Summary
침습성을 줄이고 시공간 해상도를 개선하기 위해 그래핀 어레이 기반 뇌 매핑 절차를 제시합니다. 그래핀 어레이 기반 표면 전극은 복잡한 뇌에서 장기적인 생체 적합성, 기계적 유연성 및 뇌 매핑에 대한 적합성을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 여러 형태의 감각 맵을 동시에 순차적으로 구성할 수 있습니다.
Abstract
피질 지도는 대뇌 피질의 감각 운동 자극에 대한 위치 의존적 신경 반응의 공간적 구성을 나타내므로 생리학적으로 관련된 행동을 예측할 수 있습니다. 피질 지도를 얻기 위해 관통 전극, 뇌파 검사, 양전자 방출 단층 촬영, 자기 뇌파 검사 및 기능적 자기 공명 영상과 같은 다양한 방법이 사용되었습니다. 그러나 이러한 방법은 열악한 시공간 해상도, 낮은 신호 대 잡음비(SNR), 높은 비용 및 비생체 적합성으로 인해 제한되거나 뇌에 물리적 손상을 유발합니다. 본 연구에서는 기존 방법의 단점을 극복하여 우수한 생체적합성, 높은 시공간 해상도, 바람직한 SNR, 최소화된 조직 손상을 제공하는 전기피질검사의 특징으로 그래핀 어레이 기반 체성감각 매핑 방법을 제안한다. 이 연구는 쥐의 체성 감각 매핑을 위한 그래핀 전극 어레이의 타당성을 입증했습니다. 제시된 프로토콜은 체성감각 피질뿐만 아니라 청각, 시각, 운동 피질과 같은 다른 피질에도 적용될 수 있어 임상 구현을 위한 첨단 기술을 제공합니다.
Introduction
피질 지도는 대뇌 피질의 감각 운동 자극에 대한 반응 특성을 나타내는 일련의 국소 패치입니다. 그것들은 신경망의 공간적 형성이며 지각과 인지에 대한 예측을 가능하게 합니다. 따라서 피질 맵은 외부 자극에 대한 신경 반응을 평가하고 감각 운동 정보를 처리하는 데 유용합니다 1,2,3,4. 피질 매핑을 위해 침습적 및 비침습적 방법을 사용할 수 있습니다. 가장 일반적인 침습적 방법 중 하나는 5,6,7,8을 매핑하기 위해 피질 내 (또는 관통) 전극을 사용하는 것입니다.
관통 전극을 사용하여 주문형 고해상도 피질 지도를 평가하는 것은 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이 방법은 적절한 지도를 얻기에는 너무 힘들고 임상용으로 구현하기에는 너무 침습적이어서 추가 개발을 금지합니다. 뇌파 검사 (EEG), 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 뇌파 검사 (MEG) 및 기능적 자기 공명 영상 (fMRI)과 같은 최신 기술은 덜 침습적이고 재현 가능하기 때문에 인기를 얻고 있습니다. 그러나, 그들의 엄청난 비용과 열악한 해상도를 감안할 때, 그들은 제한된 수의 경우에 사용됩니다 9,10,11. 최근, 신호 신뢰성이 우수한 유연한 표면 전극이 상당한 주목을 받고 있습니다. 그래핀 기반 표면 전극은 장기적인 생체 적합성과 기계적 유연성을 보여 주며 복잡한 뇌에서 안정적인 기록을 제공합니다 12,13,14,15,16. 우리 그룹은 최근 피질 표면의 고해상도 기록 및 부위별 신경 자극을 위한 그래핀 기반 다중 채널 어레이를 개발했습니다. 이 기술을 통해 우리는 오랜 기간 동안 감각 정보의 피질 표현을 추적 할 수 있습니다.
이 기사에서는 30채널 그래핀 다중 전극 어레이를 사용하여 체성 감각 피질의 뇌 지도를 획득하는 단계를 설명합니다. 뇌 활동을 측정하기 위해 그래핀 전극 어레이를 피질의 경막하 영역에 놓고 앞발, 앞다리, 뒷발, 뒷다리, 몸통 및 수염을 나무 막대기로 자극합니다. 체성감각 유발 전위(SEP)는 체성감각 영역에 대해 기록됩니다. 이 프로토콜은 청각, 시각 및 운동 피질과 같은 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있습니다.
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Protocol
모든 동물 취급 절차는 인천대학교 기관동물관리이용위원회(INU-ANIM-2017-08)의 승인을 받았습니다.
1. 수술을 위한 동물 준비
참고: 이 실험에서는 성별 편견 없이 Sprague Dawley Rat(8-10주령)를 사용하십시오.
- 쥐를 90mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진 칵테일을 복강 주사로 마취합니다. 수술 내내 원하는 마취 깊이를 유지하려면 쥐가 깨어날 징후를 보일 때 45mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진 칵테일을 보충하십시오.
- 쥐가 깊은 마취 상태인지 확인하고 발가락 꼬집기, 꼬리 꼬집기, 각막 반사와 같은 신체 반사를 정기적으로 확인합니다.
- 트리머를 사용하여 눈과 귀 뒤쪽 사이의 털을 면도하십시오.
- 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안과용 연고를 눈에 바르십시오.
2. 피질 표면 노출을 위한 수술
- 입체 어댑터로 입체 장치에 쥐 머리를 고정하십시오. 수술 중 체온을 37°C로 유지하려면 체온이 조절되는 가열 패드에 쥐를 올려 놓으십시오.
- 면도 부위를 알코올과 포비돈 요오드를 번갈아 가며 세 번 소독하십시오.
- 겸자를 사용하여 두피를 단단히 잡고 주사기로 리도카인 0.1mL(2%)를 두피에 직접 주입하여 수술 부위에 국소 마취를 유도합니다.
- 메스로 2-3cm 길이의 정중선을 절개하고 두피를 당겨 두개골을 노출시킵니다.
- 두개골을 노출시키기 위해 모기 집게로 두피를 고정하십시오.
- 골막으로 두개골 표면을 집게로 긁어 골막을 제거하십시오.
- 둔기는 후두 두개골 위의 근육을 해부하여 척수 상단의 축 위에 수조를 노출시킵니다.
- 칼날로 수조를 절개하여 뇌척수액을 배출하고 수조 마그나 절개 부위에 멸균 거즈를 넣어 뇌척수액을 지속적으로 흡수하여 뇌부종을 예방하고 염증을 최소화합니다.
- 연필을 사용하여 우반구의 브레그마에서 전후 축으로 3mm, 오른쪽 측면 방향으로 6mm 크기의 직사각형 창을 두개골에 표시하십시오.
알림: 마킹은 상부 시상동 파열을 방지하기 위해 정중선에서 1mm 거리를 확보해야 합니다. - 입체 좌표에 따라 표시된 영역을 뚫고 뼈 rongeur로 두개골을 제거하십시오.
- 경막을 제거하려면 26G 바늘 끝을 90°로 구부리고 경막에 구멍을 뚫고 경막을 들어 올려 그 구멍에 집게를 넣고 집게로 찢습니다.
- 체성 감각 피질에 식염수를 적신 거즈를 놓아 건조를 방지하십시오.
3. 기록 시스템에 연결된 그래핀 전극 어레이의 제조
- 오메틱스 커넥터가 있는 그래핀 전극 어레이를 준비합니다.
- 식염수를 도포하여 손상을 입히지 않고 그래핀 다중전극 어레이를 분리합니다.
- 커넥터에서 기준 및 접지선의 외부 덮개를 제거합니다.
- 헤드 스테이지를 그래핀 전극 어레이와 커넥터에 연결합니다.
- 헤드 스테이지에 연결된 인터페이스 케이블을 녹음 시스템에 꽂습니다.
- 그래핀 전극 어레이 복합체를 스테렉탁스 암에 고정합니다.
- 모든 채널에서 신경 신호를 캡처하려면 미리 결정된 정위 좌표를 따라 구부리지 않고 체성 감각 피질에 배열을 배치합니다.
- 후두골 뒤의 조직 아래에 기준선을 놓고 접지선을 접지된 광학 테이블에 연결합니다.
4. 매핑을 위한 물리적 자극 및 SEP 기록
- 신경 신호 기록 소프트웨어를 엽니다.
- 녹음 소프트웨어 환경 설정: (1) SEP 및 노치 필터(60 또는 50Hz, 가정용 전력 주파수)의 s에 대한 samp링률 설정하여 전력선에서 노이즈를 제거합니다.
- 수염 매핑의 경우 가는 막대기로 수염을 구부립니다.
- 신체 매핑을 위해 나무 막대기로 앞발, 앞다리, 뒷발, 뒷다리 및 몸통을 끊임없이 찌릅니다.
- 표시된 시간 동안 데이터 수집 시스템에 신경 신호를 기록합니다.
5. 동물 안락사
- 모든 기록 절차가 끝나면 >5 % 이소 플루 란을 사용하여 마취로 쥐를 희생하고 자궁 경부 절제를 시행하십시오.
6. 피질 매핑을 위한 SEP 측정
- 신호 분석을 위해 MATLAB 코드명 read_Intan_RHS2000_file.m을 엽니다.
참고 : read_Intan_RHS2000_file.m은 "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software"에서 다운로드 할 수 있습니다. - 실행 버튼을 클릭하고 파일 이름 확장자가 ".rhs"인 녹음 파일을 선택한 다음 파일이 처리되고 읽힐 때까지 기다립니다.
- "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" 명령을 입력하여 기록 데이터의 2D 선 플롯을 생성하고, SEP를 찾고, 모든 채널에서 SEP의 진폭을 계산합니다.
참고: "채널 번호"에 채널 번호를 입력합니다. 예를 들어, "plot(t, amplifier_data(1,:))"은 채널 1의 2D 선 플롯을 만듭니다. 또한 실험자가 응답의 진폭을 계산할 때 각 채널에서 기록된 응답을 선택합니다. - SEP의 진폭에 따라 그리드를 다른 색조로 채색하여 데이터를 얻습니다.
참고: MATLAB 명령 "imagesc"를 사용하면 지형도를 더 빨리 얻을 수 있습니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 그래핀 다중 채널 어레이가 뇌 표면에 장착되는 방법을 설명합니다. 체성감각 지도는 물리적 자극에 대한 신경 반응을 획득하고 반응의 진폭을 계산하여 구성되었습니다. 그림 1 은 이 실험의 개략도를 보여줍니다.
도 2A 는 그래핀 전극 어레이의 구조적 특성을 나타낸다. 전극 사이에는 기판의 관통 구멍이 있습니다. 이 구멍은 전극이 피질 표면에 단단히 접촉하는 데 도움이 됩니다(그림 2B). 피질에 대한 전극의 강한 접착은 더 적은 노이즈로 신경 신호를 기록하는 데 도움이 됩니다.
그림 2C (왼쪽)는 다양한 색상으로 코딩된 수염, 몸통, 발 및 팔다리를 자극하여 얻은 위치 의존적 신경 반응을 보여줍니다. 쥐의 미니어처 몸인 쥐 호문클루스는 체성감각 피질 지도에 각 색상 크기의 실제 비율로 그려져 있습니다(그림 2C, 오른쪽).
그림 2D 는 각 신체 부위와 관련된 색상으로 자극별 반응을 나타냅니다. 반응은 피질 표면에 놓인 그래핀 전극 어레이를 통해 기록됩니다. 그래핀 어레이에서 기록된 데이터를 사용하여 SEP의 진폭을 계산하여 진폭 의존적 체성 감각 맵을 얻습니다.
감각 자극에 의해 유도된 국소 전위는 체성 감각 지도의 구성을 가능하게 합니다. 각 신체 자극에 대한 반응 크기는 설치류 호문클루스를 포즈합니다. 각 색상은 서로 다른 신체 부위를 나타냅니다(그림 3).
이 프로토콜을 사용하여 획득한 피질 지도는 수염, 앞발, 앞다리, 뒷발, 뒷다리 및 몸통에 반응하는 체성감각 피질 내의 특정 영역을 나타냅니다. 그것은 각 신체 부위에 대한 물리적 자극 정보를 처리하는 데 피질 영역이 관여하는 정도에 대한 통찰력을 제공합니다.
그림 1: 실험 설정의 개략도. 그래핀 기반 전극 어레이는 체성감각 피질에 부착되고 수염 또는 기타 신체 부위는 부드러운 터치로 자극됩니다. 굵은 빨간색 선은 케이블을 나타내고 가는 빨간색과 파란색 선은 접지선과 기준선을 나타냅니다. 검은 점은 브레그마를 나타냅니다. 데이터 수집 시스템은 USB를 통해 컴퓨터에 연결됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 피질 표면의 뇌 매핑을 위한 그래핀 기반 미세 전극 어레이. (A) 그래핀 기반 전극 어레이의 개략도. (B) 피질 표면의 그래핀 전극 어레이의 광학 이미지. (C) 쥐의 청각 및 체성 감각 피질. 각 신체 부위에 적용되는 다양한 주파수 톤과 물리적 자극으로 청각 자극에 반응하는 청각 및 체성 감각 영역의 두 지도. (D) 피질 표면에 그래핀 전극 어레이의 30채널(기준 및 접지 전극 제외) 기록. 상자 색상은 피질 표면의 지리적 위치와 관련이 있습니다. 이 수치는 Lee et al. (2021). 4이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 체성감각 지도. (A) 피질층에 걸친 신경 기록의 위치(왼쪽). 그래핀 전극 어레이를 사용하여 결정된 피질 표면 맵. 응답 진폭을 사용하여 구성되고 호문클루스와 겹쳐진 색상으로 구분된 체성 감각 지도(오른쪽). (B) 각 신체 부위의 자극에 따른 피질 SEP 및 지도를 기록했습니다. 이 그림은 Lee et al. (2021). 4이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 프로토콜은 그래핀 전극 어레이를 사용하여 쥐의 체성 감각 반응에 접근하고 매핑하는 방법을 설명하는 심층적인 단계별 프로세스를 제공합니다. 프로토콜 획득 데이터는 각 신체 부위에 시냅스적으로 연결된 체성 감각 정보를 제공하는 SEP입니다.
이 프로토콜의 여러 측면을 고려해야 합니다. 뇌부종을 예방하고 염증을 완화하기 위해 뇌척수액을 추출 할 때 실험자가 수조 마그나 앞에있는 뇌간을 손상시키지 않는 것이 중요합니다.
얼굴 수염은 어둡고 좁은 환경과 같은 주변 환경에 대한 촉각 감각 정보를 제공합니다. 따라서, 설치류 수염은 편향 방향, 자극 강도 및 자극된 수염의 위치를 통해 물체를 감지할 수 있을 만큼 충분히 발달되어 있습니다. 체성감각 피질은 각 수염의 굽힘 방향, 강도 및 위치에 다르게 반응한다18,19. 따라서 모든 수염은 이 프로토콜에서 일정한 강도와 방향으로 자극됩니다.
이 프로토콜은 그래핀 전극 어레이가 피질 표면에 장착되기 때문에 심부 뇌 구조에서 유발된 신호를 기록할 수 없습니다. 따라서 실험자는 원주 네트워크가 신경 반응과 관련하여 계층적으로 어떻게 구성되어 있는지 식별할 수 없습니다.
이 프로토콜은 그래핀 전극 어레이가 덜 침습적이고, 적응성이 있으며, 생체적합성이 낮기 때문에 이전의 기록 방법보다 우수하다(12,13,14,15,16). 또한, 그래핀 전극 어레이는 신호를 기록하기 위한 >30개의 채널을 가지고 있어 단일 또는 사극 전극보다 더 빠른 피질 매핑을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 필요할 때마다 다른 피질 영역에 추가로 적용될 수 있습니다 15,20. 실험자는 청각 또는 시각 피질에 전극 어레이를 배치하여 청각 또는 시각 지도와 같은 청각 및 시각 정보를 추출할 수 있습니다. 마지막으로, 이 방법은 뇌졸중, 간질, 이명 및 파킨슨병과 같은 신경 질환의 만성 이식 및 진단을 위해 구현될 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 양성구를 위해 인천대학교(국제협동조합)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| 3mL syringe | KOREAVACCINE CORPORATION | injecting the drug for anesthesia | |
| Bone rongeur | Fine Science Tools | 16220-14 | remove the skull |
| connector | Gbrain | Connect graphene electrode to headstage | |
| drill | FALCON tool | grind the skull | |
| drill bits | Osstem implant | grind the skull | |
| Graefe iris forceps slightly curved serrated | vubu | vudu-02-73010 | remove the tissue from the skull or hold wiper |
| graphene multielectrode array | Gbrain | records signals from neuron | |
| isoflurane | Hana Pharm Corporation | sacrifce the subject | |
| ketamine | yuhan corporation | used for anesthesia | |
| lidocaine(2%) | Daihan pharmaceutical | local anesthetic | |
| Matlab R2021b | Mathworks | Data analysis Software | |
| mosquito hemostats | Fine Science Tools | 91309-12 | fasten the scalp |
| ointment | Alcon | prevent eye from drying out | |
| povidone | Green Pharmaceutical corporation | disinfect the incision area | |
| RHS 32ch Stim/Record headstage | intan technologies | M4032 | connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip |
| RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable | intan technologies | M3206 | connect graphene electrode to headstage |
| RHS Stim/Recording controller software | intan technologies | Data Acquisition Software | |
| RHS stimulation/ Recording controller | intan technologies | M4200 | |
| saline | JW Pharmaceutical | ||
| scalpel | Hammacher | HSB 805-03 | |
| stereotaxic instrument | stoelting | fasten the subject | |
| sterile Hypodermic Needle | KOREAVACCINE CORPORATION | remove the dura mater | |
| Steven Iris Tissue Forceps | KASCO | 50-2026 | remove the dura mater |
| surgical blade no.11 | FEATHER | inscise the scalp | |
| surgical sicssors | Fine Science Tools | 14090-09 | inscise the scalp and remove the dura mater |
| wooden stick | whisker stimulation | ||
| xylazine | Bayer Korea | used for anesthesia |
References
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