Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Lysindusert dielektroforese for å karakterisere den elektriske oppførselen til humane mesenkymale stamceller

Published: June 16, 2023 doi: 10.3791/64909
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1,2,3,4, 1,2,4
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

Summary

Her presenterer vi lysindusert dielektroforese som en etikettfri tilnærming for å karakterisere heterogene cellelinjer, spesielt humane mesenkymale stamceller (hMSCs). Dette papiret beskriver en protokoll for bruk og optimalisering av en mikrofluidisk enhet med et fotoledende lag for å karakterisere den elektriske oppførselen til hMSC uten å endre deres opprinnelige tilstand.

Abstract

Humane mesenkymale stamceller (hMSCs) tilbyr en pasientavledet cellekilde for å gjennomføre mekanistiske studier av sykdommer eller for flere terapeutiske anvendelser. Å forstå hMSC-egenskaper, som deres elektriske oppførsel i ulike modningsstadier, har blitt viktigere de siste årene. Dielektroforese (DEP) er en metode som kan manipulere celler i et ujevnt elektrisk felt, gjennom hvilket informasjon kan fås om cellens elektriske egenskaper, for eksempel cellemembrankapasitans og permittivitet. Tradisjonelle moduser av DEP bruker metallelektroder, for eksempel tredimensjonale elektroder, for å karakterisere responsen av celler til DEP. I dette papiret presenterer vi en mikrofluidisk enhet bygget med et fotoledende lag som er i stand til å manipulere celler gjennom lysprojeksjoner som fungerer som in situ virtuelle elektroder med lett konforme geometrier. Her presenteres en protokoll som demonstrerer dette fenomenet, kalt lysindusert DEP (LiDEP), for karakterisering av hMSC-er. Vi viser at LiDEP-induserte celleresponser, målt som cellehastigheter, kan optimaliseres ved å variere parametere som inngangsspenning, bølgelengdeområdene til lysprojeksjonene og intensiteten til lyskilden. I fremtiden ser vi for oss at denne plattformen kan bane vei for teknologier som er etikettfrie og utfører sanntidskarakterisering av heterogene populasjoner av hMSC eller andre stamcellelinjer.

Introduction

Humane mesenkymale stamceller (hMSCs) er anerkjent for sine immunsuppressive egenskaper1, noe som har ført til deres bruk i terapeutika for behandling av en rekke sykdommer, for eksempel type II diabetes2, graft versus host sykdom3 og leversykdom4. HMSCer er heterogene, og inneholder underpopulasjoner av celler som skiller seg ut i adipocytter, kondrocytter og osteoblaster. HMSC-er er avledet fra fettvev, navlestrengsvev og benmarg, og deres differensieringspotensial avhenger av opprinnelsesvevet og cellekulturprosessen som brukes5. For eksempel, ifølge en studie av Sakaguchi et al., er hMSCs avledet fra fettvev mer sannsynlig å differensiere til adipocytter, mens hMSCs avledet fra benmarg er mer sannsynlig å differensiere til osteocytter6. Imidlertid er virkningen av vevets opprinnelse til hMSCs på deres differensieringspotensial et fenomen som fortsatt må forstås nærmere. I tillegg bidrar de varierte differensieringspotensialene til hMSC til deres iboende heterogenitet og skaper utfordringer ved å anvende hMSC for terapeutika. Som sådan er karakterisering, samt sortering, av heterogene stamcellelinjer avgjørende for å utvikle in vitro og klinisk anvendelse av disse cellene. Flowcytometri, gullstandardteknikken for å undersøke forskjeller i cellulære fenotyper, bruker celleoverflateantigener og fluorescerende fargestoffer for å merke målceller og karakterisere dem basert på lysspredning eller cellespesifikke fluorescensegenskaper 6,7,8. Ulempene med denne metoden inkluderer den begrensede tilgjengeligheten av celleoverflateantigenbiomarkører, de høye kostnadene for utstyr og drift, og det faktum at celleoverflatefargingen potensielt kan skade cellemembranen og påvirke terapeutiske anvendelser 9,10,11. Derfor kan utforskning av nye teknikker for cellekarakterisering uten å kompromittere den opprinnelige tilstanden til den cellulære membranen være til nytte for den kliniske ytelsen til stamcellebehandlinger.

Dielektroforese (DEP), en metode for cellekarakterisering som ikke bruker overflateetiketter, er fokus for dette nåværende arbeidet. DEP er en etikettfri eller ikke-fargemetode implementert på mikrofluidiske plattformer for å karakterisere heterogene populasjoner av celler basert på deres elektriske egenskaper. DEP bruker et elektrisk felt med vekselstrøm (AC) til erstatning for fluorescensfarging (dvs. en etikettbasert metode)7. De andre fordelene ved å bruke DEP-baserte mikrofluidiske enheter for cellekarakterisering inkluderer bruk av små volumer (mikroliter), rask analysetid, minimal celleprøveprepareringskrav, minimal risiko for prøveforurensning, minimal avfallsproduksjon og lave kostnader12,13. En annen fordel med DEP er sanntidsovervåking av celler14,15,16. For DEP blir celler i suspensjon utsatt for et ujevnt AC-elektrisk felt opprettet med elektroder, og de blir polariserte6. Denne polarisasjonen forårsaker cellebevegelse og tillater cellemanipulering basert på frekvensen og spenningen til det påførte vekselstrømsfeltet. Ved å justere frekvensen, typisk mellom 5 kHz og 20 MHz, kan celler tiltrekkes eller frastøtes fra elektrodene, tilsvarende henholdsvis positiv og negativ DEP-oppførsel6.

Det er flere moduser for DEP-karakterisering, nemlig tradisjonell, feltstrømningsfraksjonering og lysindusert, som klassifisert etter deres elektrodekonfigurasjon og / eller driftsstrategi17. 3DEP-analysatoren, en tradisjonell modus for DEP, inneholder fysiske metallelektroder og overvåker celleresponsen på et elektrisk felt med vekselstrøm. Dette systemet bruker en brikke bestående av mikrobrønner med flere tredimensjonale sirkulære elektroder og oppdager endringer i lysintensiteter for å karakterisere celle DEP-oppførsel 18,19,20,21. Positiv DEP observeres når cellene beveger seg mot kantene på de sirkulære elektrodene langs mikrobrønnens vegger, noe som resulterer i økt lysintensitet i midten av mikrobrønnen. Negativ DEP observeres som celler som klynger seg i midten av mikrobrønnen vekk fra de sirkulære elektrodene, noe som resulterer i redusert lysintensitet i midten av mikrobrønnen. Disse to fenomenene er representert i figur 1. Tradisjonelle DEP-metoder har evnen til å karakterisere de elektriske egenskapene til heterogene cellepopulasjoner 18,20,21. For eksempel demonstrerte Mulhall et al. potensialet til å skille mellom normale orale keratinocytter (HOK) og maligne orale keratinocyttcellelinjer (H357) basert på forskjeller i membrankapasitans21 ved bruk av 3DEP-analysatoren. Imidlertid er en begrensning av tradisjonelle moduser av DEP den faste elektrodegeometrien. Siden hMSC er heterogene, er det fordelaktig å ha muligheten til enkelt å modifisere elektrodegeometriene under DEP-vurderinger. For eksempel, å kunne modifisere elektrodene eller elektrodearrayene i sanntid for enkeltcellefangst, gjør at cellene kan karakteriseres basert på hastighet og DEP-oppførsel. Anvendelsen av sanntids elektrodemodifisering i DEP-vurderinger av hMSC muliggjør enkeltcelleanalyse av hMSCer rett etter å ha hentet dem fra prøvevevet for å karakterisere heterogeniteten til prøvepopulasjonen.

For å overvinne begrensningen av tradisjonelle moduser av DEP (dvs. faste fysiske elektroder) og utforske nye muligheter for sanntids elektrodekonfigurasjonsmodifikasjoner ved hjelp av DEP-fenomenet, har lysindusert DEP (LiDEP) blitt utforsket. LiDEP er en ikke-tradisjonell modus for DEP som manipulerer celler ved hjelp av en fotoledende mikrofluidisk enhet22,23 via lysfremspring, lokaliserte elektroder skaper et ujevnt elektrisk felt, som ligner på den tradisjonelle DEP-metoden. Denne tilnærmingen gir også fleksibilitet i elektrodegeometrien og for å flytte elektrodene i den mikrofluidiske enheten. Dette reduserer begrensningen sett med faste elektroder og gir mulighet til å få mer informasjon om cellulær heterogenitet. LiDEP har blitt brukt til å oppdage og analysere forskjellige celletyper i homogene og heterogene populasjoner av celler22,23,24. For eksempel brukte Liao et al. LiDEP til å skille sirkulerende tumorceller (CTC) som uttrykker epitelcelleadhesjonsmodulen (EpCAMneg) fra røde blodlegemer for å utforske deres betydning i kreftmetastase22. Enkeltcelleanalyse med LiDEP har med hell blitt brukt til å karakterisere og manipulere kreftceller med stratifisering av bukspyttkjerteltumorgenisitet23 og analyse av CTC i prøver før og etter metastase24.

Her beskriver vi hvordan LiDEP kan brukes til å manipulere hMSCs med en rekke elektrodegeometrier (sirkel-, diamant-, stjerne- og parallelle linjer) og systeminnstillinger (anvendt spenning, lysintensitet og mikrofluidisk enhetsmateriale), og tilbyr dermed en tilnærming til å karakterisere oppførselen til menneskeavledede stamceller med virtuelle elektroder.

Protocol

1. LiDEP mikrofluidisk enhetsfabrikasjon

MERK: Fabrikasjonsprosessen består av å kombinere tre lagdelte komponenter: (i) et fotoledende lag med amorft silisium (A: Si) og molybden avsatt på et indiumtinnoksid (ITO) glasssubstrat; (ii) et mikrokanallag skåret ut fra dobbeltsidig tape; og (iii) et topp ITO-glasssubstrat med hull boret for innløpet og utløpet av cellesuspensjonen.

  1. Glassbelegg av fotoledende indiumtinnoksid (ITO)
    1. Rengjør det ITO-belagte glasssubstratet (15-20 Ω motstand) ved å strømme nitrogengass (N2) på overflaten med en strømningshastighet som er tilstrekkelig til å flytte synlige støvpartikler. Etter dette trinnet, skyll substratet med aceton.
    2. Overfør det ITO-belagte glassglasset til et isopropylalkoholbad for å vaske av acetonresten, skyll med DI-vann og strøm N2-gass igjen til underlaget er helt tørt.
    3. Plasser glasssliden med den ITO-belagte siden opp i vakuumforstøvningssystemet.
    4. Sputter et 10 nm tykt lag molybden på det ITO-belagte glasssubstratet (molybdenmålet) med en avsetningshastighet på 0,7 Å/s og en avsetningstid på 140 s.
    5. Legg en skyggemaske til den ene siden av glasssubstratet for å la 2 mm fra kanten av glasssubstratet være avdekket for elektriske tilkoblinger. Innskudd 1 μm A:Si ved bruk av induktivt koblet plasmaplasmaforsterket kjemisk dampavsetning (ICP-PECVD), som beskrevet i Medjdoub et al.25.
    6. Rengjør lysbildet med N2-gass for å fjerne støv og andre urenheter. For alle A:Si-avsetninger under skyggemasken, senk kanten ned til 2 mm-merket i en 25 % w/v kaliumhydroksidoppløsning for å etse A:Si.
  2. LiDEP chip enhet fabrikasjon
    1. For å danne mikrokanalen, oppnå dobbeltsidig tape (52 mm x 25 mm), og stansehull (diameter = 4 mm) 5-6 mm fra kanten av den kortere dimensjonen og sentrert mellom de lengre sidene av båndet. Bruk en skalpell til å skjære to rette linjer (3 mm fra hverandre) på tvers av hullene. Forsikre deg om at beskyttelsesarkene på begge sider av dobbeltsidig tape er på under hele mikrokanalens skjæretrinn.
    2. Bor to hull med en diameter på 3 mm i det øverste ITO-glassglasset. Båndet kan justeres på toppen av det ITO-belagte glasset, med den lange kanten av båndet på linje med glassets lange kant. Merk hullplasseringen med en vaskbar markør. Forsikre deg om at de borede hullene er på linje med hullene som er stanset i dobbeltsidig tape. Disse to hullene vil fungere som innløps- og utløpshullene til den mikrofluidiske enheten.
    3. Fjern den ene siden av beskyttelsesfilmen på dobbeltsidig tape, juster hullene i båndet og det øverste ITO-glassglasset, og trykk dem sammen. Trykk forsiktig for å fjerne luftlommer, spesielt i nærheten av mikrokanalen. Luftlommer kan tillate mediet eller andre løsninger å sive under båndet, noe som kan skade eller forårsake mugg i den mikrofluidiske enheten.
    4. Fjern den andre beskyttelsesfilmen fra dobbeltsidig tape, og trykk på molybden og A: Si-belagt ITO-glasssiden. Tilpass kanten av det fotoledende lysbildet som er motsatt av 2 mm klaringssiden til kanten av dobbeltsidig tape som er mot midten av det øverste ITO-glassglasset. Det vil være bakrus fra toppen ITO glass lysbilde og fotoledende materialbelagt ITO glass lysbilde.
    5. Trykk på en flat overflate for å sikre god vedheft. Et skjema over glasssubstratet og dobbeltsidige tapelag er illustrert i figur 1A. Klipp av overflødig tape på siden.
    6. Påfør kobbertape på kantene på lag A og lag C for å koble funksjonsgeneratoren. Gjør dette ved å pakke båndet på siden av ITO eller fotoledende materiale, avhengig av om det er lag A eller lag C, fra kanten av dobbeltsidig tape til ca. 3 cm på den ubelagte siden av glasssubstratet.
    7. For å sikre vellykket enhetsfabrikasjon, bruk et multimeter for å teste for motstandsavlesning mellom de belagte lysbildene av begge glassunderlag og kobberbåndet som var festet til glasset.
  3. Klargjøring av DEP-buffer
    1. Mål ut 4,25 g sukrose, og legg den i et 50 ml konisk rør. Deretter måler du opp 0,15 g glukose, og legger den i det samme 50 ml koniske røret.
    2. Fyll det koniske røret med 25 ml ultrarent vann, lukk lokket og bland. Når omtrent halvparten av sukrose og glukose er oppløst, fyll det koniske røret med ultrarent vann opp til 50 ml-linjen. Bland kraftig til all sukrose og glukose er oppløst. DEP bufferløsning inneholder 8,5 % (w/v) sukrose og 0,3 % (w/v) glukose.
    3. Oppnå 20 ml av den tilberedte sukrose- og glukoseoppløsningen, og legg den i et 50 ml konisk rør. Deretter måler du opp 0,1 g bovint serumalbumin (BSA) og plasserer det i det 50 ml koniske røret som inneholder sukrose og glukoseoppløsning. Vortex til BSA er oppløst. Den endelige DEP-bufferløsningen inneholder 0,5 % (w/v) BSA.
  4. Cell forberedelse
    1. Få minst 1 x 106 celler (hMSC eller HEK 293) suspendert i 1 ml vekstmedium ved bruk av cellekulturprotokollen beskrevet i tidligere studier26,27. Plasser cellesuspensjonen i et 10 ml sentrifugerør.
    2. Sentrifuger HEK 293-cellene ved 201 x g i 5 minutter og hMSC ved 290 x g i 10 minutter. Etter sentrifugering aspirerer supernatanten og resuspenderer cellene i 1 ml av DEP-bufferløsningen med 0,5 % BSA. Pass på at du ikke legger til bufferløsningen for raskt, fordi det kan dannes bobler.
    3. Gjenta sentrifugeringsprosessen to ganger til, og resuspender deretter cellene i DEP-bufferen med 0,5 % BSA for LiDEP-karakterisering. Cellepreparasjonsprotokollen som er oppført, er nok for 10 løp. For eksempel krever en frekvenstest minst 15 løp, og dermed må 2 ml celler i en konsentrasjon på 1 x 106 celler / ml gjøres.

2. LiDEP-karakterisering

  1. Eksperimentelt oppsett
    1. Sett sammen følgende utstyr for eksperimentelt oppsett for kvantifisering av cellulære responser på LiDEP: en bærbar PC, en projektor, en objektivlinse, et digitalt mikroskop og en funksjonsgenerator. Bruk den bærbare datamaskinen til å designe lysprojeksjonene (stjerne, diamant, tre linjer og oval), og koble den til projektoren.
    2. Bruk projektoren som lyskilde for å vise lysprojeksjonene på den fotoledende overflaten (lag C) på LiDEP-brikken. Sett den opp slik at lyset fra lyskilden (projektoren) beveger seg gjennom en 10x objektivlinse på mikrokanalområdet til LiDEP-brikken. 10x objektivlinsen sitter på toppen av projektorlinsen. Tilleggsfigur 1 viser integreringen av projektoren i LiDEP-systemet.
    3. Koble LiDEP-brikken til funksjonsgeneratoren for å påføre det elektriske vekselstrømsfeltet. Observer cellene som opplever LiDEP-kraften ved å bruke det digitale mikroskopet til bildebehandling og videoopptak. Figur 1B viser et skjema over forsøksapparatet. Følg standard cellekulturprotokoller26,27 for alle de testede cellene.
  2. Eksperimentelle prosedyrer
    1. Skyll mikrokanalen med 70% etanol, etterfulgt av 0,5% BSA-løsning. Skyll mikrokanalen igjen med 0,5% BSA-oppløsning to ganger til for å sikre at etanolen og tidligere celler er helt vasket bort. Celler som allerede har blitt eksponert for DEP-feltet, vil reagere annerledes enn ferske celler og kan forstyrre datainnsamlingen.
    2. Fjern 0,5 % BSA-oppløsningen med en pipette, og sett den mikrofluidiske enheten inn i enhetens holder.
    3. Fest alligatorklips til hver av kobberbåndtilkoblingene på enheten. Sett funksjonsgeneratoren til ønsket spenning (spenningstopp til topp, Vpp) og frekvens (Hz). Frekvensområdet som ble testet her var 30 kHz til 20 MHz.
    4. Tilsett 70 μL cellesuspensjon (celler + DEP-bufferløsning med 0,5% BSA) i enhetens mikrokanal. På grunn av mikrokanalens tynnhet (~0,05 mm) kan det oppstå søl ut av innløps- og utløpshullene. For å redusere mengden søl, bruk en mindre pipettespiss og vipp spissen litt i hullet mot mikrokanalen. Enhver tilgangsløsning (0,5 % BSA eller celler i oppløsning) kan tørkes bort med papirservietter til engangsbruk og kastes i biologisk farlig avfall.
    5. Projiser ønsket virtuell elektrodegeometri (her sirkler, diamanter, stjerner og/eller parallelle linjer) på LiDEP-brikken.
    6. I programvaren for digitalt mikroskop setter du videolengden til 3 min. Sett en laboratorietimer til 2 min 30 s. Når cellene er stasjonære i mikrokanalen til LiDEP-brikken, trykker du på Start i programvaren for digitalt mikroskop for å starte videoopptaksprosessen.
    7. Vent 10 s, trykk deretter på PÅ-knappen på funksjonsgeneratorkanalutgangen for å bruke det elektriske feltet, og trykk Start for timeren. Overvåk cellens DEP-oppførsel gjennom det digitale mikroskopet, og forhindre risting eller bevegelse rundt oppsettet.
    8. Når timeren går av, trykker du på PÅ-knappen på funksjonsgeneratorens kanalutgang. Dette slår av funksjonsgeneratorens kanalutgang, og det elektriske vekselstrømsfeltet tilføres ikke lenger gjennom elektrodene. Stopp videoopptaket på 3 min, og lagre på det digitale mikroskopet for fremtidig analyse.
    9. Pipetter cellene ut av utløpsenden av LiDEP-brikken ved sakte å skyve 60 μL DEP-buffer med 0,5 % BSA inn i mikrokanalen og samtidig samle ved utløpet. Fortsett til det er lite eller ingen celler i mikrokanalen.
    10. Gjenta trinn 2.2.3-2.2.9 til alle frekvensene er testet.

Representative Results

Spennings- og elektrodefargetester ble gjennomført ved hjelp av prosedyren ovenfor med en liten variasjon i trinn 2.2.3 og trinn 2.2.10. For spenningstesten forble elektrodens farge og frekvens konstant, og 5 V pp, 10 V pp og 20 Vpp ble påført. For elektrodefargetesten ble den påførte spenningen og frekvensen holdt konstant ved 30 kHz og 20 Vpp, og blå, rød, hvit og gul (referert til av HEX-fargekoder #4472C4, #FF0000, #FFFFFF og #FFFF00) projiserte elektroder ble undersøkt. Cellens levedyktighet ble undersøkt ved å fargelegge cellene med trypanblå og telle antall levende og døde celler ved hjelp av et hemocytometer.

Med LiDEP-oppsettet var vi i stand til å manipulere hMSCene og generere DEP-responskurver som svar på inngangsfrekvensen, som er en måte å karakterisere cellens elektriske oppførsel på. En rekke eksperimenter ble utført for å finne de optimale driftsforholdene ved å manipulere parametere som den påførte spenningen og den projiserte elektrodefargen (dvs. former med forskjellige farger opprettet med en grafisk redigeringsprogramvare) for å observere konsistent celleoppførsel til det ujevne vekselstrømsfeltet generert med de virtuelle elektrodene. Dataene som ble samlet inn for celleresponser ved hjelp av LiDEP, utradisjonell DEP, ble sammenlignet med resultater fra 3DEP-analysatoren, tradisjonell DEP.

Den første optimaliseringstesten fokuserte på den positive DEP-responsen til hMSC (dvs. cellene som beveger seg mot den virtuelle elektroden) i LiDEP-brikken. Cellene som ikke viste en positiv DEP-respons, viste enten en negativ DEP-respons ved å bevege seg bort fra den virtuelle elektroden, var stasjonære og roterende, eller reagerte ikke på det elektriske feltet. Responsen til cellene ble kvantifisert ved å spore deres hastigheter (μm / s) i ImageJ i løpet av en 2 min 30s periode. En gul oval projeksjon ble brukt til den virtuelle elektroden, og de påførte spenningene på 5 V pp, 10 V pp og 20 Vpp ble undersøkt ved en innstilt frekvens på 30 kHz. Vi fokuserte på celler som var innenfor 50 μm fra den virtuelle elektroden mens det elektriske feltet var på for konsistens og for å minimere uteliggere. 20 V pp resulterte i den raskeste cellebevegelsen av HEK 293-cellene, med en gjennomsnittlig hastighet på 0,035 μm / s, og dette ble etterfulgt av 0,032 μm / s ved 10 V pp og 0,020 μm / s ved 5 Vpp, noe som betyr at disse cellene representerer en relativt homogen kontroll. En lignende trend ble observert for hMSCs, som hadde en gjennomsnittlig hastighet på 0,051 μm/s ved 20 V pp, 0,036 μm/s ved 10 V pp og 0,025 μm/s ved 5 Vpp, som i figur 2A (her indikerer * p < 0,05). Ved 20 Vpp ble det observert at hMSCene opplevde positiv og negativ DEP samtidig. Dette ble ikke observert ved 10 V pp og 5 V pp. Levedyktighetsfunnene til hMSCene etter å ha opplevd DEP-kraften viste at høyere spenninger generelt resulterte i lavere cellelevedyktighet, med 66% av cellene levedyktige ved 5 V pp, 58% av cellene levedyktige ved 10 V pp, og 57% av cellene levedyktige ved 20 V pp, som i figur 2B (her indikerer ** p < 0,01).

På grunn av at LiDEP er et optisk basert system, er lysintensiteten og elektrodefargen parametere som enkelt kan justeres for å kontrollere ytelsen til LiDEP-brikken. Her ble forskjellige elektrodefarger (hvit, gul, rød og blå) generert basert på formen som ble projisert, evaluert for å bestemme effekten på cellenes DEP-responser. HEK 293 celler og hMSC ble evaluert ved 20 Vpp og 30 kHz. Hvite-, gul-, rød- og blåfargede elektroder ble valgt, men belysningen gjennom LiDEP-brikken ble påvirket av det fotoledende laget, som hadde en rød-oransje farge. Dermed virket den projiserte hvite elektroden gul med et hvitt interiør, den røde elektroden virket oransje med et rødt omriss, og den blå elektroden virket lysegrønn (figur 3A-D). Utgangseffekten for disse fire fargene var som følger: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW og 56,7 μW ± 0,9 μW for henholdsvis hvit, gul, rød og blå. Dette tyder sterkt på at gult og hvitt hadde det sterkeste DEP-feltet, mens blått og rødt var svakere, som i figur 3E (her indikerer *** p < 0,001 for HEK 293 celler og ** indikerer p < 0,01 for hMSCs). Stasjonær rotasjon av cellene på kantene av de gule og hvite virtuelle elektrodene under påføring av DEP-kraften ble også observert. For alle elektrodefargevariasjoner oppstod samtidige negative og positive DEP-responser, korrelert med det som ble vist ved 20 Vpp for spenningstesten. I tillegg, mens cellens hastighet varierte basert på elektrodefargen, reagerte nesten alle cellene innenfor 50 μm-grensen på LiDEP. Størrelsen på hMSCene ble målt til 19,2 μm ± 5,8 μm.

For å vurdere kapasiteten til LiDEP sammenlignet med DEP med konvensjonelle elektroder, vurderte vi forskjellene mellom DEP-oppførselen til celler som bruker LiDEP til celler analysert av 3DEP-analysatoren. DEP-responsen til hMSC ble målt i en DEP-bufferløsning med lav konduktivitet med 0,5 % BSA (~100 μS/cm). For å etterligne 3DEP-analysatoren ble en enkelt oval gul virtuell elektrode projisert ved 10 Vpp. DEP-oppførselen til hMSCene ble karakterisert fra 30 kHz til 20 MHz. Ved frekvenser lavere enn 25 kHz observerte vi elektrolyse, noe som resulterte i boblegenerering på overflaten av metalllaget i den mikrofluidiske enheten. For LiDEP, ved lavere frekvenser, opplevde hMSCene positiv DEP-kraft, som i figur 4A, representert som prosentandelen celler tiltrukket av den virtuelle elektroden. Cellene startet med en sterk positiv DEP-kraft, som svekket seg etter hvert som frekvensen økte. Cellene opplevde den sterkeste positive DEP-kraften fra 30 kHz til 97 kHz. Etter påføring av AC-elektrisk felt ved disse frekvensene, ble noen celler ikke reagerende, mens andre celler viste negativ DEP-oppførsel. Denne trenden avviker fra den observerte responsen kvantifisert ved hjelp av 3DEP-analysatoren. cellene økte i positiv DEP fra 37 kHz til 255 kHz og redusert i positiv DEP fra 1,772 kHz til 20 MHz, som i figur 4B.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelt oppsett for LiDEP-protokollen beskrevet her for hMSC-er. (A) Skjematisk og ekte bilde av LiDEP-brikken med det fotoledende laget og det eksperimentelle oppsettet. (B) Representative bilder av positive og negative DEP-responser av celler i 3DEP-analysatoren (ved bruk av konvensjonelle DEP-elektroder, øverst) og skjematisk representasjon av positive og negative DEP-responser av celler ved bruk av LiDEP (ved bruk av lysprojeksjoner som virtuelle elektroder, nederst). (C) Eksempler på forskjellige former som kan projiseres på enheten som virtuelle elektroder. Figur opprettet med BioRender.com. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Karakterisering av DEP-responsene (hastigheten) til hMSC og deres levedyktighet under de gitte forholdene. (A) De målte hastighetene til de positive DEP-responsene til hMSC på 5 V pp, 10 V pp og 20 V pp. hMSCene beveget seg ved 0,051 μm/s ved 20 V pp, 0,036 μm/s ved 10 V pp og 0,025 μm/s ved 5 Vpp. (B) Levedyktigheten til hMSCene etter å ha opplevd den positive DEP-kraften generert med virtuelle elektroder. Levedyktigheten var 57%, 58% og 66% for henholdsvis 20 V pp, 10 V pp og 5 Vpp. Feilfelt representerer standardavviket (SD). Statistisk analyse fullført på samlede datasett med t-tester (*p < 0,05 og **p < 0,01). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Sammenligning av DEP-respons mellom homogene (HEK 293) og heterogene (hMSCs) cellelinjer. Positiv DEP-respons fra hMSCs-celler på (A) hvite, (B) gule, (C) røde og (D) blå elektroder ved 20 Vpp og 30 kHz. (E) Hastighetsresponser fra HEK 293-celler og hMSCer til de forskjellige fargede elektrodene. HEK 293-cellene hadde de høyeste hastighetene med de gule og røde elektrodene på henholdsvis 0,035 μm/s og 0,033 μm/s. HEK 293-cellene hadde lavest hastighet med de blå elektrodene på 0,027 μm/s. HMSC-ene viste de høyeste hastighetene med de gule og hvite elektrodene på henholdsvis 0,068 μm / s og 0,049 μm / s. hMSCene opplevde den laveste hastigheten med de røde elektrodene på 0,039 μm / s. Feilfeltene representerer SD. Statistisk analyse fullført på samlede datasett med t-tester (*p < 0,05, **p < 0,01 og ***p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Sammenligning av DEP-responsene til hMSC ved bruk av LiDEP og 3DEP. DEP-responsene til hMSC målt med (A) LiDEP og (B) 3DEP-analysatoren ved 10 Vpp. Med LiDEP var det et forfall i den positive DEP-responsen til hMSCene fra 30 kHz til 20 MHz. Fra 3DEP-analysatoren økte cellene i positiv DEP fra 37 kHz til 255 kHz og sank i positiv DEP fra 1 772 kHz til 20 MHz. Feilfelt representerer SD. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur 1: Representative bilder av LiDEP-oppsettet som ble brukt for eksperimentene i denne protokollen. Innzoomet bilde av LiDEP-systemet som viser integreringen av projektoren. Lys beveger seg fra kilden (projektoren) gjennom en 10x objektivlinse på mikrokanalen til LiDEP-brikken. 10x-objektivet sitter på toppen av projektorlinsen. Hver komponent er nummerert på bildene og oppført på siden. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsvideo 1: Representativ video av hMSC-er som reagerer på de hvite, gule, røde og blå virtuelle elektrodene. Cellene visualiseres som opplever positiv DEP (beveger seg mot den virtuelle elektroden), opplever negativ DEP (beveger seg bort fra den virtuelle elektroden), stasjonær og roterende, eller reagerer ikke på det elektriske feltet. HMSC-ene ble testet ved 37 kHz og 20 Vpp, og videoen ble fremskyndet 20x. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Undersøkelse av heterogeniteten til hMSC er viktig for deres fremgang innen terapi. Dette arbeidet gir et første skritt for å bruke LiDEP som et analytisk verktøy for vurdering av hMSCs. Vi undersøkte spenningsavhengigheten av den positive DEP-responsen til celler i LiDEP ved å kvantifisere hastigheten. Det forventes at høyere spenninger skal gi sterkere positiv DEP-kraft, og vi observerte dette mønsteret med de målte hastighetene. 10 V pp og 20 Vpp spenningene var tilstrekkelig for manipulering av hMSC ved bruk av LiDEP. Lavere spenninger (dvs. 5 Vpp) resulterte i langsommere celleresponser; Selv om det ikke er optimalt for hMSC, kan dette være fordelaktig for andre celletyper. Det var en spenningsavhengig reduksjon i levedyktigheten til hMSCene på ca. 9 %. Dette skiller seg litt fra tidligere litteratur 6,12,28,29, hvor bruken av tradisjonell DEP og LiDEP i undersøkelsen av biologiske celler ikke reduserte cellens levedyktighet. Det eksperimentelle målet i hver studie varierte imidlertid. Glasser og Fuhr overvåket veksten av adherente L929 musefibroblaster på metallelektroder i cellekulturmedium28. Omvendt undersøkte Lu et al. levedyktigheten til nevrale stamceller utsatt for vekselstrøms elektriske felt i forskjellige tidsperioder12. Adams et al. karakteriserte de dielektriske egenskapene til hMSCs med metallelektroder12, og Li et al. manipulerte leukemiceller med LiDEP29. Forskjellen mellom disse studiene og vår var bruken av BSA, noe som kan være årsaken til reduksjonen i levedyktigheten vi observerte. Den lavere generelle levedyktigheten kan imidlertid også skyldes eksponeringstiden (2 min 30 s) som brukes i protokollen som er etablert her. Denne tiden ble valgt for å gi nok tid til å visualisere cellemanipulasjon under eksponering for det ujevne AC-elektriske feltet.

Metodene for cellekarakterisering ble testet via elektrodefargen for å bestemme egenskapene og begrensningene til vårt LiDEP-system bygget som beskrevet i protokollen. I denne spesifikke protokollen kan elektrodefargen styres basert på fargen på formen som projiseres gjennom en grafisk redigeringsfil. Vi brukte fire farger: hvit, gul, rød og blå. Fra utgangsavlesningene for hver farge ble de projiserte gule (#FFFF00) og hvite (#FFFFFF) elektrodene målt for å ha høyere intensiteter, noe som var grunnlaget for hvorfor disse fargene var gunstigere å bruke i de påfølgende forsøkene. I tillegg, på grunn av den etablerte lysintensitetsavhengigheten av fotoledende materialer30,31, tyder resultatene på at ytelsen til LiDEP-enheter er avhengig av fotoledende A: Si og kan justeres ved valg av den projiserte elektrodefargen. En kombinasjon av positive og negative DEP-responser av hMSC ble også observert ved bruk av LiDEP, som er som fenomenet sett i tradisjonelle DEP-metoder. Med hver elektrodefarge opplevde hMSCene negativ DEP-kraft, positiv DEP-kraft og cellerotasjon, noe som indikerer at celleprøven var heterogen ved en enkelt frekvens (tilleggsvideo 1). Dette stemmer overens med funnene til Adams et al.6 at hMSCs utviser både negativ og positiv DEP-oppførsel på en enkelt frekvens. Disse forholdene (elektrodefarge, elektrodeform og fotoledende materiale) kan gi ytterligere parametere for å oppdage nivået av heterogenitet i hMSC-prøver.

Til slutt ble resultatene av LiDEP-vurderingen sammenlignet med resultater fra 3DEP-analysatoren som en målestokk for hMSC DEP-oppførsel. En forskjell i frekvensområdet for den positive DEP-responsen til hMSC ble observert, men trendene i dataene samlet inn via LiDEP og 3DEP-analysatoren var generelt like (dvs. den positive DEP-responsen ble redusert med økt frekvens). Når det elektriske vekselstrømsfeltet ble levert til LiDEP-brikken og lys ble projisert på den, falt konduktansen i området innenfor lysprojeksjonen, noe som skapte et ujevnt elektrisk felt. Derfor påvirker egenskapene til lyskilden (dvs. intensitet og bølgelengde) den forventede responsen til cellene i LiDEP-brikken, sett fra resultatene av spennings- og elektrodefargevariasjonstestene. Andre parametere som kan modifiseres er materialet i det fotoledende laget og ledningsevnen til DEP-bufferløsningen. Som sådan må betingelsene som brukes til å evaluere DEP-oppførselen til celler, evalueres basert på oppsettet av LiDEP-systemet. Omvendt, for 3DEP-analysatoren, eller andre metoder som bruker metallelektroder til å påføre DEP-kraften, er elektrodeegenskapene konstante og kan ikke endres umiddelbart for å tilpasse seg det som trengs for cellene som undersøkes. Denne variasjonen av den positive DEP-oppførselen kan være gunstig for fremtidig forskning på karakterisering av forskjellige celletyper i hMSC-prøver, enkeltcelleanalyse eller cellesortering. I tillegg, når cellene beveger seg lenger bort fra de virtuelle elektrodene, blir det elektriske feltet svakere. Men med 3DEP-analysatoren, eller andre tradisjonelle DEP-moduser som bruker metallelektroder, kan et større elektrisk feltområde påføres, noe som gjør det mulig å manipulere flere celler. Derfor opplevde færre celler per LiDEP-eksperiment effekten av det elektriske vekselstrømsfeltet i mikrokanalen til LiDEP-brikken. Ytterligere avvik kan skyldes endringer i enhetens ytelse over tid (dvs. 2 timer eller 3 timer), som fortsatt undersøkes. Den konstante strømmen av vann, etanol og DEP-bufferløsning kan bryte ned overflaten av mikrokanallaget (dvs. det fotoledende materialet) og må vurderes. Enhetens ytelse over tid for cellekarakterisering må også vurderes for utvidet bruk av en LiDEP-brikke. Modifikasjoner av eksperimentelle parametere i sanntid tok bare noen få sekunder til minutter. Elektrodefargen og geometriene ble justert umiddelbart ved hjelp av innstillinger i grafisk redigeringsprogramvare.

Oppsummert demonstrerer denne artikkelen LiDEPs evner til å manipulere og karakterisere en cellelinje med heterogene cellepopulasjoner som hMSCs. Ved hjelp av dette oppsettet og den beskrevne protokollen var vi i stand til å oppnå vellykket karakterisering av hMSCer under forholdene 20 Vpp og projiserte virtuelle gule elektroder. Fremtidige studier bør fokusere på å justere eksponeringstiden til hMSCene til det elektriske feltet opprettet via LiDEP, øke lysintensiteten til de virtuelle elektrodene og vurdere forskjellige kilder til hMSC (eller andre stamcellepopulasjoner) for å utvikle en LiDEP-katalog over de elektriske signaturene til heterogene stamcellepopulasjoner.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation CAREER award (2048221) via CBET. Vi ønsker å anerkjenne Mo Kebaili fra UCI's Integrated Nanosystems Research Facility (INRF). I tillegg vil vi takke Dr. Devin Keck for å bistå med utviklingen av LiDEP-systemet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Gibco 25300054
10x objective AmScope ---
Amorphous silicon (A:Si) Millipore Sigma S5130
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240-062
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher BP9706-100
Copper Tape Zehhe BF4964
Dextrose (glucose) Fisher D16-1
Digital microscope Keyence VHX-7000
Double Sided Tape Insulectro FLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) Gibco 14190-144
Fetel Bovine Serum (FBS) Corning 35-011-CV
Function Generator Tektronix AFG 31102
Graphic editor software Microsoft Office Powerpoint ---
Indium tin oxidec coated glass slides MSE Supplied GL0333
L-Alanyl-L-Glutamine ATCC PCS-999-034
Laptop Dell Inspiron 14, 2-in-1
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium ATCC PCS-500-030
Mesenchymal Stem Cell Growth Kit for Umbilical and Adipose Cord-Derived MSCs ATCC PCS-500-040
Minimum Essential Mediaum Alpha (MEM a, 1X) Giblo A10490-01
Molybdenum, 99.95% Kurt J. Lesker EJTMOXX352A4 Sputtering target
Phenol Red Sigma P5530
Power Meter Thor Labs S130VC/PM400
Projector Vecupoi ---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Media Gibco 11875-093 This media has L-Glutamine and Phenol Red.
Sucrose Fisher BP220-1
Trypan Blue Stain Gibco 15250-061 0.40%
Trypsin Neutralizer Gibco R002100
Vacuum Sputtering System Denton DV-502M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
  2. Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
  3. Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
  4. Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
  5. Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
  6. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  7. Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
  8. Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
  9. González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
  10. Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
  11. Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
  12. Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
  13. Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B. Stem cells in microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (1), (2011).
  14. Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982 (2020).
  15. Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
  16. Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
  17. Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
  18. Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153 (2019).
  19. Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
  20. Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
  21. Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
  22. Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563 (2018).
  23. McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
  24. Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
  25. Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
  26. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
  27. 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
  28. Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
  29. Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102 (2022).
  30. Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
  31. Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).

Tags

Denne måneden i JoVE utgave 196 elektrokinetikk mikrofluidikk stamceller virtuelle elektroder cellekarakterisering
Lysindusert dielektroforese for å karakterisere den elektriske oppførselen til humane mesenkymale stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lacy, K. L., Salib, S., Tran, M.,… More

Lacy, K. L., Salib, S., Tran, M., Tsai, T., Valentine, R., Ardoña, H. A. M., Adams, T. N. G. Light-Induced Dielectrophoresis for Characterizing the Electrical Behavior of Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (196), e64909, doi:10.3791/64909 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter