Summary
Nous présentons une procédure de cartographie cérébrale basée sur des réseaux de graphène pour réduire le caractère invasif et améliorer la résolution spatio-temporelle. Les électrodes de surface à base de graphène présentent une biocompatibilité à long terme, une flexibilité mécanique et une aptitude à la cartographie cérébrale dans un cerveau alambiqué. Ce protocole permet de construire plusieurs formes de cartes sensorielles simultanément et séquentiellement.
Abstract
Les cartes corticales représentent l’organisation spatiale des réponses neuronales dépendantes de l’emplacement aux stimuli sensorimoteurs dans le cortex cérébral, permettant la prédiction de comportements physiologiquement pertinents. Diverses méthodes, telles que les électrodes pénétrantes, l’électroencéphalographie, la tomographie par émission de positons, la magnétoencéphalographie et l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle, ont été utilisées pour obtenir des cartes corticales. Cependant, ces méthodes sont limitées par une faible résolution spatio-temporelle, un faible rapport signal/bruit (SNR), des coûts élevés et la non-biocompatibilité ou causent des dommages physiques au cerveau. Cette étude propose une méthode de cartographie somatosensorielle basée sur des réseaux de graphène en tant que caractéristique de l’électrocorticographie qui offre une biocompatibilité supérieure, une résolution spatio-temporelle élevée, un rapport signal/bruit souhaitable et des lésions tissulaires minimisées, surmontant ainsi les inconvénients des méthodes précédentes. Cette étude a démontré la faisabilité d’un réseau d’électrodes en graphène pour la cartographie somatosensorielle chez le rat. Le protocole présenté peut être appliqué non seulement au cortex somatosensoriel, mais aussi à d’autres cortex tels que le cortex auditif, visuel et moteur, fournissant une technologie de pointe pour la mise en œuvre clinique.
Introduction
Une carte corticale est un ensemble de patchs locaux représentant les propriétés de réponse aux stimuli sensorimoteurs dans le cortex cérébral. Il s’agit d’une formation spatiale de réseaux neuronaux qui permettent de prédire la perception et la cognition. Par conséquent, les cartes corticales sont utiles pour évaluer les réponses neuronales aux stimuli externes et traiter les informations sensorimotrices 1,2,3,4. Des méthodes invasives et non invasives sont disponibles pour la cartographie corticale. L’une des méthodes invasives les plus courantes implique l’utilisation d’électrodes intracorticales (ou pénétrantes) pour cartographier 5,6,7,8.
L’évaluation des cartes corticales à haute résolution à la demande à l’aide d’électrodes pénétrantes s’est heurtée à plusieurs obstacles. La méthode est trop laborieuse pour obtenir une carte décente et trop invasive pour être mise en œuvre pour un usage clinique, ce qui empêche tout développement ultérieur. Des technologies plus récentes telles que l’électroencéphalographie (EEG), la tomographie par émission de positons (TEP), la magnétoencéphalographie (MEG) et l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) ont gagné en popularité parce qu’elles sont moins invasives et reproductibles. Cependant, compte tenu de leurs coûts prohibitifs et de leur faible résolution, ils sont utilisés dans un nombre limité de cas 9,10,11. Récemment, les électrodes de surface flexibles avec une fiabilité de signal supérieure ont attiré une attention considérable. Les électrodes de surface à base de graphène démontrent une biocompatibilité à long terme et une flexibilité mécanique, fournissant des enregistrements stables dans un cerveau alambiqué 12,13,14,15,16. Notre groupe a récemment mis au point un réseau multicanal à base de graphène pour l’enregistrement haute résolution et la neurostimulation spécifique au site sur la surface corticale. Cette technologie nous permet de garder une trace des représentations corticales de l’information sensorielle pendant une période prolongée.
Cet article décrit les étapes de l’acquisition d’une carte cérébrale du cortex somatosensoriel à l’aide d’un réseau multi-électrodes en graphène à 30 canaux. Pour mesurer l’activité cérébrale, un réseau d’électrodes en graphène est placé sur la zone sous-durale du cortex, tandis que la patte avant, le membre antérieur, la patte arrière, le membre postérieur, le tronc et les moustaches sont stimulés avec un bâton en bois. Les potentiels évoqués somatosensoriels (PES) sont enregistrés pour les aires somatosensorielles. Ce protocole peut également être appliqué à d’autres zones du cerveau, telles que le cortex auditif, visuel et moteur.
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Protocol
Toutes les procédures de manipulation des animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université nationale d’Incheon (INU-ANIM-2017-08).
1. Préparation de l’animal à la chirurgie
REMARQUE : Utilisez Sprague Dawley Rat (8-10 semaines) sans biais sexuel pour cette expérience.
- Anesthésier le rat avec 90 mg/kg de kétamine et 10 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale. Pour maintenir la profondeur d’anesthésie souhaitée tout au long de la chirurgie, fournir un cocktail supplémentaire de 45 mg/kg de kétamine et de 5 mg/kg de xylazine lorsque le rat montre des signes de réveil.
- Confirmez que le rat est sous anesthésie profonde et vérifiez régulièrement les réflexions corporelles telles que le pincement des orteils, le pincement de la queue et le réflexe cornéen.
- Rasez la fourrure entre les yeux et l’arrière des oreilles à l’aide d’une tondeuse.
- Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter qu’ils ne se dessèchent.
2. Chirurgie de l’exposition de la surface corticale
- Fixez la tête de rat sur l’appareil stéréotaxique à l’aide d’un adaptateur stéréotaxique. Pour maintenir la température corporelle de 37 °C pendant l’opération, placez le rat sur un coussin chauffant à température contrôlée.
- Stérilisez la zone rasée avec des gommages alternés d’alcool et de povidone iodée trois fois.
- Utilisez une pince pour saisir fermement le cuir chevelu et injectez 0,1 mL de lidocaïne (2 %) à l’aide d’une seringue directement dans le cuir chevelu pour induire une anesthésie locale dans la zone de chirurgie.
- Faites une incision médiane de 2 à 3 cm de long avec un scalpel et séparez le cuir chevelu pour exposer le crâne.
- Serrez le cuir chevelu avec une pince à moustiques pour exposer le crâne.
- Grattez la surface du crâne avec une pince pour enlever le périoste.
- Disséquez les muscles au-dessus du crâne occipital pour exposer la citerne magna au-dessus de l’axe sur le dessus de la moelle épinière.
- Inciser la citerne magna avec la lame pour drainer le liquide céphalorachidien et mettre une gaze stérile à l’intérieur de l’incision de la cisterna magna pour absorber constamment le liquide céphalo-rachidien afin de prévenir l’œdème cérébral et de minimiser l’inflammation.
- À l’aide d’un crayon, marquez sur le crâne une fenêtre rectangulaire mesurant 3 mm dans l’axe antéropostérieur et 6 mm dans la direction latérale droite à partir du bregma de l’hémisphère droit.
REMARQUE : Le marquage doit assurer une distance de 1 mm de la ligne médiane pour éviter une rupture supérieure du sinus sagittal. - Percez la zone marquée selon les coordonnées stéréotaxiques et retirez le crâne à l’aide d’un rongeur osseux.
- Pour retirer la dure-mère, pliez la pointe de l’aiguille de 26 G à 90°, créez un trou dans la dure-mère, soulevez la dure-mère, insérez une pince dans ce trou et déchirez-la avec une pince.
- Placez de la gaze mouillée de solution saline sur le cortex somatosensoriel pour éviter qu’il ne se dessèche.
3. Préparation du réseau d’électrodes en graphène connecté au système d’enregistrement
- Préparez un réseau d’électrodes en graphène avec un connecteur omnétique.
- Détachez le réseau multi-électrodes en graphène sans l’endommager en appliquant la solution saline.
- Retirez le revêtement extérieur des fils de référence et de terre du connecteur.
- Connectez l’étage principal avec le réseau d’électrodes en graphène au connecteur.
- Branchez le câble d’interface relié à la tête de scène dans le système d’enregistrement.
- Fixez le complexe de réseau d’électrodes en graphène dans le bras stéréotaxique.
- Pour capter les signaux neuronaux de tous les canaux, positionnez le réseau sur le cortex somatosensoriel sans aucune flexion, en suivant les coordonnées stéréotaxiques prédéterminées.
- Placez un fil de référence sous le tissu derrière l’os occipital et connectez le fil de terre à la table optique mise à la terre.
4. Stimulation physique et enregistrement des SEP pour la cartographie
- Ouvrez le logiciel d’enregistrement des signaux neuronaux.
- Définissez l’environnement du logiciel d’enregistrement : (1) réglez la fréquence d’échantillonnage des SEP et du filtre coupe-bande (60 ou 50 Hz, une fréquence d’alimentation électrique domestique) pour éliminer le bruit de la ligne électrique.
- Pour la cartographie des moustaches, pliez la moustache avec un bâton fin.
- Piquez constamment la patte avant, le membre antérieur, la patte arrière, le membre arrière et le tronc avec un bâton en bois pour la cartographie corporelle.
- Enregistrez les signaux neuronaux dans le système d’acquisition de données pendant le temps indiqué.
5. Euthanasie animale
- Après toutes les procédures d’enregistrement, sacrifiez les rats avec une anesthésie utilisant de l’isoflurane à >5% et effectuez un curage cervical.
6. Mesure SEP pour la cartographie corticale
- Ouvrez MATLAB dont le nom de code est read_Intan_RHS2000_file.m pour l’analyse du signal.
REMARQUE : read_Intan_RHS2000_file.m peut être téléchargé à partir de « https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software ». - Cliquez sur le bouton Exécuter , sélectionnez le fichier d’enregistrement avec l’extension de nom de fichier « .rhs » et attendez que le fichier soit traité et lu.
- Entrez la commande « plot (t, amplifier_data(« channel number »,:)) » pour créer un tracé linéaire 2D des données d’enregistrement, trouver les SEP et calculer l’amplitude des SEP dans tous les canaux.
REMARQUE : Entrez le numéro de canal dans « numéro de canal ». Par exemple, « plot(t, amplifier_data(1,:)) » crée le tracé linéaire 2D du canal 1. De plus, lorsque l’expérimentateur calcule l’amplitude de la réponse, choisissez la réponse enregistrée à partir de chaque canal. - Obtenez des données en coloriant la grille avec une teinte différente en fonction de l’amplitude des SEP.
NOTE : La commande MATLAB « imagesc » permet d’obtenir une carte topographique plus rapidement.
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Representative Results
Ce protocole décrit comment un réseau multicanal de graphène est monté à la surface du cerveau. La carte somatosensorielle a été construite en acquérant des réponses neuronales à des stimuli physiques et en calculant l’amplitude de la réponse. La figure 1 montre le schéma de cette expérience.
La figure 2A présente les caractéristiques structurelles d’un réseau d’électrodes en graphène. Il y a des trous traversants du substrat entre les électrodes. Ces trous aident l’électrode à entrer fermement en contact avec la surface corticale (Figure 2B). La forte adhérence de l’électrode au cortex permet d’enregistrer les signaux neuronaux avec moins de bruit.
La figure 2C (à gauche) montre les réponses neuronales dépendantes de l’emplacement acquises en stimulant les moustaches, le tronc, les pattes et les membres codés dans différentes couleurs. Un homoncule de rat, le corps miniature du rat, est dessiné avec le rapport réel de chaque taille de couleur dans la carte du cortex somatosensoriel (Figure 2C, à droite).
La figure 2D présente les réponses spécifiques aux stimuli avec des couleurs associées à chaque partie du corps. Les réponses sont enregistrées à l’aide d’un réseau d’électrodes en graphène placé à la surface du cortex. À l’aide des données enregistrées à partir du réseau de graphène, l’amplitude des SEP est calculée pour obtenir la carte somatosensorielle dépendante de l’amplitude.
Les potentiels de champ locaux induits par les stimuli sensoriels permettent la construction de la carte somatosensorielle. La taille de la réponse à chaque stimulus corporel pose l’homoncule des rongeurs. Chaque couleur représente une partie différente du corps (Figure 3).
La carte du cortex acquise à l’aide de ce protocole révèle les régions spécifiques du cortex somatosensoriel qui répondent aux moustaches, aux pattes antérieures, aux membres antérieurs, aux pattes arrière, aux membres postérieurs et au tronc. Il donne un aperçu de l’étendue de l’implication de la zone corticale dans le traitement des informations de stimulus physiques pour chaque partie du corps.
Figure 1 : Schéma de la configuration de l’expérience. Le réseau d’électrodes à base de graphène est attaché au cortex somatosensoriel, et les moustaches ou d’autres parties du corps sont stimulées par un toucher doux. La ligne rouge épaisse représente le câble, et les fines lignes rouges et bleues représentent les fils de terre et de référence. Le point noir indique le bregma. Le système d’acquisition de données est connecté à l’ordinateur via USB. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Réseau de microélectrodes à base de graphène pour la cartographie cérébrale sur la surface corticale. (A) Schéma du réseau d’électrodes à base de graphène. (B) Image optique du réseau d’électrodes en graphène sur la surface corticale. (C) Cortex auditif et somatosensoriel du rat. Deux cartes des aires auditives et somatosensorielles répondant à des stimuli auditifs avec différentes tonalités de fréquence et des stimuli physiques appliqués à chaque partie du corps. (D) L’enregistrement à 30 canaux (à l’exclusion des électrodes de référence et de masse) du réseau d’électrodes en graphène sur la surface corticale. Les couleurs des boîtes sont en corrélation avec les emplacements géographiques de la surface corticale. Les figures sont adaptées et modifiées à partir de Lee et al. (2021). 4Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Carte somatosensorielle. (A) Emplacement des enregistrements neuronaux à travers les couches corticales (à gauche). Une carte de surface corticale déterminée à l’aide d’un réseau d’électrodes en graphène. Une carte somatosensorielle codée par couleur construite à l’aide des amplitudes de réponse et superposée à l’homoncule (à droite). (B) Enregistrement des PSE corticales et cartographie suivant la stimulation de chaque partie du corps. Cette figure est adaptée et modifiée de Lee et al. (2021). 4Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le protocole présenté fournit un processus approfondi, étape par étape, qui explique comment accéder aux réponses somatosensorielles des rats et les cartographier à l’aide d’un réseau d’électrodes en graphène. Les données acquises par le protocole sont des SEP qui fournissent des informations somatosensorielles qui sont synaptiquement liées à chaque partie du corps.
Plusieurs aspects de ce protocole doivent être pris en considération. Lors de l’extraction du liquide céphalo-rachidien pour prévenir l’œdème cérébral et atténuer l’inflammation, il est crucial pour l’expérimentateur de ne pas endommager le tronc cérébral situé devant la citerne magna.
Les moustaches faciales fournissent des informations sensorielles tactiles sur l’environnement, comme un environnement sombre et étroit. En conséquence, les moustaches des rongeurs sont suffisamment développées pour détecter un objet à travers les directions de déviation, l’intensité du stimulus et l’emplacement des moustaches stimulées. Le cortex somatosensoriel réagit différemment à la direction de flexion, à l’intensité et à l’emplacement de chaque moustache18,19. Par conséquent, toutes les moustaches sont stimulées avec une intensité et une direction constantes dans ce protocole.
Ce protocole ne peut pas enregistrer les signaux évoqués dans les structures cérébrales profondes car notre réseau d’électrodes en graphène est monté sur la surface corticale. Ainsi, l’expérimentateur ne peut pas identifier comment le réseau colonnaire est organisé hiérarchiquement en ce qui concerne les réponses neuronales.
Ce protocole est supérieur aux méthodes d’enregistrement précédentes car le réseau d’électrodes en graphène est moins invasif, adaptable et biocompatible 12,13,14,15,16. De plus, le réseau d’électrodes en graphène dispose de >30 canaux pour l’enregistrement des signaux, permettant ainsi une cartographie corticale plus rapide qu’une électrode simple ou tétrode. Ce protocole peut être appliqué à d’autres zones corticales chaque fois que cela est nécessaire15,20. L’expérimentateur peut placer le réseau d’électrodes sur le cortex auditif ou visuel pour extraire des informations auditives et visuelles sous forme de cartes auditives ou visuelles. Enfin, cette méthode peut être mise en œuvre pour l’implantation chronique et le diagnostic de maladies neurales, telles que les accidents vasculaires cérébraux, l’épilepsie, les acouphènes et la maladie de Parkinson.
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Disclosures
Nous n’avons rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l’Université nationale d’Incheon (coopérative internationale) pour Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
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