Summary
Apresentamos um procedimento de mapeamento cerebral baseado em arranjo de grafeno para reduzir a invasividade e melhorar a resolução espaço-temporal. Eletrodos de superfície baseados em arranjo de grafeno exibem biocompatibilidade de longo prazo, flexibilidade mecânica e adequação para mapeamento cerebral em um cérebro complicado. Este protocolo permite a construção simultânea e sequencial de múltiplas formas de mapas sensoriais.
Abstract
Os mapas corticais representam a organização espacial das respostas neurais dependentes da localização a estímulos sensório-motores no córtex cerebral, permitindo a predição de comportamentos fisiologicamente relevantes. Vários métodos, como eletrodos penetrantes, eletroencefalografia, tomografia por emissão de pósitrons, magnetoencefalografia e ressonância magnética funcional, têm sido utilizados para a obtenção de mapas corticais. No entanto, esses métodos são limitados por baixa resolução espaço-temporal, baixa relação sinal-ruído (SNR), altos custos e não biocompatibilidade ou causam danos físicos ao cérebro. Este estudo propõe um método de mapeamento somatossensorial baseado em arranjo de grafeno como uma característica da eletrocorticografia que oferece biocompatibilidade superior, alta resolução espaço-temporal, SNR desejável e dano tecidual minimizado, superando as desvantagens dos métodos anteriores. Este estudo demonstrou a viabilidade de um arranjo de eletrodos de grafeno para mapeamento somatossensorial em ratos. O protocolo apresentado pode ser aplicado não apenas ao córtex somatossensorial, mas também a outros córtices, como o córtex auditivo, visual e motor, fornecendo tecnologia avançada para implementação clínica.
Introduction
Um mapa cortical é um conjunto de manchas locais que representam propriedades de resposta a estímulos sensório-motores no córtex cerebral. Eles são uma formação espacial de redes neurais e permitem a previsão para percepção e cognição. Portanto, mapas corticais são úteis na avaliação de respostas neurais a estímulos externos e no processamento de informações sensório-motoras1,2,3,4. Métodos invasivos e não invasivos estão disponíveis para mapeamento cortical. Um dos métodos invasivos mais comuns envolve o uso de eletrodos intracorticais (ou penetrantes) para mapeamento 5,6,7,8.
A avaliação de mapas corticais de alta resolução sob demanda usando eletrodos penetrantes tem enfrentado vários obstáculos. O método é muito trabalhoso para obter um mapa decente e muito invasivo para ser implementado para uso clínico, proibindo o desenvolvimento posterior. Tecnologias mais recentes, como eletroencefalografia (EEG), tomografia por emissão de pósitrons (PET), magnetoencefalografia (MEG) e ressonância magnética funcional (fMRI), têm ganhado popularidade por serem menos invasivas e reprodutíveis. No entanto, devido aos seus custos proibitivos e baixa resolução, são utilizados em um número limitado de casos 9,10,11. Recentemente, eletrodos de superfície flexíveis com confiabilidade de sinal superior têm atraído considerável atenção. Eletrodos de superfície à base de grafeno demonstram biocompatibilidade e flexibilidade mecânica a longo prazo, proporcionando registros estáveis em um cérebro complicado 12,13,14,15,16. Nosso grupo desenvolveu recentemente uma matriz multicanal baseada em grafeno para gravação de alta resolução e neuroestimulação sítio-específica na superfície cortical. Essa tecnologia nos permite acompanhar as representações corticais das informações sensoriais por um longo período.
Este artigo descreve as etapas envolvidas na aquisição de um mapa cerebral do córtex somatossensorial usando um arranjo multieletrodo de grafeno de 30 canais. Para medir a atividade cerebral, um arranjo de eletrodos de grafeno é colocado na área subdural do córtex, enquanto a pata ante, o membro anterior, a pata traseira, o membro posterior, o tronco e os bigodes são estimulados com uma vara de madeira. Os potenciais evocados somatossensoriais (PESs) são registrados para áreas somatossensoriais. Esse protocolo também pode ser aplicado a outras áreas cerebrais, como o córtex auditivo, visual e motor.
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Protocol
Todos os procedimentos de manejo de animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Nacional de Incheon (INU-ANIM-2017-08).
1. Preparo do animal para a cirurgia
NOTA: Use Sprague Dawley Rat (8-10 semanas de idade) sem o viés sexual para este experimento.
- Anestesiar o rato com 90 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de coquetel de xilazina por via intraperitoneal. Para manter a profundidade de anestesia desejada durante toda a cirurgia, fornecer um coquetel suplementar de 45 mg/kg de quetamina e 5 mg/kg de xilazina quando o rato mostrar sinais de despertar.
- Confirme se o rato está sob anestesia profunda e verifique regularmente os reflexos do corpo, como pinça dos dedos, pinça da cauda e reflexo corneano.
- Faça a barba entre os olhos e a parte de trás das orelhas usando um aparador.
- Aplique uma pomada oftálmica nos olhos para evitar que eles sequem.
2. Cirurgia para exposição da superfície cortical
- Fixe a cabeça do rato no aparelho estereotáxico com um adaptador estereotáxico. Para manter a temperatura corporal de 37 °C durante a cirurgia, coloque o rato sobre uma almofada de aquecimento com temperatura controlada.
- Esterilizar a área raspada com esfoliantes alternados de álcool e iodopovidona três vezes.
- Use pinça para segurar firmemente o couro cabeludo e injete 0,1 mL de lidocaína (2%) com uma seringa diretamente no couro cabeludo para induzir anestesia local na área da cirurgia.
- Faça uma incisão mediana de 2-3 cm de comprimento com um bisturi e afaste o couro cabeludo para expor o crânio.
- Aperte o couro cabeludo com pinças de mosquito para expor o crânio.
- Coçar a superfície do crânio com pinça para remover o periósteo.
- Blunt dissecar os músculos sobre o crânio occipital para expor a cisterna magna acima do eixo no topo da medula espinhal.
- Incise a cisterna magna com a lâmina para drenar o líquido cefalorraquidiano e coloque uma gaze estéril dentro da incisão da cisterna magna para absorver o líquido cefalorraquidiano constantemente para prevenir o edema cerebral e minimizar a inflamação.
- Com um lápis, marque no crânio uma janela retangular medindo 3 mm no eixo anteroposterior e 6 mm na direção lateral direita a partir do bregma do hemisfério direito.
NOTA: A marcação deve fixar uma distância de 1 mm da linha média para evitar a ruptura do seio sagital superior. - Perfure a área marcada de acordo com a coordenada estereotáxica e remova o crânio com um rongeur ósseo.
- Para remover a dura-máter, dobre a ponta da agulha de 26 G a 90°, crie um orifício na dura-máter, levante a dura-máter, insira pinças nesse orifício e rasgue-a com pinças.
- Coloque gaze molhada com soro fisiológico no córtex somatossensorial para evitar que ele seque.
3. Preparação do arranjo de eletrodos de grafeno conectado ao sistema de gravação
- Prepare uma matriz de eletrodos de grafeno com um conector omnético.
- Desprenda o arranjo multieletrodo de grafeno sem causar danos aplicando a solução salina.
- Remova a cobertura externa dos fios de referência e terra do conector.
- Conecte o estágio principal com o conjunto de eletrodos de grafeno ao conector.
- Conecte o cabo de interface ligado ao head stage ao sistema de gravação.
- Fixe o complexo de arranjo de eletrodos de grafeno no braço estereotáxico.
- Para captar sinais neurais de todos os canais, posicione a matriz no córtex somatossensorial sem qualquer flexão, seguindo as coordenadas estereotáxicas predeterminadas.
- Coloque um fio de referência sob o tecido atrás do osso occipital e conecte o fio terra à mesa óptica aterrada.
4. Estimulação física e registro de PEE para mapeamento
- Abra o software de gravação de sinal neural.
- Defina o ambiente do software de gravação: (1) defina a taxa de amostragem para SEPs e filtro de entalhe (60 ou 50 Hz, uma frequência de energia elétrica doméstica) para remover o ruído da linha de energia.
- Para o mapeamento do bigode, dobre o bigode com um palito fino.
- Cutuque constantemente a pata dianteira, o membro anterior, a pata traseira, o membro posterior e o tronco com um bastão de madeira para mapeamento corporal.
- Registrar sinais neurais no sistema de aquisição de dados pelo tempo indicado.
5. Eutanásia animal
- Após todos os procedimentos de registro, sacrificar os ratos com anestesia com isoflurano a >5% e realizar dissecção cervical.
6. Medição SEP para mapeamento cortical
- Abra o MATLAB de codinome read_Intan_RHS2000_file.m para análise de sinais.
NOTA: read_Intan_RHS2000_file.m pode ser baixado de "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Clique no botão Executar , selecione o arquivo de gravação com a extensão de nome de arquivo ".rhs" e aguarde até que o arquivo seja processado e lido.
- Digite o comando "plot (t, amplifier_data("número do canal",:))" para criar um gráfico de linha 2D dos dados de gravação, encontrar os SEPs e calcular a amplitude dos SEPs em todos os canais.
NOTA: Digite o número do canal em "número do canal". Por exemplo, "plot(t, amplifier_data(1,:))" cria o gráfico de linhas 2D do canal 1. Além disso, quando o experimentador calcular a amplitude da resposta, escolha a resposta gravada de cada canal. - Obtenha dados colorindo a grade com uma tonalidade diferente de acordo com a amplitude dos SEPs.
NOTA: O comando "imagesc" do MATLAB ajuda a obter um mapa topográfico mais rapidamente.
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Representative Results
Este protocolo descreve como uma matriz multicanal de grafeno é montada na superfície do cérebro. O mapa somatossensorial foi construído por meio da aquisição de respostas neurais a estímulos físicos e do cálculo da amplitude da resposta. A Figura 1 mostra o esquema desse experimento.
A Figura 2A apresenta as características estruturais de um arranjo de eletrodos de grafeno. Há furos do substrato entre os eletrodos. Esses orifícios ajudam o eletrodo a entrar em contato firmemente com a superfície cortical (Figura 2B). A forte adesão do eletrodo ao córtex ajuda a registrar sinais neurais com menos ruído.
A Figura 2C (esquerda) mostra as respostas neurais dependentes da localização adquiridas pela estimulação dos bigodes, tronco, patas e membros codificados em diferentes cores. Um homúnculo de rato, o corpo em miniatura do rato, é desenhado com a proporção real de cada tamanho de cor no mapa do córtex somatossensorial (Figura 2C, à direita).
A Figura 2D apresenta respostas estímulo-específicas com cores associadas a cada parte do corpo. As respostas são registradas através de um arranjo de eletrodos de grafeno colocado na superfície do córtex. Usando os dados registrados a partir da matriz de grafeno, a amplitude dos PEs é calculada para obter o mapa somatossensorial amplitude-dependente.
Os potenciais de campo locais induzidos por estímulos sensoriais possibilitam a construção do mapa somatossensorial. O tamanho da resposta a cada estímulo corporal representa um homúnculo de roedores. Cada cor representa uma parte do corpo diferente (Figura 3).
O mapa do córtex adquirido usando este protocolo revela as regiões específicas dentro do córtex somatossensorial que respondem aos bigodes, patas anteriores, membros anteriores, patas traseiras, membros posteriores e troncos. Ele fornece informações sobre a extensão do envolvimento da área cortical no processamento de informações de estímulos físicos para cada parte do corpo.
Figura 1: Esquema da montagem do experimento. O arranjo de eletrodos à base de grafeno está ligado ao córtex somatossensorial, e os bigodes ou outras partes do corpo são estimulados pelo toque suave. A linha vermelha grossa representa o cabo, e as finas linhas vermelhas e azuis representam o solo e os fios de referência. O ponto preto indica o bregma. O sistema de aquisição de dados é conectado ao computador via USB. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Arranjo de microeletrodos à base de grafeno para mapeamento cerebral na superfície cortical . (A) Esquema da matriz de eletrodos à base de grafeno. (B) Imagem óptica do arranjo de eletrodos de grafeno na superfície cortical. (C) Córtices auditivos e somatossensoriais de ratos. Dois mapas de áreas auditivas e somatossensoriais que respondem a estímulos auditivos com vários tons de frequência e estímulos físicos aplicados a cada parte do corpo (D) O registro de 30 canais (excluindo os eletrodos de referência e terra) do arranjo de eletrodos de grafeno na superfície cortical. As cores das caixas correlacionam-se com as localizações geográficas da superfície cortical. As figuras são adaptadas e modificadas de Lee et al (2021). 4Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mapa somatossensorial. (A) Localização dos registros neurais através das camadas corticais (esquerda). Um mapa da superfície cortical determinado usando um arranjo de eletrodos de grafeno. Um mapa somatossensorial codificado por cores construído usando as amplitudes de resposta e sobreposto com o homúnculo (à direita). (B) SEPs e mapas corticais registrados após a estimulação de cada parte do corpo. Esta figura é adaptada e modificada de Lee et al (2021). 4Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo apresentado fornece um processo detalhado e passo a passo que explica como acessar e mapear as respostas somatossensoriais de ratos usando um arranjo de eletrodos de grafeno. Os dados adquiridos pelo protocolo são SEPs que fornecem informações somatossensoriais que estão sinapticamente ligadas a cada parte do corpo.
Vários aspectos desse protocolo devem ser considerados. Ao extrair o líquido cefalorraquidiano para prevenir o edema cerebral e atenuar a inflamação, é crucial para o experimentador não danificar o tronco cerebral localizado na frente da cisterna magna.
Bigodes faciais fornecem informações sensoriais táteis sobre o ambiente, como um ambiente escuro e estreito. Assim, os bigodes de roedores são bem desenvolvidos o suficiente para sentir um objeto através das direções de deflexão, intensidade do estímulo e localização dos bigodes estimulados. O córtex somatossensorial responde à direção, intensidade e localização da flexão de cada bigodinho de forma diferente18,19. Portanto, todos os bigodes são estimulados com intensidade e direção constantes neste protocolo.
Este protocolo não pode registrar sinais evocados em estruturas cerebrais profundas, pois nosso arranjo de eletrodos de grafeno é montado na superfície cortical. Assim, o experimentador não consegue identificar como a rede colunar está hierarquicamente organizada em relação às respostas neurais.
Esse protocolo é superior aos métodos de registro anteriores, pois o arranjo de eletrodos de grafeno é menos invasivo, adaptável e biocompatível12,13,14,15,16. Além disso, o arranjo de eletrodos de grafeno possui >30 canais para gravação de sinais, permitindo assim um mapeamento cortical mais rápido do que um eletrodo único ou tetrodo. Esse protocolo pode ser aplicado a outras áreas corticais sempre quenecessário15,20. O experimentador pode colocar o arranjo de eletrodos no córtex auditivo ou visual para extrair informações auditivas e visuais como os mapas auditivos ou visuais. Finalmente, este método pode ser implementado para implantação crônica e diagnóstico de doenças neurais, como acidente vascular cerebral, epilepsia, zumbido e doença de Parkinson.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Universidade Nacional de Incheon (Cooperativa Internacional) para Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
