Summary
Vi presenterar en grafenarray-baserad hjärnkartläggningsprocedur för att minska invasiviteten och förbättra den spatiotemporala upplösningen. Grafenbaserade ytelektroder uppvisar långsiktig biokompatibilitet, mekanisk flexibilitet och lämplighet för kartläggning av hjärnan i en invecklad hjärna. Detta protokoll gör det möjligt att konstruera flera former av sensoriska kartor samtidigt och sekventiellt.
Abstract
Kortikala kartor representerar den rumsliga organisationen av platsberoende neurala svar på sensomotoriska stimuli i hjärnbarken, vilket möjliggör förutsägelse av fysiologiskt relevanta beteenden. Olika metoder, såsom penetrerande elektroder, elektroencefalografi, positronemissionstomografi, magnetencefalografi och funktionell magnetresonanstomografi, har använts för att få kortikala kartor. Dessa metoder begränsas dock av dålig spatiotemporal upplösning, lågt signal-brusförhållande (SNR), höga kostnader och icke-biokompatibilitet eller orsakar fysisk skada på hjärnan. Denna studie föreslår en grafenarray-baserad somatosensorisk kartläggningsmetod som en egenskap hos elektrokortikografi som erbjuder överlägsen biokompatibilitet, hög spatiotemporal upplösning, önskvärd SNR och minimerad vävnadsskada, vilket övervinner nackdelarna med tidigare metoder. Denna studie visade genomförbarheten av en grafenelektrod för somatosensorisk kartläggning hos råttor. Det presenterade protokollet kan tillämpas inte bara på den somatosensoriska cortex utan även på andra cortices såsom hörsel-, syn- och motoriska cortex, vilket ger avancerad teknik för klinisk implementering.
Introduction
En kortikal karta är en uppsättning lokala fläckar som representerar svarsegenskaper på sensomotoriska stimuli i hjärnbarken. De är en rumslig formation av neurala nätverk och möjliggör förutsägelse för perception och kognition. Därför är kortikala kartor användbara för att utvärdera neurala svar på externa stimuli och bearbeta sensomotorisk information 1,2,3,4. Invasiva och icke-invasiva metoder finns tillgängliga för kortikal kartläggning. En av de vanligaste invasiva metoderna innebär användning av intrakortikala (eller penetrerande) elektroder för kartläggning av 5,6,7,8.
Att bedöma de högupplösta kortikala kartorna på begäran med hjälp av penetrerande elektroder har stött på flera hinder. Metoden är för mödosam för att få en anständig karta och för invasiv för att implementeras för klinisk användning, vilket förhindrar vidare utveckling. Nyare tekniker som elektroencefalografi (EEG), positronemissionstomografi (PET), magnetencefalografi (MEG) och funktionell magnetisk resonanstomografi (fMRI) har vunnit popularitet eftersom dessa är mindre invasiva och reproducerbara. Men med tanke på deras oöverkomliga kostnader och dåliga upplösning används de i ett begränsat antal fall 9,10,11. På senare tid har flexibla ytelektroder med överlägsen signaltillförlitlighet väckt stor uppmärksamhet. Grafenbaserade ytelektroder uppvisar långsiktig biokompatibilitet och mekanisk flexibilitet, vilket ger stabila registreringar i en invecklad hjärna 12,13,14,15,16. Vår grupp har nyligen utvecklat en grafenbaserad flerkanalsarray för högupplöst inspelning och platsspecifik neurostimulering på den kortikala ytan. Denna teknik gör det möjligt för oss att hålla reda på de kortikala representationerna av sensorisk information under en längre period.
Den här artikeln beskriver stegen för att få en hjärnkarta över den somatosensoriska cortex med hjälp av en 30-kanals grafenmultielektrodmatris. För att mäta hjärnaktiviteten placeras en grafenelektrod på subduralområdet i cortex, medan framtassen, frambenet, baktassen, bakbenet, bålen och morrhåren stimuleras med en träpinne. De somatosensoriska framkallade potentialerna (SEP) registreras för somatosensoriska områden. Detta protokoll kan också tillämpas på andra hjärnområden, såsom hörsel-, syn- och motoriska cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurhanteringsprocedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Incheon National University (INU-ANIM-2017-08).
1. Djurens förberedelse inför operation
OBS: Använd Sprague Dawley Rat (8-10 veckor gammal) utan könsbias för detta experiment.
- Bedöva råttan med 90 mg/kg ketamin och 10 mg/kg xylazincocktail intraperitonealt. För att bibehålla det önskade anestesidjupet under hela operationen, ge ett tillskott på 45 mg/kg ketamin och 5 mg/kg xylazincocktail när råttan visar tecken på att vakna.
- Bekräfta att råttan är under djup narkos och kontrollera regelbundet kroppsreflektioner som tårnyp, svansnyp och hornhinnereflex.
- Raka pälsen mellan ögonen och baksidan av öronen med hjälp av en trimmer.
- Applicera en ögonsalva på ögonen för att förhindra att de torkar ut.
2. Kirurgi för kortikal ytexponering
- Fäst råtthuvudet på den stereotaktiska apparaten med en stereotaktisk adapter. För att hålla kroppstemperaturen på 37 °C under operationen, placera råttan på en temperaturkontrollerad värmedyna.
- Sterilisera det rakade området med omväxlande skrubb av alkohol och povidon-jod tre gånger.
- Använd en pincett för att ta ett stadigt tag i hårbotten och injicera 0,1 ml lidokain (2%) med en spruta direkt i hårbotten för att inducera lokalbedövning i operationsområdet.
- Gör ett 2-3 cm långt snitt i mittlinjen med en skalpell och dra isär hårbotten så att skallen blottas.
- Kläm fast hårbotten med en myggpincett för att exponera skallen.
- Skrapa på skallens yta med en pincett för att ta bort benhinnan.
- Blunt dissekerar musklerna över nackskallen för att exponera cisterna magna ovanför axeln på toppen av ryggmärgen.
- Snitta cisterna magna med bladet för att dränera cerebrospinalvätskan och lägg en steril gasväv inuti snittet i cisterna magna för att absorbera cerebrospinalvätskan konstant för att förhindra hjärnödem och minimera inflammation.
- Använd en blyertspenna och markera ett rektangulärt fönster på skallen som mäter 3 mm i den anteroposteriora axeln och 6 mm i höger sidoriktning från bregma på höger hjärnhalva.
OBS: Markeringen måste säkra ett avstånd på 1 mm från mittlinjen för att undvika överlägsen sagittal sinusruptur. - Borra det markerade området enligt den stereotaktiska koordinaten och ta bort skallen med en benrongeur.
- För att ta bort dura mater, böj spetsen på 26 G-nålen till 90°, skapa ett hål i dura mater, lyft dura mater, sätt in pincetten i hålet och riv av den med en pincett.
- Placera saltlösning fuktad gasväv på den somatosensoriska cortex för att förhindra att den torkar ut.
3. Beredning av grafenelektrod ansluten till registreringssystemet
- Förbered en grafenelektrod med en omnetics-kontakt.
- Lossa grafenmultielektrodmatrisen utan att orsaka skada genom att applicera saltlösningen.
- Ta bort det yttre höljet på referens- och jordledningarna från kontakten.
- Anslut huvudsteget med grafenelektrodmatrisen till kontakten.
- Anslut gränssnittskabeln som är kopplad till huvudentage till inspelningssystemet.
- Fäst grafenelektrodmatriskomplexet i den stereotaktiska armen.
- För att fånga neurala signaler från alla kanaler, placera arrayen på den somatosensoriska cortex utan böjning, följ de förutbestämda stereotaktiska koordinaterna.
- Placera en referenstråd under vävnaden bakom nackbenet och anslut jordledningen till det jordade optiska bordet.
4. Fysisk stimulering och registrering av sprutbytesprogram för kartläggning
- Öppna programvaran för inspelning av neurala signaler.
- Ställ in inspelningsprogramvarans miljö: (1) ställ in samplingsfrekvensen för SEP och notchfilter (60 eller 50 Hz, en frekvens för hushållets elektriska effekt) för att ta bort bruset från kraftledningen.
- För att mappa morrhåren, böj morrhåren med en fin pinne.
- Peta hela tiden på framtassen, frambenet, baktassen, bakbenet och bålen med en träpinne för kroppskartläggning.
- Spela in neurala signaler i datainsamlingssystemet under den angivna tiden.
5. Avlivning av djur
- Efter alla registreringsprocedurer, offra råttorna med bedövning med >5% isofluran och utför cervikal dissektion.
6. SEP-mätning för kortikal kartläggning
- Öppna MATLAB med kodnamnet read_Intan_RHS2000_file.m för signalanalys.
OBS: read_Intan_RHS2000_file.m kan laddas ner från "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software". - Klicka på knappen Kör , välj inspelningsfilen med filnamnstillägget ".rhs" och vänta på att filen ska bearbetas och läsas.
- Ange kommandot "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" för att skapa ett 2D-linjediagram av inspelningsdata, hitta SEP:erna och beräkna amplituden för SEP:er i alla kanaler.
OBS: Ange kanalnumret vid "kanalnummer". Till exempel skapar "plot(t, amplifier_data(1,:))" kanal 1:s 2D-linjediagram. Dessutom, när experimentatorn beräknar amplituden för svaret, välj det svar som spelas in från varje kanal. - Erhåll data genom att färga rutnätet med en annan nyans beroende på SEP:ernas amplitud.
MATLAB-kommandot "imagesc" hjälper till att få en topografisk karta snabbare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver hur en grafen flerkanalig array är monterad på hjärnans yta. Den somatosensoriska kartan konstruerades genom att samla in neurala svar på fysiska stimuli och beräkna amplituden av responsen. Figur 1 visar schemat för detta experiment.
Figur 2A visar de strukturella egenskaperna hos en grafenelektrod. Det finns genomgående hål i substratet mellan elektroderna. Dessa hål hjälper elektroden att komma i kontakt med den kortikala ytan (Figur 2B). Elektrodens starka vidhäftning till cortex hjälper till att spela in neurala signaler med mindre brus.
Figur 2C (vänster) visar de platsberoende neurala svaren som förvärvas genom att stimulera morrhår, bål, tassar och lemmar kodade i olika färger. En råtthomunculus, råttans miniatyrkropp, ritas med det faktiska förhållandet mellan varje färgstorlek i den somatosensoriska cortexkartan (figur 2C, höger).
Figur 2D visar stimulispecifika svar med färger associerade med varje kroppsdel. Svaren registreras genom en grafenelektrod placerad på ytan av cortex. Med hjälp av data som registrerats från grafenmatrisen beräknas amplituden för SEP:er för att erhålla den amplitudberoende somatosensoriska kartan.
Sensoriska stimulusinducerade lokala fältpotentialer gör det möjligt att konstruera den somatosensoriska kartan. Responsstorleken på varje kroppsstimulus utgör gnagarhomunculus. Varje färg representerar en annan kroppsdel (figur 3).
Den förvärvade cortexkartan med hjälp av detta protokoll avslöjar de specifika regionerna i den somatosensoriska cortex som svarar på morrhår, framtassar, framben, baktassar, bakben och stammar. Det ger insikter i omfattningen av det kortikala områdets involvering i bearbetningen av fysisk stimulusinformation för varje kroppsdel.
Bild 1: Schematisk bild av experimentkonfigurationen. Den grafenbaserade elektrodmatrisen är fäst vid den somatosensoriska cortex, och morrhåren eller andra kroppsdelar stimuleras genom mild beröring. Den tjocka röda linjen representerar kabeln, och de tunna röda och blå linjerna representerar jord- och referensledningarna. Den svarta pricken indikerar bregma. Datainsamlingssystemet är anslutet till datorn via USB. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Grafenbaserad mikroelektrod för kartläggning av hjärnan på den kortikala ytan . (A) Schematisk bild av den grafenbaserade elektrodmatrisen. (B) Optisk bild av grafenelektroden på den kortikala ytan. (C) Råttans hörsel- och somatosensoriska kortik. Två kartor över auditiva och somatosensoriska områden som reagerar på auditiva stimuli med olika frekvenstoner och fysiska stimuli applicerade på varje kroppsdel. (D) 30-kanals (exklusive referens- och jordelektroder) registrering av grafenelektrodmatrisen på kortikal yta. Rutans färger korrelerar med den kortikala ytans geografiska platser. Figurerna är anpassade och modifierade från Lee et al. (2021). 4Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Somatosensorisk karta. (A) Placering av neurala inspelningar över kortikala lager (vänster). En kortikal ytkarta bestämd med hjälp av en grafenelektrod. En färgkodad somatosensorisk karta konstruerad med hjälp av responsamplituderna och överlappad med homunculus (höger). (B) Registrerade kortikala SEP och kartor efter stimulering av varje kroppsdel. Denna figur är anpassad och modifierad från Lee et al. (2021). 4Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det presenterade protokollet ger en djupgående, steg-för-steg-process som förklarar hur man får tillgång till och kartlägger de somatosensoriska reaktionerna hos råttor med hjälp av en grafenelektrod. De protokollinhämtade uppgifterna är SEP:er som ger somatosensorisk information som är synaptiskt kopplad till varje kroppsdel.
Flera aspekter av detta protokoll bör beaktas. Vid extraktion av cerebrospinalvätska för att förhindra hjärnödem och mildra inflammation är det avgörande för experimentledaren att inte skada hjärnstammen som ligger framför cisterna magna.
Morrhåren ger taktil sensorisk information om omgivningen, till exempel en mörk och smal miljö. Följaktligen är morrhår från gnagare tillräckligt välutvecklade för att känna av ett föremål genom avböjningsriktningarna, stimulusintensiteten och placeringen av de stimulerade morrhåren. Den somatosensoriska cortexen reagerar på böjningsriktningen, intensiteten och placeringen av varje morrhår på olika sätt18,19. Därför stimuleras alla morrhår med konstant intensitet och riktning i detta protokoll.
Detta protokoll kan inte spela in signaler som framkallas i djupa hjärnstrukturer eftersom vår grafenelektrod är monterad på den kortikala ytan. Experimentatorn kan därför inte identifiera hur det kolumnära nätverket är hierarkiskt organiserat när det gäller neurala svar.
Detta protokoll är överlägset tidigare inspelningsmetoder eftersom grafenelektrodmatrisen är mindre invasiv, anpassningsbar och biokompatibel 12,13,14,15,16. Dessutom har grafenelektrodledaren >30 kanaler för att registrera signaler, vilket möjliggör snabbare kortikal kartläggning än en enkel elektrod eller tetrodeelektrod. Detta protokoll kan tillämpas vidare på andra kortikala områden när det behövs15,20. Experimentatorn kan placera elektrodmatrisen på den auditiva eller visuella cortex för att extrahera auditiv och visuell information som auditiv eller visuell karta. Slutligen kan denna metod implementeras för kronisk implantation och diagnos av neurala sjukdomar, såsom stroke, epilepsi, tinnitus och Parkinsons sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Incheon National University (International Cooperative) för Sunggu Yang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
- Leergaard, T. B., et al. Rat somatosensory cerebropontocerebellar pathways: spatial relationships of the somatotopic map of the primary somatosensory cortex are preserved in a three-dimensional clustered pontine map. Journal of Comparative Neurology. 422 (2), 246-266 (2000).
- Craner, S. L., Ray, R. H. Somatosensory cortex of the neonatal pig: I. Topographic organization of the primary somatosensory cortex (SI). Journal of Comparative Neurology. 306 (1), 24-38 (1991).
- Benison, A. M., Rector, D. M., Barth, D. S. Hemispheric mapping of secondary somatosensory cortex in the rat. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 200-207 (2007).
- Lee, M., et al. Graphene-electrode array for brain map remodeling of the cortical surface. NPG Asia Materials. 13 (1), (2021).
- Yang, S. C., Weiner, B. D., Zhang, L. S., Cho, S. J., Bao, S. W. Homeostatic plasticity drives tinnitus perception in an animal model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (36), 14974-14979 (2011).
- Yang, S., Zhang, L. S., Gibboni, R., Weiner, B., Bao, S. W. Impaired development and competitive refinement of the cortical frequency map in tumor necrosis factor-alpha-deficient mice. Cerebral Cortex. 24 (7), 1956-1965 (2014).
- Miyakawa, A., et al. Tinnitus correlates with downregulation of cortical glutamate decarboxylase 65 expression but not auditory cortical map reorganization. Journal of Neuroscience. 39 (50), 9989-10001 (2019).
- Yang, S., Su, W., Bao, S. Long-term, but not transient, threshold shifts alter the morphology and increase the excitability of cortical pyramidal neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (6), 1567-1574 (2012).
- Beniczky, S., Schomer, D. L. Electroencephalography: basic biophysical and technological aspects important for clinical applications. Epileptic Disorders. 22 (6), 697-715 (2020).
- Kim, S. G., Richter, W., Uğurbil, K. Limitations of temporal resolution in functional MRI. Magnetic Resonance Medicine. 37 (4), 631-636 (1997).
- Cho, Z. H., et al. A fusion PET-MRI system with a high-resolution research tomograph-PET and ultra-high field 7.0 T-MRI for the molecular-genetic imaging of the brain. Proteomics. 8 (6), 1302-1323 (2008).
- Viventi, J., et al. Flexible, foldable, actively multiplexed, high-density electrode array for mapping brain activity in vivo. Nature Neuroscience. 14 (12), 1599-1605 (2011).
- Masvidal-Codina, E., et al. High-resolution mapping of infraslow cortical brain activity enabled by graphene microtransistors. Nature Materials. 18 (3), 280-288 (2019).
- Blaschke, B. M., et al. Mapping brain activity with flexible graphene micro-transistors. 2D Materials. 4 (2), 025040 (2017).
- Park, S. W., et al.
- Lim, J., et al. Hybrid graphene electrode for the diagnosis and treatment of epilepsy in free-moving animal models. NPG Asia Materials. 15 (1), 7 (2023).
- Hermanns, H., et al. Molecular mechanisms of action of systemic lidocaine in acute and chronic pain: a narrative review. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 335-349 (2019).
- Tchoe, Y., et al. Human brain mapping with multithousand-channel PtNRGrids resolves spatiotemporal dynamics. Science Translational Medicine. 14 (628), (2022).
- Wilent, W. B., Contreras, D. Dynamics of excitation and inhibition underlying stimulus selectivity in rat somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 8 (10), 1364-1370 (2005).
- Insanally, M. N., Köver, H., Kim, H., Bao, S. Feature-dependent sensitive periods in the development of complex sound representation. Journal of Neuroscience. 29 (17), 5456-5462 (2009).
