Summary
Vi præsenterer en grafenarray-baseret hjernekortlægningsprocedure for at reducere invasiviteten og forbedre den rumlige tidsmæssige opløsning. Graphene array-baserede overfladeelektroder udviser langsigtet biokompatibilitet, mekanisk fleksibilitet og egnethed til hjernekortlægning i en indviklet hjerne. Denne protokol giver mulighed for at konstruere flere former for sensoriske kort samtidigt og sekventielt.
Abstract
Kortikale kort repræsenterer den rumlige organisering af placeringsafhængige neurale reaktioner på sensorimotoriske stimuli i hjernebarken, hvilket muliggør forudsigelse af fysiologisk relevant adfærd. Forskellige metoder, såsom penetrerende elektroder, elektroencefalografi, positronemissionstomografi, magnetoencefalografi og funktionel magnetisk resonansbilleddannelse, er blevet brugt til at opnå kortikale kort. Disse metoder er imidlertid begrænset af dårlig rumlig tidsmæssig opløsning, lavt signal-støj-forhold (SNR), høje omkostninger og ikke-biokompatibilitet eller forårsager fysisk skade på hjernen. Denne undersøgelse foreslår en grafenarray-baseret somatosensorisk kortlægningsmetode som et træk ved elektrokortikografi, der tilbyder overlegen biokompatibilitet, høj rumlig tidsmæssig opløsning, ønskelig SNR og minimeret vævsskade, der overvinder ulemperne ved tidligere metoder. Denne undersøgelse viste gennemførligheden af et grafenelektrodearray til somatosensorisk kortlægning i rotter. Den præsenterede protokol kan anvendes ikke kun på den somatosensoriske cortex, men også på andre cortices såsom den auditive, visuelle og motoriske cortex, hvilket giver avanceret teknologi til klinisk implementering.
Introduction
Et kortikalt kort er et sæt lokale pletter, der repræsenterer responsegenskaber til sensorimotoriske stimuli i hjernebarken. De er en rumlig dannelse af neurale netværk og muliggør forudsigelse for opfattelse og kognition. Derfor er kortikale kort nyttige til evaluering af neurale reaktioner på eksterne stimuli og behandling af sensorimotorisk information 1,2,3,4. Invasive og ikke-invasive metoder er tilgængelige til kortikal kortlægning. En af de mest almindelige invasive metoder involverer brugen af intrakortikale (eller gennemtrængende) elektroder til kortlægning af 5,6,7,8.
Vurdering af on-demand kortikale kort med høj opløsning ved hjælp af gennemtrængende elektroder har stået over for flere forhindringer. Metoden er for besværlig til at opnå et anstændigt kort og for invasiv til at implementere til klinisk brug, hvilket forbyder yderligere udvikling. Nyere teknologier som elektroencefalografi (EEG), positronemissionstomografi (PET), magnetoencefalografi (MEG) og funktionel magnetisk resonansbilleddannelse (fMRI) har vundet popularitet, fordi disse er mindre invasive og reproducerbare. Men i betragtning af deres uoverkommelige omkostninger og dårlige opløsning anvendes de i et begrænset antal tilfælde 9,10,11. For nylig har fleksible overfladeelektroder med overlegen signalpålidelighed tiltrukket stor opmærksomhed. Grafenbaserede overfladeelektroder demonstrerer langsigtet biokompatibilitet og mekanisk fleksibilitet, hvilket giver stabile optagelser i en indviklet hjerne 12,13,14,15,16. Vores gruppe har for nylig udviklet et grafenbaseret multikanalsystem til optagelse i høj opløsning og stedspecifik neurostimulering på den kortikale overflade. Denne teknologi giver os mulighed for at holde styr på de kortikale repræsentationer af sensorisk information i en længere periode.
Denne artikel beskriver de trin, der er involveret i at erhverve et hjernekort over den somatosensoriske cortex ved hjælp af et 30-kanals grafenmultielektrodearray. For at måle hjerneaktivitet placeres et grafenelektrodearray på cortexens subdurale område, mens forpoten, forbenet, bagpoten, bagbenet, bagagerummet og whiskers stimuleres med en træpind. De somatosensoriske fremkaldte potentialer (SEP'er) registreres for somatosensoriske områder. Denne protokol kan også anvendes på andre hjerneområder, såsom den auditive, visuelle og motoriske cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrehåndteringsprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Incheon National University (INU-ANIM-2017-08).
1. Dyreforberedelse til operation
BEMÆRK: Brug Sprague Dawley Rat (8-10 uger gammel) uden kønsbias til dette eksperiment.
- Bedøv rotten med 90 mg/kg ketamin og 10 mg/kg xylazincocktail intraperitonealt. For at opretholde den ønskede dybde af anæstesi under hele operationen skal du give en supplerende 45 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazincocktail, når rotten viser tegn på at vågne op.
- Bekræft, at rotten er under dyb anæstesi, og kontroller regelmæssigt kropsrefleksioner som tåklemme, haleklemme og hornhinderefleks.
- Barber pelsen mellem øjnene og bagsiden af ørerne ved hjælp af en trimmer.
- Påfør en oftalmisk salve på øjnene for at forhindre dem i at tørre ud.
2. Kirurgi for kortikal overfladeeksponering
- Fastgør rottehovedet på det stereotaksiske apparat med en stereotaksisk adapter. For at opretholde kropstemperaturen på 37 °C under operationen skal rotten placeres på en temperaturstyret varmepude.
- Steriliser det barberede område med skiftevis skrubber af alkohol og povidon-jod tre gange.
- Brug tang til at gribe fast i hovedbunden og injicer 0,1 ml lidokain (2%) med en sprøjte direkte i hovedbunden for at fremkalde lokalbedøvelse i operationsområdet.
- Lav et 2-3 cm langt midterlinjesnit med en skalpel og træk hovedbunden fra hinanden for at udsætte kraniet.
- Klem hovedbunden med mygtang for at udsætte kraniet.
- Skrab overfladen af kraniet med tang for at fjerne periosteum.
- Blunt dissekerer musklerne over det occipitale kranium for at udsætte cisterna magna over aksen på toppen af rygmarven.
- Skær cisterna magna med bladet for at dræne cerebrospinalvæsken og læg en steril gasbind inde i snittet af cisterna magna for konstant at absorbere cerebrospinalvæsken for at forhindre hjerneødem og minimere betændelse.
- Brug en blyant til at markere på kraniet et rektangulært vindue, der måler 3 mm i anteroposterior aksen og 6 mm i højre laterale retning fra bregma på højre halvkugle.
BEMÆRK: Mærkning skal sikre en afstand på 1 mm fra midterlinjen for at undgå overlegen sagittal sinusbrud. - Bor det markerede område i henhold til den stereotaksiske koordinat, og fjern kraniet med en knogleringur.
- For at fjerne dura mater skal du bøje spidsen af 26 G nålen til 90 °, skabe et hul i dura materen, løfte dura mater, indsætte tang i hullet og rive det med tang.
- Placer saltvandsbefugtet gasbind på den somatosensoriske cortex for at forhindre, at den tørrer ud.
3. Fremstilling af grafenelektrodearray, der er tilsluttet registreringssystemet
- Forbered et grafenelektrodearray med et omnetik stik.
- Fjern grafen-multielektrodearrayet uden at forårsage skade ved at påføre saltopløsningen.
- Fjern den ydre beklædning af reference- og jordledningerne fra stikket.
- Tilslut hovedscenen med grafenelektrodearrayet til stikket.
- Sæt interfacekablet, der er knyttet til hovedtrinnet, i optagesystemet.
- Fastgør grafenelektrodearraykomplekset i stereotaksarmen.
- For at fange neurale signaler fra alle kanaler skal du placere arrayet på den somatosensoriske cortex uden bøjning efter de forudbestemte stereotaksiske koordinater.
- Placer en referenceledning under vævet bag occipitalknoglen, og tilslut jordledningen til det jordede optiske bord.
4. Fysisk stimulering og registrering af SEP'er til kortlægning
- Åbn softwaren til optagelse af neurale signaler.
- Indstil optagelsessoftwaremiljøet: (1) Indstil samplingfrekvensen for SEP'er og hakfilter (60 eller 50 Hz, en frekvens af husholdnings elektrisk strøm) for at fjerne støj fra strømledningen.
- Til whisker kortlægning, bøj whisker med en fin pind.
- Stik konstant forpoten, forbenet, bagpoten, bagbenet og bagagerummet med en træpind til kropskortlægning.
- Optag neurale signaler i dataindsamlingssystemet i det angivne tidsrum.
5. Eutanasi af dyr
- Efter alle optagelsesprocedurer skal du ofre rotterne med anæstesi ved hjælp af >5% isofluran og udføre cervikal dissektion.
6. SEP-måling til kortikal kortlægning
- Åbn MATLAB med kodenavnet read_Intan_RHS2000_file.m til signalanalyse.
BEMÆRK: read_Intan_RHS2000_file.m kan downloades fra "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Klik på Kør knappen, vælg optagelsesfilen med filtypenavnet ".rhs", og vent på, at filen behandles og læses.
- Indtast kommandoen "plot (t, amplifier_data("kanalnummer",:))" for at oprette et 2D-linjeplot af optagelsesdataene, find SEP'erne og beregne amplituden af SEP'er i alle kanaler.
BEMÆRK: Indtast kanalnummeret ved "kanalnummer". For eksempel opretter "plot(t, amplifier_data(1,:))" kanal 1's 2D-linjeplot. Når eksperimentatoren beregner amplituden af responsen, skal du desuden vælge det respons, der er optaget fra hver kanal. - Hent data ved at farve gitteret med en anden nuance i henhold til amplituden af SEP'erne.
BEMÆRK: MATLAB-kommandoen "imagesc" hjælper med at få et topografisk kort hurtigere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver, hvordan et grafen multikanals array er monteret på hjernens overflade. Det somatosensoriske kort blev konstrueret ved at erhverve neurale reaktioner på fysiske stimuli og beregne amplituden af responsen. Figur 1 viser skemaet for dette eksperiment.
Figur 2A viser de strukturelle egenskaber ved et grafenelektrodearray. Der er gennemgående huller i substratet mellem elektroderne. Disse huller hjælper elektroden med at komme i kontakt med den kortikale overflade (figur 2B). Den stærke vedhæftning af elektroden til cortex hjælper med at registrere neurale signaler med mindre støj.
Figur 2C (venstre) viser de placeringsafhængige neurale reaktioner, der er erhvervet ved at stimulere knurhår, bagagerum, poter og lemmer kodet i forskellige farver. En rotte homunculus, rottens miniaturekrop, tegnes med det faktiske forhold mellem hver farvestørrelse på det somatosensoriske cortexkort (figur 2C, højre).
Figur 2D præsenterer stimuli-specifikke reaktioner med farver forbundet med hver kropsdel. Reaktionerne registreres gennem et grafenelektrodearray placeret på overfladen af cortex. Ved hjælp af de data, der er registreret fra grafenarrayet, beregnes amplituden af SEP'er for at opnå det amplitudeafhængige somatosensoriske kort.
Sensorisk stimulus-induceret lokale feltpotentialer muliggør konstruktion af det somatosensoriske kort. Responsstørrelsen på hver kropsstimulus udgør gnaver homunculus. Hver farve repræsenterer en anden kropsdel (figur 3).
Det erhvervede cortex-kort ved hjælp af denne protokol afslører de specifikke regioner inden for den somatosensoriske cortex, der reagerer på whiskers, forpoter, forben, bagpoter, bagben og trunker. Det giver indsigt i omfanget af involvering af det kortikale område i behandlingen af fysisk stimulusinformation for hver kropsdel.
Figur 1: Skematisk oversigt over eksperimentopsætningen. Det grafenbaserede elektrodearray er fastgjort til den somatosensoriske cortex, og whiskers eller andre kropsdele stimuleres ved blid berøring. Den tykke røde linje repræsenterer kablet, og de tynde røde og blå linjer repræsenterer jord- og referenceledningerne. Den sorte prik angiver bregma. Dataindsamlingssystemet er tilsluttet computeren via USB. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Grafenbaseret mikroelektrodearray til hjernekortlægning på den kortikale overflade . (A) Skematisk oversigt over det grafenbaserede elektrodearray. (B) Optisk billede af grafenelektrodearrayet på den kortikale overflade. C) Rottens auditive og somatosensoriske cortices. To kort over auditive og somatosensoriske områder, der reagerer på auditive stimuli med forskellige frekvenstoner og fysiske stimuli anvendt på hver kropsdel. (D) 30-kanals (undtagen reference- og jordelektroderne) optagelse af grafenelektrodearrayet på den kortikale overflade. Boksfarver korrelerer med de geografiske placeringer af den kortikale overflade. Tallene er tilpasset og modificeret fra Lee et al. (2021). 4Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Somatosensorisk kort. (A) Placering af neurale optagelser på tværs af kortikale lag (venstre). Et kortikalt overfladekort bestemt ved hjælp af et grafenelektrodearray. Et farvekodet somatosensorisk kort konstrueret ved hjælp af responsamplituderne og overlappede med homunculus (højre). (B) Registrerede kortikale SEP'er og kort, der følger stimuleringen af hver kropsdel. Denne figur er tilpasset og modificeret fra Lee et al. (2021). 4Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede protokol giver en dybdegående, trinvis proces, der forklarer, hvordan man får adgang til og kortlægger rotters somatosensoriske reaktioner ved hjælp af et grafenelektrodearray. De protokolerhvervede data er SEP'er, der giver somatosensorisk information, der er synaptisk knyttet til hver kropsdel.
Flere aspekter af denne protokol bør overvejes. Ved ekstraktion af cerebrospinalvæske for at forhindre hjerneødem og afbøde betændelse er det afgørende for eksperimentatoren ikke at beskadige hjernestammen placeret foran cisterna magna.
Ansigtsknurhår giver taktile sensoriske oplysninger om omgivelserne, såsom et mørkt og smalt miljø. Følgelig er gnaverknurhår veludviklede nok til at mærke et objekt gennem afbøjningsretningerne, stimulusintensiteten og placeringen af de stimulerede whiskers. Den somatosensoriske cortex reagerer forskelligt på bøjningsretningen, intensiteten og placeringen af hver whisker18,19. Derfor stimuleres alle whiskers med konstant intensitet og retning i denne protokol.
Denne protokol kan ikke registrere signaler fremkaldt i dybe hjernestrukturer, da vores grafenelektrodearray er monteret på den kortikale overflade. Således kan eksperimentatoren ikke identificere, hvordan det søjleformede netværk er hierarkisk organiseret vedrørende neurale reaktioner.
Denne protokol er bedre end tidligere optagelsesmetoder, fordi grafenelektrodearrayet er mindre invasivt, tilpasningsdygtigt og biokompatibelt 12,13,14,15,16. Desuden har grafenelektrodearrayet >30 kanaler til optagelse af signaler, hvilket muliggør hurtigere kortikal kortlægning end en enkelt- eller tetrodeelektrode. Denne protokol kan anvendes yderligere på andre kortikale områder, når det kræves15,20. Eksperimentatoren kan placere elektrodearrayet på den auditive eller visuelle cortex for at udtrække auditiv og visuel information som de auditive eller visuelle kort. Endelig kan denne metode implementeres til kronisk implantation og diagnose af neurale sygdomme, såsom slagtilfælde, epilepsi, tinnitus og Parkinsons sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Incheon National University (International Cooperative) for Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
