif vert seulement (Figure 2B, ci-dessus) et sont parfois appelées origines nouvellement initiées, de sorte que ces origines peuvent être différenciées de celles qui commencent pendant la première impulsion. La comparaison des pourcentages relatifs d’origines nouvellement déclenchées entre deux conditions expérimentales permet de comprendre comment une cellule répond à un agent endommageant l’ADN ou à la présence ou à l’absence d’une protéine. Les terminaisons sont créées lorsque deux fourches de réplication de réplicons adjacents fusionnent et qu’elles ont un motif rouge-vert-rouge (Figure 2D)30.

Sur la base des faits décrits ci-dessus, l’analyse des fibres d’ADN est actuellement considérée comme une méthode privilégiée pour étudier la variation de la dynamique de réplication de l’ADN causée par des agents toxiques tels que les nanomatériaux. Les chercheurs ont maintenant une bonne compréhension et connaissance de la dynamique de la réplication de l’ADN à l’échelle du génome chez les eucaryotes, à la fois quantitativement et qualitativement, grâce à la découverte de cette technologie36. Sur la base des variables de résultat, plusieurs méthodologies peuvent être adoptées. Quelques exemples de méthodes pour étudier les variations des dommages à l’ADN induits par des agents externes/nanoparticules sont présentés à la figure 3. L’objectif global de la méthode d’analyse des fibres d’ADN décrite dans cette étude est de déterminer comment les nanoparticules affectent le processus de réplication in vitro et comment elles affectent différentiellement divers tissus.

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Protocol

1. Préparation des anticorps et du tampon

  1. Préparer la solution d’anticorps primaire, l’anti-BrdU de souris à une dilution de 1:300 dans du BSA à 5 % et l’anti-BrdU chez le rat à une dilution de 1:500 dans du BSA à 5 %.
  2. Préparer la solution d’anticorps secondaires, alexafluor 594 lapin anti-souris à une dilution de 1:300 dans 5% BSA et alexafluor 488 poulet anti-rat à une dilution de 1:500 dans 5% BSA.
  3. Préparer la solution d’anticorps tertiaires, alexafluor 594 chèvre anti-lapin à une dilution de 1:1 000 dans 5% BSA et alexafluor 488 chèvre anti-poulet à une dilution de 1:1 000 dans 5% BSA.
  4. Préparer 10 mL de tampon de lyse dans duddH2Oavec 2 mL de 1M Tris (pH 7,4), 1 mL de 0,5 M EDTA et 0,5 mL de SDS à 10 %.

2. Préparation pour le dosage des fibres

  1. Jour 1 : Culture cellulaire et traitement des nanomatériaux pour le dosage des fibres
    1. Plaquer RAW 264.5 macrophages cellules ou les cellules d’intérêt, de sorte que les cellules sont dans la phase logarithmique de leur croissance le jour de l’expérience. Pour les cellules RAW, ajouter 5 x 104 cellules/puits à des plaques de 24 puits pour chaque condition. Maintenir les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et 98% d’humidité. Le tableau 1 décrit les constituants des milieux utilisés. Permettre aux cellules de croître jusqu’à 75%-80% de confluence17,37.
    2. Une fois que les cellules ont atteint le niveau de confluence de 75% à 80%, retirez le milieu des plaques, prenez la moitié du milieu et réservez-le pour l’impulsion CldU (réserve CldU) et ajoutez 5 μL d’IdU à l’autre moitié à une concentration finale de 50 μM. Mélanger et ajouter le milieu contenant de l’IdU dans les plaques. Placez les cellules contenant de l’IdU dans l’incubateur pendant 20 min.
    3. Placer le milieu de réserve CldU à 37 °C pour le maintenir préchauffé. Ajouter CldU à ce milieu juste avant l’impulsion CldU.
    4. Après 20 min, aspirer le mélange IdU-milieu et laver doucement les cellules avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) en tournant doucement la plaque. Jetez le PBS.
    5. Traiter les cellules avec diverses concentrations de nanoparticules dans 500 μL du milieu, et incuber pendant encore 30 min. Pour cette étude, utilisez des nanoparticules d’oxyde de graphène traitées à une concentration de 25 μg/mL.
    6. Aspirer le mélange milieu de traitement et laver doucement les cellules avec 500 μL de PBS en tournant doucement la plaque. Jetez le PBS. Ajouter 5 μL de CldU (100 μM final
    7. concentration) dans le milieu de réserve CldU, et couvrir les cellules avec le milieu de réserve CldU. Placez les cellules dans l’incubateur pendant la durée de l’impulsion CldU pendant 20 min.
    8. Lavez les cellules avec du PBS, grattez ou trypsinisez pendant 3-4 minutes, puis ajoutez 5 ml de milieu dans la plaque et recueillez les cellules.
    9. Faire tourner à 264 x g pendant 4 min. Retirer le milieu et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de PBS glacé. Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’un dosage au bleu de trypan (comptage hémocytométrique), puis diluez les cellules à ~200-400 cellules / μL. Gardez la suspension cellulaire sur de la glace pendant le comptage cellulaire.
      REMARQUE : Si possible, limitez le temps pendant lequel les cellules restent sur la glace. Cela peut aider à obtenir un cordon de solution cellulaire le long du haut de la lame. S’ils sont gardés sur la glace, gardez-les pendant moins de 30 minutes.
  2. Jour 1 : Préparation des fibres d’ADN
    1. À l’aide d’un crayon, étiquetez les lames (lame de verre, 75 mm x 25 mm) avec la condition expérimentale et la date.
    2. Prenez 2 μL de cellules dans une pipette, tenez la pipette à un angle de ~45°, placez la pipette à environ 1 cm sous l’étiquette de la lame et déplacez la pipette horizontalement sur l’étiquette de la lame. Au fur et à mesure que la pipette se déplace sur la lame, relâchez un peu de la solution cellulaire à la fois. Créez plusieurs lignes de cellules sur chaque diapositive (étape critique).
      REMARQUE: Il devrait y avoir une ligne horizontale de suspension cellulaire à travers la glissière. Si la suspension cellulaire perle, ajoutez 5 à 10 μL de milieu cellulaire dans le récipient contenant la suspension cellulaire, car cela peut aider la solution à adhérer à la lame lors de l’application à nouveau.
    3. Laissez la solution avec les cellules s’évaporer jusqu’à ce que la solution semble collante et collante. À ce stade, un peu de liquide est associé aux cellules, mais pas beaucoup. Cette étape dure de 8 à 20 minutes et varie en fonction de la quantité d’humidité dans l’air.
      REMARQUE: Assurez-vous que toute la solution ne s’est pas évaporée, car cela rend très difficile l’obtention de fibres d’ADN droites et alignées car la plupart, sinon la totalité, de l’ADN sera collée ensemble et incapable de se séparer.
    4. Lorsque la solution est collante, recouvrir les cellules de 15 μL de tampon d’étalement (lyse) par ligne de cellules, en prenant soin de ne pas laisser l’embout de la pipette toucher la lame. Attendez 10 min. Inclinez la glissière à un angle de 25° et placez l’étiquette de la glissière horizontalement contre le bord d’un support de tube (la partie inférieure de l’étiquette doit s’aligner avec le bord du support de tube).
    5. Laissez sécher l’ADN à l’air libre pendant au moins 4 heures à partir du moment où les dernières lames ont été faites.
      NOTE: Une période de 4 h à 12 h est bonne pour le séchage. Cependant, ne les laissez pas sécher pendant la nuit. Si on le laisse sécher pendant la nuit, il y aura beaucoup d’ADN détendu, mais très peu de fibres d’ADN droites et alignées.
  3. Jour 1 : Fixation des fibres d’ADN et congélation
    1. Une fois les lames séchées, fixez-les avec du méthanol:acide acétique (3:1) en immergeant les lames pendant 2 min. Effectuez cette étape sous un capot et laissez les lames sécher pendant la nuit dans un endroit où l’exposition à la lumière est limitée, ou couvrez les lames avec une tente en papier d’aluminium.
  4. Jour 2
    1. Placez les lames dans un support de lames en verre. Placer les lames à −20 °C pendant un minimum de 24 h. Cette étape améliore la résolution ou la netteté de l’image.

3. Réalisation du test de fibre d’ADN

  1. Dénaturation de l’ADN
    1. Préparez une chambre humidifiée à l’aide de petites boîtes à pipettes avec couvercles. Remplissez à moitié les récipients d’eau et placez-les dans un bain-marie à 37 °C pendant au moins 1 h.
    2. Retirez les lames à −20 °C et décongelez-les pendant quelques secondes. Placez soigneusement les lames dans un pot Coplin contenant de l’eau désionisée (DI) afin que les surfaces enduites ne touchent pas les parois du pot. Incuber la lame pendant 20 s, puis verser soigneusement l’eau.
    3. Ajouter 2,5 M HCL au pot Coplin de sorte qu’il couvre toutes les lames. Attendez 80 min. Il s’agit d’une étape cruciale du protocole. Un changement dans l’heure peut changer le résultat de l’image.
    4. Lavez les lames 1x avec PBS plus Tween (PBS + 0,1% Tween [concentration finale]), puis 2x avec PBS pendant 3 min chacune à température ambiante (RT).
  2. Immunomarquage
    1. Conservez les lames dans la chambre humidifiée pour les étapes suivantes. Bloquez les lames dans 5% BSA dans PBS pendant 30 minutes à RT, et couvrez-les avec des lamelles de couverture, des lamelles de couverture faites d’un sac Western blot ou des feuilles de plastique transparentes.
    2. Après le blocage, retirez délicatement la lame, retirez la solution de blocage et épongez la lame sur une serviette en papier (appuyez sur la lame sur la serviette) pour enlever l’excès de solution de blocage.
    3. Ajouter 100 μL de la solution d’anticorps primaires le long de la lame. Ajoutez un nouveau couvercle en plastique et attendez 2 h. Lors de l’ajout de la lame, assurez-vous qu’aucune bulle ne se forme.
    4. Après 2 h, faire tomber la solution d’anticorps et rincer les lames dans un pot de Coplin rempli de PBS 2x à TA. Utilisez du PBS frais à chaque fois pour laver les lames.
    5. Bloquez à nouveau les lames en ajoutant 200 μL (trois à quatre gouttes) de BSA à 5% le long de chaque lame, et ajoutez une lamelle de couverture en plastique. Attendez 15 min.
    6. Enlevez la lame, faites tomber l’excès de BSA sur une serviette en papier et ajoutez 100 μL de la solution d’anticorps secondaires sur toute la longueur de la lame. Ajoutez un nouveau couvercle en plastique et attendez 1 h.
    7. Enlevez la lame, faites tomber l’excès de BSA sur une serviette en papier et lavez les lames 2x dans PBS à RT.
    8. Bloquez à nouveau les lames en ajoutant 200 μL (trois à quatre gouttes) de BSA à 5% le long de chaque lame, et ajoutez une lamelle de couverture en plastique. Attendez 15 min.
    9. Si nécessaire, retirez la lame, retirez l’excès de BSA sur une serviette en papier et ajoutez 100 μL de solution d’anticorps tertiaires sur toute la longueur de la lame. Ajoutez de nouveaux couvercles en plastique et attendez 30 min.
    10. Lavez les lames avec PBS 3x. Retirez l’excès de PBS et laissez-les sécher complètement.
    11. Une fois sec, ajoutez le support de montage et placez soigneusement des lamelles de verre (24 mm x 60 mm) sur le support de montage afin d’éviter les bulles. Renommez les diapositives et laissez-les dans l’obscurité pendant la nuit.

4. Acquisition d’images

  1. Visualisez les fibres d’ADN immunocolorées à l’aide d’un microscope immunofluorescent équipé d’une caméra, d’un objectif 60x et d’ensembles de filtres appropriés pour détecter les colorants alexafluor 488 et 594.
  2. Prenez des images pour l’analyse dans les régions où les fibres sont bien séparées et non enchevêtrées. Il est important de capturer des images dans différentes zones de la diapositive, car la prise d’images dans une seule partie de la diapositive peut ne pas fournir de données représentatives concernant tous les intermédiaires de réplication trouvés sur la diapositive.
  3. Si possible, obtenez des images de fibre de 20 régions différentes sur une diapositive. Utilisez un seul canal pour sélectionner les zones de prise d’images afin d’éviter les biais.

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Representative Results

Après avoir obtenu suffisamment d’images (de 20 à 100 images par condition), les intermédiaires de réplication doivent être identifiés, mesurés et comptés. Qu’il s’agisse d’analyser les fibres manuellement ou automatiquement via un programme38, il est nécessaire de définir clairement quelles caractéristiques une fibre doit avoir pour qu’elle soit comptée ou notée (ou non comptée ou mesurée)39. Par exemple, les questions suivantes peuvent être examinées. (1) Faut-il mesurer et compter uniquement les fibres avec une immunofluorescence de 100% dans toute la fibre, ou peuvent-elles contenir certaines régions sans immunofluorescence (par exemple, tous les intermédiaires de la figure 4Ai,ii,iii devraient-ils être analysés ou seulement un sous-ensemble d’entre eux?)? Si vous analysez des fibres avec perte de signal, quelle est la perte de signal maximale acceptable dans une fibre et quel est le nombre maximal de pixels continus dans la fibre qui peuvent être dépourvus de tout signal (par exemple, la figure 3Aiv serait-elle considérée comme un intermédiaire rouge-vert ou rouge uniquement ?)? (2) Quelles devraient être les largeurs / longueurs minimales et maximales de fibres? (3) Quel devrait être le rapport signal sur bruit (S:N) pour décider si l’on doit mesurer une fibre ou non (par exemple, combien de fibres doivent être choisies dans la figure 4B à analyser?)? (4) À quelle distance du bord de l’image une fibre doit-elle être avant de ne pas être comptée ou mesurée? (5) Si un signal fluorescent est jaune, compte-t-on cela comme rouge ou vert (par exemple, la partie jaune de l’intermédiaire de réplication de la figure 4C devrait-elle être comptée comme rouge ou verte?)? (6) Combien de temps un segment de couleur doit-il durer pour être compté comme un signal réel (par exemple, l’intermédiaire de réplication de la figure 4D est-il une piste verte uniquement, une piste verte-rouge-verte ou une piste vert-rouge?)? (7) Si vous utilisez un programme automatisé d’analyse de fibres, dans quelle mesure le programme est-il confiant dans la mesure / comptage qu’il vient d’effectuer? (8) Si les fibres sont analysées manuellement, dans quelle mesure l’analyse devrait-elle être cohérente dans le temps et entre les individus?

En règle générale, les paramètres utilisés pour l’analyse des fibres d’ADN sont les suivants:
Rapport signal sur bruit: 3 (l’intensité de la fibre est trois fois supérieure à l’intensité de fond)
Épaisseur de la fibre: ≤8 pixels de largeur
Taille minimale: rouge ou vert seulement et 10 pixels; pistes rouge-vert avec chaque segment ≥10 pixels; pistes rouge-vert-rouge ou vert-rouge-vert avec chaque segment ≥10 pixels.
Continuité du signal fluorescent: au moins 80% et aucun écart dans le signal supérieur à 6 pixels.
Confiance dans l’évaluation : les valeurs de confiance doivent être similaires les unes aux autres dans une image et entre les images.

En plus des paramètres mentionnés ci-dessus, un autre critère important est la sélection d’une fibre transparente qui ne chevauche pas d’autres fibres lors de l’imagerie et de l’analyse.

La figure 5A montre des images représentatives de l’ADN de macrophages de contrôle (figure 5Ai) et d’oxyde de graphène traité aux nanoparticules de graphène (figure 5Aii,iii). L’image montre une augmentation des pistes en lecture seule (terminaisons) et une diminution des origines nouvellement cuites dans les cellules traitées à l’oxyde de graphène par rapport au témoin (Figure 5C). Il est également important de tenir compte du nombre d’images et de la position de la diapositive à partir de laquelle les images sont prises. Comme le montre la figure 5Aiii,C, une variation dans le schéma des intermédiaires de réplication (une augmentation des nouvelles origines par rapport au contrôle) a été observée sur une région différente de la même condition. Même si quelques-unes de ces observations peuvent ne pas affecter le résultat global, il faut prendre soin d’imager la diapositive en incluant toutes les zones représentatives. Il serait idéal de diviser la surface totale de la diapositive en cinq à six régions et de prendre plusieurs images de chaque région (exemple: 10 images) pour trouver des données de fibre concluantes pour chaque diapositive. Il est idéal de sélectionner environ 500 intermédiaires (Figure 5B) à partir de plusieurs diapositives/conditions. Avec ces variations de réplication, la quantification intermédiaire à partir de l’analyse des fibres d’ADN peut être utilisée pour étudier la variation de la dynamique de réplication de l’ADN causée par les nanoparticules d’oxyde de graphène ou la génotoxicité d’autres nanomatériaux. Par conséquent, une compréhension qualitative et quantitative de la dynamique de la réplication de l’ADN à l’échelle du génome peut être obtenue grâce à cette nouvelle méthodologie par rapport à d’autres analyses mentionnées dans l’introduction.

Figure 1
Figure 1 : Dosage des fibres d’ADN. Représentation schématique du test avec un aperçu des principales étapes de l’analyse des fibres d’ADN. Échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Immunomarquage des intermédiaires de réplication de l’ADN. Représentation schématique de différents intermédiaires de réplication identifiés par un étiquetage d’impulsions séquentielles avec IdU (rouge) et CldU (vert). Échelle: 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Exposition aux nanoparticules. Différentes méthodologies pour étudier les variations des dommages à l’ADN induits par les nanoparticules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Caractéristiques des fibres d’ADN à noter. Exemples d’intermédiaires de réplication dans une image. A) Lacunes dans l’immunofluorescence; i) perte de signal d’immunofluorescence de 0 % dans l’intermédiaire de réplication; (ii) ~7% de perte de signal; iii) 50 % de perte de signal ; et (iv) >90 % de perte de signal. (B) Une région avec de nombreux intermédiaires de réplication qui se chevauchent (la flèche indique la région avec un chevauchement clair des fibres). (C) Une fibre d’ADN avec une région jaune. (D) Un intermédiaire de réplication ouvert à l’interprétation (la flèche indique les lacunes dans la fibre). Échelle: 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Analyse et interprétation des fibres d’ADN. (A) Images représentatives des fibres d’ADN provenant (i) de cellules de macrophages témoins et (ii,iii) de cellules de macrophages traitées avec des nanoparticules pendant 20 minutes à une concentration de 25 μg/mL. Les images ii et iii ont été prises à partir de différentes régions de la diapositive. (B) Analyse logicielle automatisée représentative des conditions de contrôle et de traitement par nanoparticules. Pour cette analyse, nous avons utilisé le programme automatisé de suivi et de mesure des fibres d’ADN développé par Wang et al.38. Les chiffres de la figure montrent le nombre de traces d’ADN analysées. (C) Représentation graphique de l’analyse logicielle des conditions de contrôle et de traitement par nanoparticules. NP représente les nanoparticules. Le pourcentage relatif de la population intermédiaire (par exemple, pour le rouge seulement) est calculé à partir du total des intermédiaires analysés. En comparant l’image 1 traitée par NP à l’image 2, il y a de grandes différences entre les deux images. Ainsi, il est important d’obtenir de nombreuses images tout au long de la diapositive pour comprendre comment une condition expérimentale affecte le processus de réplication. Abréviations : R = rouge; G = vert. Échelle : 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composition des médias
10% Sérum fœtal bovin
Solution de pénicilline-streptomycine à 1% (10000 unités/ml)
1% L Glutamine (200 mM)
Glycémie moyenne-élevée de Dulbecco Modified Eagle

Tableau 1 : Composition du milieu utilisée pour la culture de cellules de macrophages.

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Discussion

Nous discutons ici d’une méthode pour aider à l’analyse de la variation de la dynamique de réplication de l’ADN en présence de nanoparticules par le biais du test de la fibre d’ADN. Les principales étapes critiques impliquées dans l’essai standard sont décrites dans le protocole (étape 2.2.2 et étape 3.1.3). Il est toujours recommandé d’utiliser une zone avec une exposition limitée à la lumière zénithale et un flux d’air constant pour éviter les cassures d’ADN induites par la lumière dans les lames ainsi que pour améliorer la reproductibilité. Une attention particulière est requise sur la durée du séchage du lysat cellulaire sur les lames. Le séchage excessif aura un impact négatif sur la propagation des fibres. La deuxième étape critique est la dénaturation des fibres à l’aide d’une solution acide. La durée du lavage à l’acide doit être maintenue égale pour toutes les lames d’une même expérience. Le dépannage de ces deux étapes pour trouver des conditions optimales (temps de lyse, volume de lysat sur la lame, temps de séchage et temps de lavage à l’acide) est recommandé pour différents types de cellules et environnements de laboratoire.

Comme discuté dans la figure 3, la durée d’exposition des nanoparticules peut être modifiée pour la détermination quantitative de l’altération de la dynamique de réplication de l’ADN induite par les nanoparticules. Pour déterminer l’impact initial de la dynamique de réplication, une exposition à court terme telle que 1 min, 20 min ou 30 min avec différentes doses serait appropriée. La différence dans les schémas de réplication (comme le montre la figure 2) après une exposition à long terme des cellules aux nanomatériaux peut être déterminée en comparant les modèles d’exposition à l’IdU et à l’ICdU (20 min chacun) avant et après le traitement aux nanoparticules. Cette approche peut être utilisée pour déterminer le décrochage de la fourche, le ralentissement de la fourche et la différence de cuisson d’origine à différents moments d’exposition, ce qui peut être interprété comme les effets de l’exposition aiguë et chronique aux nanomatériaux39,40.

Il existe plusieurs techniques prometteuses pour détecter la variation de la réplication de l’ADN, telles que le peignage de l’ADN et la méthode RDS; cependant, par rapport à ces méthodes, le dosage des fibres d’ADN est pratique et rentable sans avoir besoin d’instruments coûteux pour l’analyse41. Les limites de cette méthode sont la durée expérimentale, le temps nécessaire pour prendre suffisamment d’images pour la quantification, ainsi que l’analyse logicielle. Cependant, cette approche appuiera certainement la recherche en nanotoxicologie pour déterminer l’instabilité génomique causée par les particules dans les lignées cellulaires, ainsi que dans différents échantillons de tissus et entre différentes espèces.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de la fondation Blazer, du programme de biotechnologie médicale des sciences biomédicales, UIC Rockford, et du Département de l’éducation en sciences de la santé, UIC Rockford. Les auteurs remercient Ananya Sangineni et James Bradley pour leurs contributions au projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well plate Fisher brand FB012929
Acetic Acid  Sigma Aldrich 695092
Alexa flour 594 goat anti-rabbit  Invitrogen A11037
Alexa fluor 488 chicken anti-rat   Invitrogen A21470
Alexa fluor 488 goat anti-chicken  Invitrogen A11039
Alexa fluor 594 rabbit anti-mouse  Invitrogen A11062
BSA Sigma Aldrich A2153
CldU Sigma Aldrich 50-90-8
Coverslips (22 x 50 mm) Fisher brand 12-545-EP
EDTA Fisher Scientific 15575020
Frosted Microscope Slides Fisher brand 12-550-11
Hydrochloric Acid Sigma Aldrich 320331
IdU  Sigma Aldrich 54-42-2
Methanol Fisher Scientific A454-4
Mouse Anti-BrdU  BD Biosciences 347580
Phosphate Buffer Saline Gibco 10010072
Rat anti-BrdU  Abcam BU1--75(ICR1)
Raw 264.5 macrophage cells  ATCC TIB-71
SDS Sigma Aldrich L3771
Silane-Prep slides Sigma Aldrich S4651-72EA 
Superfrost gold plus slides Fischer scientific 22-035813
Tris pH 7.4 Sigma Aldrich 77861
Tween 20 Sigma Aldrich P9416

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References

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Biologie numéro 193
Démonstration du test de fibre d’ADN pour étudier les dommages à l’ADN et la dynamique de réparation induits par les nanoparticules
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Patel, S., Chastain, P., Bijukumar, D. Demonstration of the DNA Fiber Assay for Investigating DNA Damage and Repair Dynamics Induced by Nanoparticles. J. Vis. Exp. (193), e64903, doi:10.3791/64903 (2023).

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